食品安全学实验指导.doc

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1、食品安全学实验指导 宁 喜 斌2007年4月5随着生活水平的提高，消费者对食品安全问题越来越重视。社会对食品安全的专门人才数量和质量都在增加，在此背景下国内许多高校都成立了食品质量与安全专业。食品安全学作为该专业的一们核心课程，不但要求学生掌握坚实的食品安全理论知识，也要求学生具备扎实的实践技能，因此，我们组织了相关人员编写这本实验指导，供同学们参考。本实验指导由宁喜斌，丛健，张慧，窦勇，王璐华完成。鉴于水平有限，以及时间较紧，书中的错误不可避免，希望使用者能够给予批评指正，以便我们能够及时进行修正。 编 者 2007年4月5实验一 食品中金黄色葡萄球菌的检验实验二 食品中沙门氏菌的检验实验三

2、 酶联免疫吸附试验（ELISA）实验四 PCR技术快速检测副溶血弧菌实验五 3M大肠杆菌和大肠菌群快速检验实验六 对硫磷在苹果中残留的分析方法实验七 食品中药残的快速检测5实验一 食品中金黄色葡萄球菌的检验一、 实验目的学习食品中金黄色葡萄球菌的基本检验方法。二、 基本原理葡萄球菌在自然界分布极广，空气、土壤、水、饲料、食品(剩饭、糕点、牛奶、肉品等)以及人和动物的体表粘膜等处均有存在，大部分是不致病，也有一些致病的球菌。金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属一个种。可引起皮肤组织炎症，还能产生肠毒素。如果在食品中大量生长繁殖，产生毒素，人误食了含有毒素的食品，就会发生食物中毒，故食品中存在金黄色葡萄球菌

3、对人的健康是一种潜在危险，检查食品中金黄色葡萄球菌及数量具有实际意义。 金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆凝固，多数致病菌株能产生溶血毒素，使血琼脂平板菌落周围出现溶血环，在试管中出现溶血反应。这些是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。三、 设备和材料实验器材：显微镜、恒温培养箱（37）、冰箱、移液管（1mL、5 mL 、10mL）、试管（15150mm）、锥形瓶（250mL、100mL）、培养皿、L型涂布棒、酒精灯、接种环、试管架、试管篓、灭菌锅、小试管（350mm）实验材料：污染牛奶等。四、 培养基和试剂胰酪胨大豆肉汤、血琼脂平板、BairdPrker琼脂平板、营养肉汤、0.85灭菌生理盐

4、水、兔血浆、革兰氏染色剂五、 操作步骤1. 检样处理：吸取25mL液体样品，加入225mL灭菌生理盐水，置均质器中制成混悬液。2. 增菌培养1) 增菌及分离培养：吸取5mL上述混悬液，接种于胰酪胨大豆肉汤50mL培养基内，置361温箱培养24h，转种血平板和BairdParker平板，361培养24h，挑取金黄色葡萄球菌菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。2) 形态观察：本菌为革兰氏阳性球菌，排列是葡萄球状，无芽胞，无荚膜，致病性葡萄球菌菌体较小，直径约为0.51m。 在肉汤中呈混浊生长，在胰酪陈大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈混浊生长，血平板上菌落呈金黄色，也有时为白色，大而突起、圆形

5、、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。在BairdParker平板上为圆形、光滑凸起、湿润、直径为23mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。3) 血浆凝固酶实验吸取14新鲜兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物0.5mL，振荡摇匀，放361温箱内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性结果。同时以已知阳性

6、和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。3. 直接计数方法1) 吸取上述1：10混悬液，进行5倍递次稀释，根据样品污染情况，选择不同浓度的稀释液1mL，分别加入三块BairdParker平板，每个平板接种量分别为0.3mL、0.3mL、0.4mL，然后用灭菌L棒涂布整个平板。如水分不多吸收，可将平板放在361温箱1h，等水分蒸发后反转平皿置361温箱培养。2) 在三个平板上点数周围有混浊带的黑色菌落，并从中任选1个菌落，接种血琼脂平板，36124h培养后进行染色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培养法。3) 菌落计数：将三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加，乘以血浆凝固酶阳性数，除以5，再乘以稀释

