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1、糖尿病肾病分期标准5期 糖肾号对早期糖尿病肾病大鼠的干预及对P27表达的影响 摘要 目的:视察糖肾号方对早期糖尿病肾病大鼠的干预作用及对周期蛋白P27表达的影响,分析其可能的作用机制。方法:通过单侧肾切除合并注射链脲佐菌素(STZ)建立早期糖尿病肾病大鼠模型,随机分为假手术组(SO)、模型比照组(M)、糖肾号组(TS)、洛汀新组(B)、糖洛合组(TS+B),共5组,各10只。模型胜利后赐予不同的干预,共8周,末次给药12小时后,采集尿液、血液标本检测,组织行免疫组化检测,视察各组大鼠的肾重、肾脏肥大指数、肌酐,尿素氮等生化指标及P27蛋白表达的改变。结果:与模型组比较,糖肾号治疗组肾重、肾脏肥
2、大指数明显下降,血清Scr、BUN显著降低,P27表达明显下调(P比照组的50%作为DN大鼠成模标准。 2.2 分组及给药方法:成模后随机分为:模型比照组(M)、糖肾号组(TS)、洛汀新组(B)、糖肾号+盐酸贝那普利治疗组(TS+B)加假手术组(SO)共5组,每组10只。大鼠给药剂量根据人与动物体表面积法4换算。大鼠药量•kg-1•d-1等于成人量•kg-1•d-1的6.25倍。糖肾号组:以相当于生药27.08g-1•kg-1•d-1液体量,每日灌胃1次;洛汀新组:研细末,以相当于干药18.75mg•kg-1&
3、#8226;d-1粉末,溶于蒸镏水中,每日灌胃1次;假手术组及模型比照组:赐予等量生理盐水。连续给药共8周。试验期间动物自由进食、饮水,不运用胰岛素及其他降糖药物。 2.3 观测指标及方法:分述如下。 2.3.1 尿微量白蛋白和2-微球蛋白测定:代谢笼中收集24h尿液标本,采纳酶联免疫吸附法(ELISA)检测。 2.3.2 肾重及肾指数:麻醉后,无菌操作取右肾,去掉被膜,滤纸吸干血迹后称重,并且计算肾指数(肾重/体重)。 2.3.3 肾功能:酶法及苦味酸法测定Scr、BUN。 2.3.4 免疫组化法检测P27:右侧肾脏,沿矢状正中线切开,取1/2肾脏中一小块皮质置入4%多聚甲醛固定液中,以备组
4、织行免疫组化染色视察。免疫组化操作方法:右蜡切片常规脱蜡至水;0.1mol/L枸橼酸缓冲液高压锅抗原修复;3%H2O2室温封闭20min,蒸馏水冲洗;PBS洗,滴加封闭液,3720min;滴加1100稀释的兔抗大鼠多克隆P27抗体(武汉博士德生物工程有限公司产品)单抗4过夜;PBS洗,滴加非生物素标记的二抗,3730min;PBS洗,PBS洗,DAB显色;苏木素复染;常规酒精脱水;二甲苯透亮;中性树胶封片。PBS代替一抗作阴性比照。 2.4 统计学处理:数据以均数标准差(xs)表示,采纳SPSS13.0统计软件进行统计分析。多个样本均数的比较采纳单因素方差分析(One-way ANOVA),两
5、两比较采纳最小显著差法(LSD)。检验水准设为=0.05,P0.05)。见表1 表1 各组大鼠2-MG、UAlb的比较(xs) 组别例数(只)2-MG(ug/24h)UAlb(ug/24h) SO组10119.2466.363.992.30 M组10728.56146.619.712.69 TS组10546.55179.205.693.01 B组10534.59147.705.632.05 TS+B组10442.41124.745.624.03 注:SO为假手术组,M为模型比照组,TS为糖肾号组,B为洛汀新组,TS+B为糖洛合组,下同。 3.2 各组大鼠右肾重、肾重指数(肾重/体重)的状况:与
6、假手术组比较,模型比照组和治疗组肾重、肾脏肥大指数均显著增高(P0.05)。见表2。 表2 各组大鼠肾重、肾脏肥大指数的比较(xs) 组别例数(只)肾重(g)肾脏肥大指数(10-3) SO组101.500.132.930.35 M组102.690.169.961.54 TS组102.630.267.670.92 B组102.520.347.911.71 TS+B组102.420.216.880.82 3.3 各组大鼠BUN、Scr的状况:与假手术组比较,模型比照组和治疗组Scr、BUN均显著增高(P0.05);各治疗组间比较,Scr、BUN差异无统计学意义(P0.05)。见表3。 表3 各组大
7、鼠Scr、BUN的比较(xs) 组别例数(只)Scr(umol/l)BUN(mmol/l) SO组1028.803.337.410.97 M组1055.905.2015.012.00 TS组1044.605.9312.972.01 B组1044.805.1013.781.61 TS+B组1043.604.0312.511.50 3.4 各组大鼠肾脏组织P27表达的状况:免疫组化方法染色后,将所制切片在光学显微镜低倍镜下视察细细胞核/胞浆呈现明确的棕黄色颗粒状染色为阳性细胞,细胞核蓝染的细胞为苏木素复染的阴性细胞。在1020倍高倍镜下,每张标本随机选择5个视野,然后取平均值。免疫组化染色结果实行半定量评分:按染色区改变和染色强度分为04分,即0分为无染色或染色极弱;1分为局部弱染、染色区75%。 P27在细胞核和胞浆中均有表达,呈棕褐色;假手术组P27表达均较少,模型比照组呈强阳性表达,大量细胞核/浆呈棕褐色颗粒状,着色较深,各治疗组表达较少。与假手术组比较,模型比照组和治疗组P27均具有显著性差异(P