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1、 结核杆菌dna检测意义 R446.11A1005-2720(2010)03 - 130 - 02 结核分枝杆菌,俗称结核杆菌,是引起结核病的病原菌。可侵扰全身各器官,但以肺结核为最多见。结核病的症状和体征往往不典型,虽可借助X线摄片诊断,但确诊仍有赖于细菌学检查。一般涂片检查菌数需5x1034/ml,培育需1x102/ml,标本中菌数少于此数时不易获得阳性结果,且培育需时较长。目前已将多聚酶链反应(PCR)扩增技术应用于结核分枝杆菌DNA鉴定,每ml中只需含几个细菌即可获得阳性。PCR是聚合酶链式反应的简称,是一种酶促化学反应,可以在试管里将待测的目的基因在很短的时间内扩增几十万倍乃至上百万
2、倍,大大提高了基因诊断的灵敏度,降低了分析的难度。操作中需留意试验器材的污染问题,以免出现假阳性。现将荧光定量PCR法检测结核杆菌结果,报告如下。 1 资料与方法 1.1 一般资料收集2005年1月至2006年12月我院收治的结核病患者346例,其中男181例,女165例;年龄1875岁,均符合全国结核病防治工作手册诊断标准。346例患者中,取痰标本181例,其中男90例,女91例;年龄;年龄1868岁。取胸腹水标本100例,其中男52例,女48例;年龄2272岁。取尿标本65例,其中男55例,女10例;年龄1875岁。 1.2方法每份标本均行荧光定量PCR法。痰液标本:取晨痰置于无菌密封瓶,
3、采纳胰酶消化液+NaOH处理法。加入等量胰酶消化液,置37水浴消化,直至痰液被完全消化为止,再加入等量1 mol/L NaOH处理35 min,混匀,取0.5 ml标本14000 r/min离心10 min;去上清留沉淀,以1.5ml生理盐水洗涤,14000r/min离心10min,去上清留沉淀待检。胸腹水标本:以EDTA抗凝胸腹水,混匀,取1ml标本14000r/min离心10min待检。尿液标本:取晨尿10 ml,混匀,取1 ml 14000 r/min离心10min待检。标本若为血性标本先用等量红细胞裂解液处理,14000r/min离心10min,去上清留沉淀。标本均各留取2份,一份备用
4、,一份检测。荧光定量PCR标准品与标本各2 L加入PCR反应混合液中,离心30 s后置于PE7000 PCR仪上,行PCR扩增反应。 2 结 果 监测结果显示,荧光定量PCR对除结核杆菌外的其他呼吸道病原体(肺炎支原体、肺炎衣原体、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌)检测结果均为阴性。181例患者痰标本,阳性109例,阳性率60.22%;100例胸腹水标本,荧光定量PCR检测阳性25例,阳性率25.0%;65例尿液标本,荧光定量PCR检测阳性26例,阳性率40.%。 3 讨 论 PCR法是目前基因诊断中运用最多的方法。首先,对待测基因进行PCR;然后电泳PCR结果;第三,对结果分析:若无特定的扩增片
5、断出现,说明诊断的这个基因缺失了;若扩增片断的大小与正常基因不同,说明发生了突变。另外,对PCR扩增片断干脆测序,可以诊断未知突变基因核苷酸的变更。 纵观PCR法,可见关键是第一步骤即利用PCR技术扩增待测的目的基因,为进行基因序列的试验分析供应所需的足够材料。 荧光定量PCR方法采纳荧光探针,不需扩增后处理,比传统PCR具有更高的特异性和简便性,可以最大限度地避开交叉污染。自PCR法用于临床结核杆菌的检测,国内外学者始终在探讨检测标本的预处理对检测结果的影响。细菌L型由于缺壁并有代偿性细胞膜增厚,而一般常用的溶菌酶不能使细胞膜裂开释出DNA,以致造成PCR假阴性。用组织磨碎器充分研磨使细胞裂
6、开后,则可出现阳性1。 在应用PCR等新技术的时候,最好取样本时严格无菌操作,统一取样方法,尽量削减假阳性。尽管这样,因为目前广泛应用的是定性PCR技术,其试剂性能和结果检测的方法各异,样本TB-DNA-PCR检查的特异性会掺差不齐,假阳性率仍旧会偏高,因此,该检查尚未法定成为结核病的诊断依据。最近2年,国外已经发展成定量PCR技术,对特异性病原体DNA/RNA进行定量探讨,确定样本的启始量,可鉴别基因相像的病原体,以便更特异地诊断病原,推断病人的感染程度以及临床疗效评价,将会成为更特异的临床检测手段。PCR扩增技术与DNA探针相结合可以降低假阴性和假阳性率,或者PCR技术与Southern杂交技术相结合,可以进一步提高检测的敏感性和特异性2。 在结核杆菌感染的诊断上,抗酸染色和PCR同时阳性即可确诊。如PCR阳性,抗酸染色阴性,应重复检测标本,直到PCR或抗酸染色阳性才可确诊;如抗酸染色阳性,PCR法阴性,应重复检测,并解除非结核分枝杆菌感染的可能。 1 韩纪勤.荧光定量聚合酶链反应诊断结核病临床应用探讨J.山西医科高校学报,2006,37(2): 180-181. 2 周步全,朱建峰,王迎春.结核分枝杆菌标本的不同处理方法对PCR扩增敏感性的影响J.现代医学检验杂志,2005,20(6): 60-63.