7、倍数，即可求出每克样品中金黄色葡萄球菌数。六、 实验报告1鉴别牛奶中是否含有金黄色葡萄球菌。2对牛奶中含有的金黄色葡萄球菌进行计数。5实验二 食品中沙门氏菌的检验一、 实验目的学习食品中沙门氏菌的基本检测方法。二、 基本原理沙门氏菌为肠杆菌科沙门氏菌属细菌，广泛分布于自然界，是人畜共患的肠道病原菌，常引起伤寒、肠炎、肠热症和食物中毒，危害人类健康。沙门氏菌可通过人类、畜、禽的粪便或带菌者直接或间接污染药品，生产环境及生产的各个环节，特别是以动物、脏器为原料的食品污染机率较高。受到污染的食品，不仅直接影响食用者的安全，并可造成沙门氏菌的传播和流行。故对某些食品必须检查沙门氏菌。 食品中污染的沙门

8、氏菌常在生产过程中受到损伤而处于濒死状态，故检验时须先在无选择性的增菌液中使其复苏，然后再进行选择性增菌。沙门氏菌在各种选择性培养基上的菌落形态不同，这可以作为辨别沙门氏菌的一个简单方法，在实际工作中，我们还要配合生化实验以及血清学实验来作准确的鉴定。三、 设备和材料实验器材：恒温培养箱（37、42）、显微镜、广口瓶（500mL）、移液管（10mL）、锥形瓶（250mL）、培养皿、酒精灯、试管架、试管篓、灭菌锅实验材料：污染牛奶等、沙门氏菌株四、 培养基和试剂缓冲蛋白胨水、氯化镁孔雀绿增菌液、亚硒酸盐胱氨酸增菌液、亚硫酸铋琼脂、DHL琼脂、HE琼脂、WS琼脂、SS琼脂五、 操作步骤1. 前增菌

9、和增菌：吸取检样25mL，加在装有225mL缓冲蛋白胨水的500mL广口瓶内，于37培养4h，移取10mL，转种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液内，于42培养1824h。同时，另取10mL，转种于100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于37培养1824h。2. 分离取增菌液1环，划线接种于一个亚硫酸铋琼脂平板和一个DHL琼脂平板、HE琼脂平板、WS和SS琼脂平板。两种增菌液可同时划线接种在同一个平板上。于361分别培养1824h(亚硫酸铋琼脂、DHL、HE、WS、SS) 或4048h(BS)，观察各个平板上生长的菌落，沙门氏菌、和沙门氏菌在各个平板上的菌落特征见表1。表1 沙门氏菌属各群在各种选择性

10、琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板沙门氏菌、沙门氏菌（即亚利桑那菌）亚硫酸铋琼脂产硫化氢菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株不产生硫化氢，形成灰绿色的菌落，周围培养基不变黑色有金属光泽DHL琼脂无色半透明，产硫化氢菌落中心带黑色或几乎全黑色乳糖迟缓阳性或阴性的菌株与沙门氏菌、相同；乳糖阳性的菌株为粉红色，中心带黑色HE琼脂WS琼脂蓝绿色或蓝色，多数菌株产硫化氢，菌落中心黑色或几乎全黑色乳糖阳性的菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色；乳糖迟缓阳性或阴性的菌株为蓝绿色或蓝色，中心黑色或几乎全黑色SS琼脂无色半透明，产硫化氢菌株有的菌落中心带黑色，但不如以上培养基明

11、显乳糖迟缓阳性或阴性的菌株，与沙门氏菌、相同；乳糖阳性的菌株为粉红色，中心黑色，但中心无黑色形成时与大肠艾希氏菌不能区分六、 实验报告1. 辨别牛奶污染菌株是否为沙门氏菌株。2. 辨别污染牛奶的沙门氏菌株的属群。5实验三 酶联免疫吸附试验（间接ELISA）一、 目的要求1. 了解ELISA的基本原理，及其优缺点。2. 掌握间接ELISA法的试验操作过程。二、 基本原理酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA）是免疫酶技术的一种，是将抗原抗体反应的特异性与酶反应的敏感性相结合而建立的一种新技术。ELISA的技术原理是：将酶分子与抗体（或

12、抗原）结合，形成稳定的酶标抗体（或抗原）与固相载体上的相应抗原（或抗体）结合时，即可在底物溶液参与下，产生肉眼可见的颜色反应，颜色的深浅与抗原或抗体的量成比例关系，使用ELISA检测仪，即酶标测定仪，测定其吸收值可做出定量分析。此技术具特异、敏感、结果半段客观，简便和安全等优点，日益受到重视，不仅在微生物学中应用广，而且也被其他学科领域广为采用。ELISA类型繁多，国内已有市售，可根据需要选用，按说明书操作。三、 器材1. 血清 兔阴性血清2. 溶液或试剂 包被液（0.05mol/l,Ph9.6的碳酸盐缓冲液）：NaCO3 1.59g, NaHCO3 2.93g,加去离子水定容至1000mL（

