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1、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数第1页，共18页，编辑于2022年，星期五一一.研究思路研究思路.筛选菌株：筛选菌株：实验室中微生物的筛选原理：实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于人为提供有利于目的菌株生长的条件目的菌株生长的条件(包括营养、温度、包括营养、温度、pHpH等等)，同时，同时抑制或阻止其他微生物生长。抑制或阻止其他微生物生长。要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养分，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养分离的方法，或抑制使大多数微生物不能生长，或造离的方法，或抑制使大多数微生物不能生长，或
2、造成有利于该菌生长的环境，经过一定时间培养后使成有利于该菌生长的环境，经过一定时间培养后使该菌在群落中的数量上升，再通过平板稀释等方法该菌在群落中的数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯培养分离。对它进行纯培养分离。第2页，共18页，编辑于2022年，星期五.统计菌落数目：统计菌落数目：1.1.直接计数法：直接计数法：这种方法是利用特定这种方法是利用特定细菌计数板或血细菌计数板或血细胞计数板细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。数量。此法的缺点是不能区分死菌和活菌。此法的缺点是不能区分死菌和活菌。每毫升原液所含细菌数每毫升原液所含细菌
3、数每毫升原液所含细菌数每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数每小格平均细菌数每小格平均细菌数每小格平均细菌数40010000400100004001000040010000稀释倍数稀释倍数稀释倍数稀释倍数第3页，共18页，编辑于2022年，星期五2.2.间接计数法间接计数法(活菌计数法活菌计数法)：原理：原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。个菌落代表原先的一个单细胞。常用方法：常用方法：稀释涂布平板法。稀释涂布平板法。注意事项注意事
4、项每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(CV)M(CV)M其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，落数，V V代表涂布平板时所用的稀释液的体积代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。第4页，共18页，编辑于2022年，星期五注意事项注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030030300的的平板上进行计数。平板上进行计数。为使结果接近真实值可将为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落
5、平均数。，经涂布，培养计算出菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。这是因为这是因为两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。是活菌数来表示。涂布平板法所选择倒平板的稀释度很重要，一般涂布平板法所选择倒平板的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度倒平板所出现的平以三个稀释度中的第二个稀释度倒平板所出现的平均菌落数在均菌落数在5050个左右为最好。个左右为最好。第5页，共18页，编辑于2022年，星期五 除上
6、述两种常用的计数方法外，还有除上述两种常用的计数方法外，还有膜过滤法、膜过滤法、比浊法比浊法。膜过滤法是当样品中菌数很低时，可以。膜过滤法是当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色，并经处理使膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色，并经处理使膜透明，再在显微镜下计算膜上透明，再在显微镜下计算膜上(或一定面积中或一定面积中)的的细菌数；比浊法原理是在一定范围内，菌的悬液细菌数；比浊法原理是在一定范围内，菌的悬液中细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，中细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌越多，光密
7、度越大。因此可以借助于分光光度菌越多，光密度越大。因此可以借助于分光光度计，在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光计，在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度表示菌量。实验测量时一定要控制在菌浓度密度表示菌量。实验测量时一定要控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确。微与光密度成正比的线性范围内，否则不准确。微生物计数法，发展迅速，现有多种多样的快速、生物计数法，发展迅速，现有多种多样的快速、简易、自动化的仪器和装置等方法。简易、自动化的仪器和装置等方法。第6页，共18页，编辑于2022年，星期五.设置对照：设置对照：对照实验是指除了被测试条件以外，其他条件都对照实验是指除了被测试
8、条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照实验组，排除任何其相同的实验，其作用是比照实验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试和条件引他可能原因的干扰，证明确实是所测试和条件引起相应的结果。起相应的结果。设置对照的主要目的是排除实验组设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。可信度。P22P22旁栏思考题旁栏思考题想一想，如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落想一想，如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？数？答：答：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计统计某一稀释度下平板上的菌落数
9、，最好能统计3 3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算。的公式进行计算。第7页，共18页，编辑于2022年，星期五 P23P23讨论问题讨论问题 A A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。一是由于土样不同，二是由于培养基污染两种。一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。究竟是哪个原因，可以通过实验来或操作失误。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。证明。实验方案有两种。一种方案是可以由其他同实验方案有两种。一种方案是可以由其他同学用与学用与A A同学一样的土样进行实验，
10、同学一样的土样进行实验，如果结果与如果结果与A A同同学一致，则证明学一致，则证明A A无误；如果结果不同，则证明无误；如果结果不同，则证明A A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。同学存在操作失误或培养基的配制有问题。另一另一种方案是将种方案是将A A同学配制的培养基在不加土样的情况下同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受以证明培养基是否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结果要到污染。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。有说服力，对照的设置是必不可少的。第8页，共18页，编辑于2022年，星期五二
