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1、实验一 光学显微镜及其使用A第1页，共17页，编辑于2022年，星期五周次周次实验实验名称名称学学时时数数6 6光学光学显显微微镜镜构造和使用构造和使用3 37 7叶叶绿绿体的体的荧荧光光观观察察3 38 8线线粒体和液泡系的超活染色与粒体和液泡系的超活染色与观观察察3 39 9红细红细胞凝集反胞凝集反应应和和细细胞膜渗透性胞膜渗透性3 31010巨噬巨噬细细胞吞噬胞吞噬现现象象观观察察3 31111蟾蜍骨髓蟾蜍骨髓细细胞染色体胞染色体标标本制作本制作3 3本学期细胞生物学实验开设项目和时间安排本学期细胞生物学实验开设项目和时间安排第2页，共17页，编辑于2022年，星期五实验一实验一 光学显
2、微镜构造和使用光学显微镜构造和使用一、实验目的一、实验目的1 了解和掌握普通光镜、暗视场显微了解和掌握普通光镜、暗视场显微镜、相差、荧光、微分干涉差、倒置等镜、相差、荧光、微分干涉差、倒置等显微镜的原理和使用方法。同时简单介显微镜的原理和使用方法。同时简单介绍电镜原理。绍电镜原理。2 了解掌握光学显微镜的光路合轴方法，了解掌握光学显微镜的光路合轴方法，了解显微摄影的基本操作。了解显微摄影的基本操作。第3页，共17页，编辑于2022年，星期五二、原理和方法二、原理和方法一）普通光学显微镜一）普通光学显微镜1 普通明场光学显微镜各零部件构成：镜座、普通明场光学显微镜各零部件构成：镜座、柱、筒、臂、
3、转换器、载物台、调节器、光柱、筒、臂、转换器、载物台、调节器、光源及光源聚光镜，视场光阑、孔径光阑、镜源及光源聚光镜，视场光阑、孔径光阑、镜台下聚光器、聚光器前透镜、物镜和目镜。台下聚光器、聚光器前透镜、物镜和目镜。2 物镜的种类：消色差物镜、复消色差物镜、物镜的种类：消色差物镜、复消色差物镜、平场物镜。平场物镜。3 显微镜的光路原理（略）显微镜的光路原理（略）光源色光光源色光视场光阑视场光阑折射折射孔径光阑孔径光阑聚光聚光镜镜样品在物镜后焦平面成像样品在物镜后焦平面成像目镜观察目镜观察第4页，共17页，编辑于2022年，星期五4 显微性能参数显微性能参数显微镜的性能参数包括分辨率、放大率，焦
4、点深度、视显微镜的性能参数包括分辨率、放大率，焦点深度、视场宽度等。场宽度等。1）分辨率：）分辨率：R=0.61/N.A.；N.A.sin/2式中：式中：n=介质折射率；介质折射率；=孔径角（镜口角，物镜最边缘斜孔径角（镜口角，物镜最边缘斜光线与显微镜光轴所成的交角），光线与显微镜光轴所成的交角），N.A.=数值孔径（镜口数值孔径（镜口率，率，numeric aperture）。镜口角总是要小于）。镜口角总是要小于180，所，所以以sina/2的最大值必然小于的最大值必然小于1。2）显微镜总放大率（）显微镜总放大率（Mt）=物镜放大率物镜放大率目镜放大率目镜放大率摄影透摄影透镜放大率；镜放大率
5、；有效放大率有效放大率=物镜数值孔径的物镜数值孔径的500-1000倍，故需根据物倍，故需根据物镜选配适宜的目镜。镜选配适宜的目镜。第5页，共17页，编辑于2022年，星期五5 显微镜的使用显微镜的使用1）光路合轴：镜检与摄影前，使照明光线与）光路合轴：镜检与摄影前，使照明光线与显微镜光轴合一即为光路合轴，整个过程显微镜光轴合一即为光路合轴，整个过程涉及到聚光器调中和光源灯丝调中两部分，涉及到聚光器调中和光源灯丝调中两部分，详细过程参阅教材。详细过程参阅教材。2）光阑的调节：视场光阑用于控制照明光）光阑的调节：视场光阑用于控制照明光束可以限定视场大小；孔径光阑用于限定束可以限定视场大小；孔径光
6、阑用于限定聚光器孔径大小。调节时以视场光阑内缘聚光器孔径大小。调节时以视场光阑内缘外切孔径光阑为基准。外切孔径光阑为基准。第6页，共17页，编辑于2022年，星期五二）暗视野显微镜二）暗视野显微镜特殊部件：特殊部件：暗视野聚光器暗视野聚光器/暗视野光挡暗视野光挡1 由于聚光器构造的特殊性，导致直射光由于聚光器构造的特殊性，导致直射光线不能进入视野，此时视野黑暗。光线斜线不能进入视野，此时视野黑暗。光线斜向照射时，样品产生散射光，一部分散射向照射时，样品产生散射光，一部分散射光线可以进入视野，在黑暗视野中样品边光线可以进入视野，在黑暗视野中样品边缘明亮。缘明亮。2 暗视野光档：光挡直径取决于物镜
7、数值暗视野光档：光挡直径取决于物镜数值孔径，光挡恰好能挡住物镜通光孔径。另孔径，光挡恰好能挡住物镜通光孔径。另一个问题是暗视场聚光器的调中。一个问题是暗视场聚光器的调中。第7页，共17页，编辑于2022年，星期五暗暗视视野野照照明明方方式式 第8页，共17页，编辑于2022年，星期五三）相差显微镜三）相差显微镜部件构成：部件构成：环状光阑，相差物镜环状光阑，相差物镜1这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。光线经环状光阑投射样品的直射光和衍射光透过细胞。光线经环状光阑投射样品的直射光和衍射光透过物镜相差板时，把透过标本的可见光的光程
8、差变成振幅物镜相差板时，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了路，同时被延迟了1/4（波长），如果再增加或减少（波长），如果再增加或减少1/4，则光程差变为，则光程差变为1/2，两束光合轴后相互干涉加强，两束光合轴后相互干涉加强，振幅增大或减小，提高反差，造成不同的反差效果。振幅增大或减小，提高反差，造成不同的反差效果。2 聚光器调中，需要借助调中望远镜调中。聚光器调中，需要借助调中望远镜调中