13、加入0.5%的甲醛，4可保存约2周），现配现用。 PBST洗涤剂（吐温-磷酸盐缓冲液pH7.4）：NaCl 8g ，KH2PO4 0.2g ，Na2HPO412H2O 2.9g， KCl 0.2g，吐温-20 0.5mL，蒸馏水加至100mLl。 磷酸盐-柠檬酸缓冲液（pH5.0）：分别取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加去离子水定容至100mLl。甲液（0.01mol/l的柠檬酸 C6H8O7H2O）：称取C6H8O7H2O19.2g，加去离子水定容至1000mL。乙液（0.2mol/l的磷酸氢二钠 Na2HPO412H2O）：称取Na2HPO412H2O 71.7g，加去离子水定容至1

14、000mLl。 底物溶液：40mg邻苯二胺溶于1000mL pH5.0的磷酸盐-柠檬酸缓冲液，临用前加入150Ll 30%的H2O2,现配现用。 终止液 2mol/L H2SO4：吸取10.66mL的98%浓H2SO4（密度为1.84g/mL），加去离子水定容至100mL。 酶标二抗（山羊抗兔Ig-HRP）稀释液：分别吸取10mL小牛血清和50L的Tween-20，加上述PBS缓冲液定容至100mL。3. 仪器或其他用具 聚苯乙烯微量反应板，酶标仪，吸管，橡皮吸头等，紫外分光光度计，20L、100L、500L移液枪各一只，ELISA试剂盒。四操作步骤1.包被抗原用100L移液枪吸取用包被液稀释

15、好的金黄色葡萄球菌抗原，沿孔壁准确滴加100L至每个塑料板孔中，防止气泡产生，置37过夜。2.洗板 倒出包被液，用另一根习惯吸取洗涤液，加入板孔中，洗涤液量以加满但不溢出板孔为宜。均匀振荡3min ，甩出洗涤液。再加洗涤液，重复上述操作三次，扣干。3.加血清用三根套有橡皮吸头的0.2mLl吸管，小心吸取稀释好的血清（待检、阳性、阴性血清），准确加100L于对应板孔中，第4孔中加100L的PBST洗涤液，37放置10min，在水池边甩出血清，洗板三次（方法同2）。注意：切忌溢出互混！4. 加酶标抗体用吸管沿孔壁上部小心准确加入100L酶标抗体（不能让血清玷污吸管），37放置10min，同上倒空，

16、洗涤三次。5. 加底物按比例加H2O2 于配制的底物溶液中，立即用吸管吸取此种溶液，分别加于板孔中，每孔0.1mL。置37，显色515min（经常观察），待对照有明显颜色后，立即加一滴2mol/L H2SO4 终止反应。6. 判断结果肉眼观察（白色背景），阳性对照孔应明显黄色，阴性孔应无色或微黄色，待测孔颜色深于阳性对照孔则为阳性；酶标仪测定，酶标仪测定波长取=492nm（适用于底物为OPD）， P/N2.1时阳性 ，P/N1.5阴性，2.1P/N1.5可疑阳性，应予复查。（P/N=检测孔OD值-空白孔OD值/阴性孔OD值-空白孔OD值。） 滴加试剂量要准，且试剂不可从一孔流到另一孔中；每种试

17、剂对应一种吸管，不能混淆。底物溶液中的H2O2 要临用时再加，否则，放置时间过长，影响试验结果判定。五实验报告1.结果 运用图示表现你所进行的ELISA的反应原理，并写出实验结果。2.思考题 （1）ELISA实验过程中，洗板这一步骤能否省去，为什么？（2）酶底物溶液为什么需要现配现用？5实验四 PCR技术快速检测副溶血弧菌一、 实验目的1. 学习副溶血弧菌DNA的提取方法2. 学习副溶血弧菌的PCR检测方法二、 基本原理副溶血弧菌是弧菌的一种，主要存在于海洋中，是一种致病菌。人类会因进食未煮熟的海产品或被该菌污染的食物而感染，引起食物中毒。PCR是利用基因扩增技术，具有特异、敏感、快速的分子生

18、物学方法，该技术在微生物、分子流行病学及疾病诊断灯方面的应用显示出极大的优越性。16SrDAN具有分子大小适中，突变率小等优点，素有细菌化石之称，常被用于细菌分类及分子系统发育树的建立。本次实验利用16SrDAN的通用引物，进行PCR扩增，来检测副溶血弧菌。三、 设备和材料实验器材：PCR扩增仪、电泳仪、高速冷冻离心机、恒温培养箱（30）、酒精灯、培养皿、试管（15150mm）、接种环、离心管（1.5mL）、一次性手套、一次性口罩、移液枪（110L、10100L）、枪头（0.510L、1200L）、配套枪头盒、显微镜、载玻片、灭菌锅、试管架、试管篓实验材料：副溶血弧菌24h培养物四、 试剂DN