11、二.实验的具体操作实验的具体操作 .土壤取样土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。灭菌。.制备培养基：制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的制备以尿素为唯一氮源的选择培养基选择培养基。第9页，共18页，编辑于2022年，星期五.样品的稀释：样品的稀释：应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g。将称好的土样倒入盛有。将称好的土样倒入盛有90mL90mL无
12、菌无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。水的锥形瓶中，塞好棉塞。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度，其原因是不同微，其原因是不同微生物在土壤中含量不同，其目的是保证获得菌落数在生物在土壤中含量不同，其目的是保证获得菌落数在3030300300之之间、适于计数的平板。间、适于计数的平板。细菌稀释度为细菌稀释度为10104 4、10105 5、10106 6，放线菌稀，放线菌稀释度为释度为10103 3、10104 4、10105 5，真菌稀释度为，真菌稀释度为10102 2、101
13、03 3、10104 4。第10页，共18页，编辑于2022年，星期五P24P24旁栏思考题：旁栏思考题：为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？菌的数量，选用的稀释范围相同吗？答：答：这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株株/kg/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为21852185万，放
14、线万，放线菌数约为菌数约为477477万，霉菌数约为万，霉菌数约为23.123.1万。因此，为万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。的条件。第11页，共18页，编辑于2022年，星期五.取样涂布取样涂布实验时要实验时要对培养皿作对培养皿作好标记。注好标记。注明培养基类明培养基类型、培养时型、培养时间、稀释度、间、稀释度、培养物等。培养物等。如果得到了如果得到了2 2个或个或2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在3030030300的平的平板，则说
15、明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确试验不精确，需要重新实验。，需要重新实验。，需要重新实验。，需要重新实验。第12页，共18页，编辑于2022年，星期五.微生物的培养与观察微生物的培养与观察 在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取选取菌落数目稳定时的记录作为结果，菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。间不足而导致遗漏菌落的数目。为了提高
16、效率，在操作时更加有条不紊，应当事先为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当事先规划时间。规划时间。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌一培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌一般在般在30303737培养培养1 12d2d，放线菌一般在，放线菌一般在25252828培养培养5 57d7d，霉菌一般在，霉菌一般在25252828的温度下培养的温度下培养3 34d4d。第13页，共18页，编辑于2022年，星期五思考与讨论思考与讨论在微生物培养过程中，为什么每隔在微生物培养过程中，为什么每隔24h24h统计一次统计一次菌落数目？菌种鉴定的依据是什么？菌落数目？菌种鉴定的依据是什么？答：答：
17、不同种类的微生物，往往需不同的培养温不同种类的微生物，往往需不同的培养温度和培养时间，每隔度和培养时间，每隔24h24h统计统计1 1次菌落数目，选次菌落数目，选取菌落数目稳定时记录作为结果，这样可以防取菌落数目稳定时记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。不止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。不同种类的细菌形成的菌落，在大小、形状、光同种类的细菌形成的菌落，在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一度的泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一度的特征，菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据。特征，菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据。第14页，共18页，编辑于2022年，
18、星期五三三.结果分析与评价结果分析与评价1.1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。素的微生物。2.2.提示：选择每个平板上长有提示：选择每个平板上长有3030030300个个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。第1
19、5页，共18页，编辑于2022年，星期五四四.课外延伸课外延伸 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PHPH升升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素尿素。测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到过滤器过滤后，将滤膜放到过滤器过滤后，将滤膜放到过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝伊红美蓝
20、伊红美蓝伊红美蓝 培养基上培养，大培养基上培养，大培养基上培养，大培养基上培养，大肠杆菌肠杆菌肠杆菌肠杆菌菌落呈现黑色菌落呈现黑色菌落呈现黑色菌落呈现黑色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。第16页，共18页，编辑于2022年，星期五1.1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（）A.A.在液体培养基上进行在液体培养基上进行 B.B.至少接种一种细菌至少接种一种细菌 C.C.接种一个细菌接种一个细菌 D.D.及时补充消耗的营养物质及时补充消耗的营养物
21、质 2.2.使用选择培养基的目的是（使用选择培养基的目的是（）A.A.培养细菌培养细菌 B.B.培养真菌培养真菌 C.C.使需要的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁殖 D.D.表现某微生物的特定性状，与其他微生物加以区别表现某微生物的特定性状，与其他微生物加以区别3.3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是()()A.CO A.CO2 2和和N N2 2 B.B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.CO C.CO2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素实践训练实践训练A A C CD D第17页，共18页，编辑于2022年，星期五4.
22、4.下列说法不正确的是（下列说法不正确的是（）A.A.科学家从科学家从70708080度热泉中分离到耐高温的度热泉中分离到耐高温的TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶 B.B.统计某一稀释度的统计某一稀释度的5 5个平板的菌落数依次为个平板的菌落数依次为M1M1、M2M2、M3M3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作为该样品菌落数的估计值作为该样品菌落数的估计值 C.C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。类最多。5.5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）入（）A.A.较多的氮源物质较多的氮源物质 B.B.较多的碳源物质较多的碳源物质 C.C.青霉素类药物青霉素类药物 D.D.高浓度食盐高浓度食盐B BC C第18页，共18页，编辑于2022年，星期五