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1、南方红豆杉多糖的测定 多糖含量测定 关键词 南方红豆杉 多糖 蒽酮-硫酸法 含量测定 红豆杉为世界濒危珍稀植物,是第四纪冰川后的孑遗物种,素有“植物黄金”之称1。我国红豆杉有4种及1个变种。南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)即是变种,系裸子 植物亚门、松杉纲、红豆杉目、红豆杉科中红豆杉族下的红豆杉属植物2,产于我国长江流域以南,为红豆杉属植物在我国分布最为广泛的一种3。红豆杉药用历史久远,在我国医学中早有记载:本草纲目就记有红豆杉治疗霍乱、伤寒及排毒等疗效;在现代中药大辞典、东北药植志、吉林中草药、本草推陈等医药书中还有进一步的记载:入药可利尿、通经,对肾病、肠
2、胃病、糖尿病有独特疗效4。近年来,有药效试验发觉红豆杉中所含的多糖对S180荷瘤小鼠、levis肺癌小鼠和HepA肺癌小鼠具有肯定的抑制肿瘤作用,可以提高荷瘤小鼠的生命延长率,提高荷瘤小鼠的免疫细胞功能,表明对免疫功能有较好的促进作用5。为了更好地利用这一珍贵资源,同时为红豆杉多糖的药用奠定基础,我们用蒽酮-硫酸法6对南方红豆杉中多糖含量测定方法进行了探讨。 1 试验方法 1.1 仪器与试剂:分述如下。 1.1.1 仪器:UV-2000紫外-可见光分光光度计(优尼科上海仪器有限公司),DHS20-1分析电子天平(上海天平仪器厂),DKS-24型电热恒温水浴锅(嘉兴市中新医疗仪器有限公司),LX
3、J-IIB型离心机(上海安亭科学仪器厂),DGG-9070A电热恒温鼓风干燥箱(上海森信试验仪器有限公司)。 1.1.2 试剂:无水标准葡萄糖(中国生物制品检定所),无水乙醇,浓硫酸,蒽酮,正丁醇,三氯甲烷,石油醚均为市售分析纯。 1.1.3 材料:南方红豆杉药材粉末由红豆杉企业各大基地供应。经鉴定为南方红豆杉5年生干燥枝叶粉末。 1.2 试验方法:分述如下。 1.2.1 蒽酮-硫酸试剂的配制: 精密称取200mg葸酮置于烧杯中,沿烧杯内壁缓慢加入浓硫酸100ml,边加边搅拌,直至蒽酮完全溶解后溶液呈黄色透亮,并将其置于棕色瓶中于冷暗处密封保存。 1.2.2 样品供试液的制备: 样品系采纳南方
4、红豆杉的枝叶,因其含有大量的蜡质、叶绿素等脂溶性成分,首先对药材进行石油醚脱脂处理。其次对药材提取次数、醇沉浓度、脱蛋白、脱色工艺等进行了单因素考察,确定了合理的供试液制备方法。 精密称取南方红豆杉粉末1.00g,加200ml蒸馏水超声提取30min,再回流提取1.5h,3次,过滤,合并滤液,将滤液浓缩定容至50ml后,加粉末型活性炭1.5g,在60水浴中搅拌加热30min后过滤,将滤液进行Sevag法除蛋白(正丁醇:氯仿51):滤液15,于分液漏斗中反复进行至溶液分界面交界处无白色混悬,合并滤液,浓缩定容至50ml后,从中精确吸取1ml浓缩滤液加乙醇至含醇量达85%,在4下静置30min后,
5、4000rpm离心,将离心后的沉淀部分取出,用蒸馏水溶解定容至10ml容量瓶中,即得。 1.2.3 标准曲线的绘制: 精密称取于105干燥至恒重的无水葡萄糖12.0mg,用蒸馏水溶解并定容至100ml容量瓶中,摇匀,得葡萄糖标准溶液。分别从葡萄糖标准溶液中精密吸取0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml于干燥具塞试管中,分别加蒸馏水至1.0ml,每管加蒽酮-硫酸试剂2.5ml,加塞,马上摇匀,室温(25)放置1min后,置于冰水浴中10min后取出,再室温放置10min后,于625nm处测定吸光值(A)。以吸光值(A)为纵坐标,对葡萄糖浓度(C)为横坐标作标进行线性