19、A提取试剂盒、PCR扩增试剂盒、引物（27f、1492r）、琼脂糖、EB染色液、DNA MarkerTAE PCR电泳缓冲液、革兰氏染色液、TCBS培养基、3NaCl营养肉汤、生理盐水五、 操作步骤1培养基培养：取副溶血弧菌24h培养物分别接种在TCBS培养基以及3NaCl营养肉汤中，30培养24h。2镜检： 取固体培养基上的菌体进行革兰氏染色，观察具体形态，副溶血弧菌为革兰氏阴性菌，在油镜下观察，菌体弧状，0.51.53.0微米，单个或偶尔联成S形。3DNA提取：取液体培养物进行DNA提取，按照DNA提取试剂盒说明操作。4DNA扩增：利用细菌16SrDNA的通用引物来进行DNA扩增。总体积2

20、5l的反应体系中，10mol/L的上下游引物各1L，模板DNA1L，Mg+1.5L，dNTP2.5L，Taq酶0.3L，10buffer缓冲液2.0L，双蒸水15.2L。引物序列为：27f：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG1492r：GGTTACCTTGTTACGACTTPCR反应条件为：预变性953min，变性951min，退火551min，延长722min，30个循环，再延长7210min。5电泳检测：取15l扩增液经2琼脂糖凝胶及TAE电泳缓冲液电泳90min，在EB染色液中染色30min，然后漂洗，用凝胶成像仪观察结果并拍照。六、 实验报告观察扩增后的DNA条带，根据Marke

21、r判断其DNA大小。5实验五 3M大肠杆菌和大肠菌群快速检验一 实验目的掌握利用3M测试片快速检测大肠杆菌的方法。二 基本原理Petrifilm ColiformTM Coliform测试片含有VRB培养剂 (Violet Red Bile)，一种冷水可溶性的凝胶剂和四唑翁(tetrazollium)指示剂，可增强菌落计数效果。绝大多数E .coli（约占97%）能产生-葡萄糖甘酸酶与培养基中的指示剂反应，产生蓝色沉淀环绕在大肠杆菌菌落周围，表面覆盖的胶膜，可留住发酵乳糖的大肠菌群产生的气体，约有95%的大肠杆菌产生，形成蓝色或深蓝上菌落并有气泡相连接，气泡大小约为1个菌落直径。AOAC和FD

22、A细菌学分析手册（RAM）规定大肠菌群为革兰氏阴性杆菌，发酵乳糖产酸产气。大肠菌群菌落在Petrifilm CC测试片上生长产酸，PH指示剂使培养基颜色变深，在红色菌落周围有气泡者，为大肠菌群细菌。三 设备和材料3M公司的Pertrifilm。培养箱等。四 操作步骤（1） 样品准备称取或吸取食品样品，置于适宜的无菌容器内，加入适量无菌稀释液搅拌或均质样品。（2） 接种将测试片放置在平坦表面处，揭起上层膜，使用吸管将1mL的样品垂直滴在测试片的中央处。将上层膜缓缓盖下，避免气泡进入，切勿让上层膜直接盖回。使用压板（平面底朝上）放置在上层膜中央处，轻轻压下，切勿扭转或滑动压板。静止1min使凝胶凝

23、固。（3） 培养测试片的透明的一面向上，可堆叠至20片，于351或371下培养24h2h（培养后的菌落在测试片上可能看不到，因为指示剂是含在金黄色葡萄球菌检测反应片上）。将检测片移至622培养箱，培养1h4h（注意：如果菌落需要进一步测试，检测片培养不要超过1h）。使用无菌镊子取出圆形的反应片，再揭开上层覆盖膜小心置入反应片。再将上层膜放下（为了使反应片与培养胶均匀接触及避免夹带任何气泡，可用一弯曲的玻璃棒（L玻棒）轻压检测片）。将已置入反应片的金黄色葡萄球菌检测片培养于351或371，13h。将测试片置于平坦表面处，揭开上层膜使用吸管将1mL样液垂直加在测试片的中央处细心将上层膜缓慢盖下，避