9、。第9页，共17页，编辑于2022年，星期五四）微分干涉差显微镜四）微分干涉差显微镜部件构成：部件构成：起偏器起偏器+DIC棱镜棱镜+DIC滑行器滑行器+检偏器检偏器偏振器装在聚光器的前面，使光线发生线性偏振，聚光器前的偏振器装在聚光器的前面，使光线发生线性偏振，聚光器前的DIC棱镜可将一束光分解成偏振方向不同的两束光（棱镜可将一束光分解成偏振方向不同的两束光（x和和y），），二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致，在穿过标本相邻的区域后，由于方向。最初两束光相位一致，在穿过标本相邻的区域后，由于标本
10、的厚度和折射率不同，两束光产生了光程差。在物镜的后标本的厚度和折射率不同，两束光产生了光程差。在物镜的后焦面处安装了第二个焦面处安装了第二个DIC棱镜，即棱镜，即DIC滑行器，它把两束光波滑行器，它把两束光波合并成一束。这时两束光的偏振面（合并成一束。这时两束光的偏振面（x和和y）仍然存在。最后光）仍然存在。最后光束穿过第二个偏振装置，即检偏器，检偏器与起偏器的方向成束穿过第二个偏振装置，即检偏器，检偏器与起偏器的方向成直角。检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束直角。检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光，从而使二者发生干涉。于是在灰色的背景上，标本结构呈光，从而使二者
11、发生干涉。于是在灰色的背景上，标本结构呈现出亮暗差，成像效果有浮雕立体感。为了使影像的反差达到现出亮暗差，成像效果有浮雕立体感。为了使影像的反差达到最佳状态，可通过调节最佳状态，可通过调节DIC滑行器的纵行微调来改变光程差，滑行器的纵行微调来改变光程差，改变影像的亮度，使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象，改变影像的亮度，使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象，三维立体感明显。三维立体感明显。第10页，共17页，编辑于2022年，星期五DIC显显微微镜镜下下的的硅硅藻藻 第11页，共17页，编辑于2022年，星期五五）偏光显微镜五）偏光显微镜部件构成：部件构成：起偏器起偏器+检偏器检偏器偏光
12、显微镜用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、偏光显微镜用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等等。和普通显微镜不同的是：纺锤体、胶原、染色体等等。和普通显微镜不同的是：其光源前有起偏器，使进入显微镜的光线为偏振光，其光源前有起偏器，使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器。检偏器偏振方向与起偏器垂直时则镜筒中有检偏器。检偏器偏振方向与起偏器垂直时则为正交偏光镜，这种显微镜的载物台一般是可以旋转为正交偏光镜，这种显微镜的载物台一般是可以旋转的，当载物台上放入单折射的物质时，无论如何旋转的，当载物台上放入单折射的物质时，无论如何旋转载物台，由于两个偏振片是垂直的，显微镜里看不
13、到载物台，由于两个偏振片是垂直的，显微镜里看不到光线，而放入双折射性物质时，由于光线通过这类物光线，而放入双折射性物质时，由于光线通过这类物质时发生偏转，因此旋转载物台便能检测到这种物体。质时发生偏转，因此旋转载物台便能检测到这种物体。第12页，共17页，编辑于2022年，星期五第13页，共17页，编辑于2022年，星期五六）荧光显微镜六）荧光显微镜1 短波光照射样品导致荧光分子被激发，短波光照射样品导致荧光分子被激发，分子能级跃迁，以光子的形式释放能量。分子能级跃迁，以光子的形式释放能量。2 光源：光源：高压汞灯高压汞灯，使用时需要预热十五，使用时需要预热十五分钟，断电后十分钟内不能重启。分
14、钟，断电后十分钟内不能重启。3 滤色镜滤色镜：包括激发光滤镜和阻断滤镜。：包括激发光滤镜和阻断滤镜。4 汞灯使用前需聚焦调中。汞灯使用前需聚焦调中。第14页，共17页，编辑于2022年，星期五七）倒置显微镜七）倒置显微镜光源在上，物镜在下，光路设计与普通显微镜正好相光源在上，物镜在下，光路设计与普通显微镜正好相反，经常用于观察反，经常用于观察工作距离较大工作距离较大的样品，如观察培养的样品，如观察培养的活细胞。的活细胞。八)电子显微镜电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样，所不同的电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样，所不同的是用是用电子束作照明源，用电磁场作透镜电子束作照明源，用电磁场作透镜，放大倍数最高，放大倍数最高可达近百万倍。另外，由于电子束的穿透力很弱，因此可达近百万倍。另外，由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制成厚度约用于电镜的标本须制成厚度约50nm左右的超薄切片。左右的超薄切片。第15页，共17页，编辑于2022年，星期五第16页，共17页，编辑于2022年，星期五透透射射电电子子显显微微镜镜 第17页，共17页，编辑于2022年，星期五