6、回来,进行计算,得回来方程为Y=5.0583X+0.1268,R2=0.9996,表明葡萄糖的浓度在0.0240.120mg/ml与吸光值呈良好的线性关系。 1.2.4 重复性试验: 精密称取同一批次南方红豆杉1.00g,5份,根据1.2.2供试液制备方法进行处理后,分别于625nm处测定吸光值(A)。 1.2.5 稳定性试验: 精密称取南方红豆杉粉末1.00g,根据1.2.2供试液制备方法进行处理,分别于0h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h测定吸光值(A)。 1.2.6 回收率试验: 精密称取与重复性试验相同批次的南方红豆杉粉末0.50g,5份,根据1.2.2供试液制备方法进行处理至离
7、心取出沉淀物,分别将各沉淀物置于干燥具塞试管中,再分别于每份沉淀精确加入标准葡萄糖溶液0.5ml,并分别用蒸馏水稀释至1ml后,每管加蒽酮-硫酸试剂2.50ml,加塞,马上摇匀,室温(25)放置1min,再置于冰水浴中10min后取出,室温放置10min后,于625nm处测定吸光值(A)。并计算其含量,计算加样回收率。 1.2.7 南方红豆杉多糖的测定:分别对宁海、桐庐、湖州、绍兴红豆杉基地采集的4批南方红豆杉进行含量测定。 2 结果 试验结果,分述如下。 2.1 重复性试验:对同一批次的南方红豆杉进行了多糖含量测定,结果表明重现性良好,平均值(A)=0.5448,RSD=2.67%(n=5)
8、。结果见表1。 2.2 稳定性试验:表明样品溶液中多糖含量在3h内无明显改变,RSD=2.87%(n=7)。结果见表2。 2.3 加样回收试验:平均回收率为99.1%,RSD=3.00%(n=5),表明该方法回收率良好。结果见表3。 2.4 各基地含量测定:结果见表4。 3 探讨 在试验过程中,硫酸-蒽酮溶液必需现配现用,并应放入到棕色瓶中避光保存。多糖样品测定时,试管中加入硫酸-蒽酮溶液后,由于是放热反应,试管温度急剧上升,因此,试管要先用自来水冲洗才可以放入到冰水中冷却,以免试管因骤冷而裂开。 南方红豆杉多糖的发觉开拓了南方红豆杉药用资源,本文就南方红豆杉多糖的含量进行测定,选取的蒽酮-硫
9、酸法系利用多糖在浓硫酸水解成单糖,并快速脱水生成羟甲基糠醛,羟甲基糠醛与蒽酮缩合成蓝色化合物,该化合物颜色深浅与糖的浓度成正比。样品前处理通过脱脂处理,脱蛋白、脱色处理除去其他成分的干扰。通过试验表明:该方法测定简便可行,供试液在3h内显色稳定,重现性较好。为南方红豆杉多糖的进一步开发供应了基础。 4 参考文献 1陈毓亨,程克棣.近年来国外紫杉醇资源探讨进展J.国外医学药学分册,1994,21(1):31-39. 2中国科学院植物探讨所编辑委员会.中国植物志第七卷M.科学出版社,1978:438-443. 3包维楷,陈庆恒.中国的红豆杉资源及其开发探讨现状与发展对策J.自然资源学 报,1998,13(4):375-380. 4黄慧琼.红豆杉的价值与快繁技术J.特种经济动植物,2003(9):21-22. 5韩飞飞.红豆杉多糖纯化、结构分析和抗肿瘤活性探讨D.浙江高校,2006:65-72. 6王黎明,夏文水.蒽酮-硫酸法测定茶多糖含量的探讨J.食品科学,2005,26(7):185-188. 收稿日期 2009-06-30