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1、蛋白质等电点的测定本讲稿第一页，共二十页主要内容主要内容(1)了解蛋白质的两性解离性质。(2)学习测定蛋白质等电点的方法。本讲稿第二页，共二十页蛋白质的解离性质蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡：本讲稿第三页，共二十页蛋白质的等电点蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。本讲稿第四页，共二十页最常用的方法是：测其溶解
2、度最低时的溶液pH值。等电聚焦电泳测其净电荷为零时的PH浊度、分光光度法基于蛋白质与离子交换的作用本讲稿第五页，共二十页一、测定溶解度最低时的溶液PH实验原理：借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与酷酸钠(醋酸钠混合在酪蛋白溶液中)配制成各种不同pH值的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。本讲稿第六页，共二十页器材：器材：水浴锅、温度计、200毫升锥形瓶、100毫升容量瓶、吸管、试管、试管架、乳钵试剂：试剂：(1)0.4酪蛋白醋酸钠溶液 (2)1.00摩尔升醋酸溶液 (3)0.10摩尔升醋酸溶液(4)0.01摩尔升醋酸溶液
3、实验器材与试剂：本讲稿第七页，共二十页实验步骤：(1)取同样规格的试营4支，按下表颠序分别精确地加入各试剂，然后混匀。试管号 蒸馏水（ml）0.01M醋酸（ml）0.1M醋酸（ml）1M醋酸（ml）18.40.628.70.338.01.047.41.6本讲稿第八页，共二十页(2)向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1毫升，加一管，摇句一管。此时1、2、3、4管的pH值依次为5.9、5.3、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊的一管的pH即为酪蛋白的等电点。本讲稿第九页，共二十页二、等电聚焦电泳原理：1）有一类两性电解质：它具有依次递变而又相差不大的等电点，在电场
4、下形成递变而又连续的pH梯度，故在电泳介质中加入这种物质则能造成介质pH由酸到碱逐步变化。本讲稿第十页，共二十页2)各种蛋白质pI不同3）两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的连续而稳定的pH梯度 以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持介质，并在凝胶中加入两性电解质载体，在电场作用下，蛋白质在此pH梯度的凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。本讲稿第十一页，共二十页三、实验试剂与仪器1）两性电解质2）30丙烯酰胺溶液3）TEMED4）10过硫酸铵溶液5）负极缓冲液：0.1M NaOH6)正极缓冲液：0.1M 磷酸或硫酸7)固定液：10（W/V）
5、三氯乙酸8)染色液9)脱色液10)蛋白质等电点标准11)电泳仪12)圆盘电泳槽本讲稿第十二页，共二十页图 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)本讲稿第十三页，共二十页四、操作方法四、操作方法1.凝胶柱的制备（1）玻璃管的一端插在橡皮帽中（2）配胶表 10mL 7.5%凝胶的配制试 剂 名 称 体积(mL)凝胶贮液 2.5两性电解质载体 0.5蒸馏水 6.7510%过硫酸铵 0.0510%TEMED 0.1蛋白质混合样品 0.1混匀后置真空干燥器中抽气 10 min 本讲稿第十四页，共二十页（3）将配好的凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好的玻管中，至离上端1 cm处，再用注射器缓缓
6、加水3-5 mm高。（4）待凝胶聚合2.电泳将装有胶的玻管固定到电泳槽上槽的洞中（安装时要保证凝胶管垂直且橡胶塞孔密封不漏）在上槽中装入0.1mol/L氢氧化钠溶液，在下槽中加入0.1mol/L磷酸缓冲液。连接到电泳仪，接通电源，调电压至160 V，聚焦过夜，至电流降为0，则可关闭电源。本讲稿第十五页，共二十页3剥胶 电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水洗净两端电极液，在凝胶条的正极端作上标记。用灌满水的注射器长针头插入凝胶与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管，推针前进，同时注入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，凝胶条即可流出。4.固定染色取出凝胶条放在一块洁净的玻板上，用尺量出固定前
7、的凝胶条长度。放入带盖试管中加入固定液。固定20min2后，倒掉固定液后用脱色液漂洗2次，再染色1h，用蒸馏水漂洗数次后用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，量出蛋白带距正极端的距离。本讲稿第十六页，共二十页5.蛋白质条带聚焦位置的计算 求出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度为：蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离 固定染色前凝胶条长度 固定染色后凝胶条长度 本讲稿第十七页，共二十页三、浊度、分光光度法溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，静电荷为0，当溶液pH值大于蛋白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带负电荷。反之，溶液的pH值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷。溶液的pH值距蛋白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。反之则越少。本讲稿第十八页，共二十页本讲稿第十九页，共二十页本讲稿第二十页，共二十页