24、免有气泡产生，切勿使上层膜直接落下轻轻的压下，使样液均匀覆盖于圆形的培养面积上，切勿扭转样板拿起压板，静止至少1分钟以使培养基凝固测试片的透明面朝上，可堆叠至20片可目视及用标准菌落计数器或其它的照明放大镜计数，并可参考判读卡计算菌落数可以分离菌落作进一步鉴定，即掀起上层膜，由培养胶上挑取单个菌落图1 3M测试片的操作方法四 检测结果的判读卡和计算菌落数方法AOAC和FDA细菌学分析手册（RAM）规定大肠菌群为革兰氏阴性杆菌，发酵乳糖产酸产气。大肠菌群菌落在Pertrifilm测试片上生长产酸，pH指示剂使培养基颜色变深，在红色菌落周围有气泡者，为大肠菌群。具体判定方法参见图2。 大肠菌群菌落

25、总数=69大肠菌群鉴定方法，在不同国家可以有变更（见培养时间和培养温度提示）。AOAC确认大肠菌群菌落总数为69（有气泡的菌落）无生长=0注意图2-5培养基颜色的变化，随着大肠菌群菌数增多，培养基颜色变深，背景的泡（沫）为培养对象，不是大肠菌群生长结果大肠菌群菌落总数=79Petrifilm cc测试片菌落数适宜计数范围是15-150，不要计算圆形培养基外的菌落，因为泡棉上已不含选择性培养基（圆圈1）估计的大肠菌群菌落总数=220测试片面积为20cm2，当菌落数超过150个，为了估计菌落数可选择其中一个或数个有代表性菌落的小方格（1cm2）计算平均菌落数，再乘以20方得到整个测试片上的菌落数。

26、菌落太多时需进一步稀释样品，方能获得准确计数大肠菌群菌落总数=TNTC（菌落太多无法计数）Petrifilm cc测试片菌落无法计数时至少有下列现象之一：有很多小菌落；有许多气泡；培养的颜色深暗大肠菌群菌落总数=4当有大量的非大肠菌群细菌如假单胞菌属存在时，Petrifilm cc测试片培养基颜色呈黄色大肠菌群菌落总数=2食物颗粒为不规则形状，且不带气泡大肠菌群菌落总数=8气泡可有不同形状，气泡可使菌落撑散，使菌落轮廓似气泡（见圆圈1和圆圈2），人为的气泡可能是不当的操作所致，或是来自样品里的气体，它们呈不规则形状，且不与菌落相连接（见圆圈3）图2 大肠菌群检测的判读卡和计数方法五 实验报告培

27、养后，判断大肠杆菌菌落并计数。5实验六、对硫磷在苹果中残留的分析方法一、目的1 .学习农药残留样本预处理、净化、浓缩等操作技术。2.重点学习净化柱的填充和使用。3.学习气相色谱与质谱联用仪的使用。二、实验仪器和试剂1仪器：气相色谱仪与质谱联用仪：Agilent 6980+5973 、组织捣碎机、旋转蒸发仪、层析柱、分液漏斗及各种玻璃仪器。2 药剂：对硫磷标准品（97.0）、丙酮、石油醚（重蒸）、氯化钠、无水硫酸钠（皆为分析纯）、弗罗里硅土（80目130活化数小时，贮存于干燥器备用）、活性碳。三、实验步骤1、提取称取100克切碎的苹果样品，加入10mg/L 2.5ml的对硫磷标准品于高速组织捣碎

28、机中，加入70ml丙酮，充分捣碎，再用70ml丙酮洗涤残渣，滤液全部转入分液漏斗，加入200mL 10氯化钠水溶液，振荡。石油醚100、50ml分两次萃取，弃丙酮水相，石油醚层过装有无水硫酸钠的漏斗过滤于250mL圆底烧瓶中，40左右减压浓缩近2mL，定容10 mL。待过柱。2净化 在直径15cm1cm玻璃层析柱中，底部垫少许脱脂棉，从下向上依次装入1cm无水硫酸钠、1g弗罗里硅土、0.2g（0.2g活性碳8g弗罗里硅土）、1cm无水硫酸钠，装好柱后轻轻敲实。先用5mL石油醚预淋，当液面接近无水硫酸钠时，加入2mL浓缩液（开始接收），待近干时加入少量10%丙酮/石油醚（v/v）淋洗液，然后加入30mL10%丙酮/石油醚（v/v），此淋洗液浓缩定容至10mL。进样测定。3色谱条件 色谱柱：HP-5 30m；柱温：200；进样口温度：240；四级杆温度：160；离子源温度：220；接口温度：280；进样量：1L。4色谱分析将浓度为20mg/L的对硫磷标样进样，得到峰面积A0，再将净化后浓缩的样品进样，得到峰面积A1。四、结果计算 计算该实验添加回收率五、结果讨论1. 在农药残留检测中，有哪些净化与提取方法？2. 在农药残留检测方法的回收率一般在多少范围内为宜？为什么？5实验七 食品中药残的快速检测参照仪器使用说明。