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1、关于蛋白质和多肽的氨基酸序列测定第一张，PPT共二十二页，创作于2022年6月 蛋白质和多肽是由蛋白质和多肽是由蛋白质和多肽是由蛋白质和多肽是由2020种氨基酸按照一定的顺序通过肽键连接成一长种氨基酸按照一定的顺序通过肽键连接成一长种氨基酸按照一定的顺序通过肽键连接成一长种氨基酸按照一定的顺序通过肽键连接成一长链，然后通过链内、链间的离子键、疏水作用等多种作用力进行折叠、链，然后通过链内、链间的离子键、疏水作用等多种作用力进行折叠、链，然后通过链内、链间的离子键、疏水作用等多种作用力进行折叠、链，然后通过链内、链间的离子键、疏水作用等多种作用力进行折叠、卷曲形成一定的构象并发挥其独特作用。氨基
2、酸的排列顺序即蛋白质的卷曲形成一定的构象并发挥其独特作用。氨基酸的排列顺序即蛋白质的卷曲形成一定的构象并发挥其独特作用。氨基酸的排列顺序即蛋白质的卷曲形成一定的构象并发挥其独特作用。氨基酸的排列顺序即蛋白质的一级结构决定了蛋白质的高级结构及功能。因此，测定蛋白质的氨基酸一级结构决定了蛋白质的高级结构及功能。因此，测定蛋白质的氨基酸一级结构决定了蛋白质的高级结构及功能。因此，测定蛋白质的氨基酸一级结构决定了蛋白质的高级结构及功能。因此，测定蛋白质的氨基酸序列是进行蛋白质结构功能研究中不可缺少的部分。另外，蛋白质一级序列是进行蛋白质结构功能研究中不可缺少的部分。另外，蛋白质一级序列是进行蛋白质结构
3、功能研究中不可缺少的部分。另外，蛋白质一级序列是进行蛋白质结构功能研究中不可缺少的部分。另外，蛋白质一级结构的信息也有助于对其基因结构的研究。结构的信息也有助于对其基因结构的研究。结构的信息也有助于对其基因结构的研究。结构的信息也有助于对其基因结构的研究。目前，进行蛋白质序列测定有两个关键步骤，即：目前，进行蛋白质序列测定有两个关键步骤，即：目前，进行蛋白质序列测定有两个关键步骤，即：目前，进行蛋白质序列测定有两个关键步骤，即：氨基酸残基一个一个依次从蛋白质和多肽的末端切割下来；氨基酸残基一个一个依次从蛋白质和多肽的末端切割下来；氨基酸残基一个一个依次从蛋白质和多肽的末端切割下来；氨基酸残基一
4、个一个依次从蛋白质和多肽的末端切割下来；正确鉴定每次切割下来的氨基酸残基。正确鉴定每次切割下来的氨基酸残基。正确鉴定每次切割下来的氨基酸残基。正确鉴定每次切割下来的氨基酸残基。其中第一步可采用化学法或酶法进行裂解。由于化学法较之酶法具有其中第一步可采用化学法或酶法进行裂解。由于化学法较之酶法具有其中第一步可采用化学法或酶法进行裂解。由于化学法较之酶法具有其中第一步可采用化学法或酶法进行裂解。由于化学法较之酶法具有裂解率高、易于自动化、耗费少等诸多优点，被蛋白质化学实验室普遍裂解率高、易于自动化、耗费少等诸多优点，被蛋白质化学实验室普遍裂解率高、易于自动化、耗费少等诸多优点，被蛋白质化学实验室普
5、遍裂解率高、易于自动化、耗费少等诸多优点，被蛋白质化学实验室普遍采用，可以从蛋白质和多肽的采用，可以从蛋白质和多肽的采用，可以从蛋白质和多肽的采用，可以从蛋白质和多肽的N N端进行裂解，也可以从端进行裂解，也可以从端进行裂解，也可以从端进行裂解，也可以从C C端进行分析。端进行分析。端进行分析。端进行分析。第二步通常是在氨基酸残基上衍生了一个生色基团，通过高效液相色第二步通常是在氨基酸残基上衍生了一个生色基团，通过高效液相色第二步通常是在氨基酸残基上衍生了一个生色基团，通过高效液相色第二步通常是在氨基酸残基上衍生了一个生色基团，通过高效液相色谱进行分离分析。谱进行分离分析。谱进行分离分析。谱进
6、行分离分析。本章将就蛋白质和多肽的本章将就蛋白质和多肽的本章将就蛋白质和多肽的本章将就蛋白质和多肽的N N端、端、端、端、C C端氨基酸序列分析端氨基酸序列分析端氨基酸序列分析端氨基酸序列分析的原理和方法、进行序列分析前蛋白质和多肽样品的准备作一介绍。的原理和方法、进行序列分析前蛋白质和多肽样品的准备作一介绍。的原理和方法、进行序列分析前蛋白质和多肽样品的准备作一介绍。的原理和方法、进行序列分析前蛋白质和多肽样品的准备作一介绍。第二张，PPT共二十二页，创作于2022年6月第一节第一节 N端分析原理端分析原理一、耦一、耦一、耦一、耦 联联联联 蛋白质和多肽的自由蛋白质和多肽的自由蛋白质和多肽的
7、自由蛋白质和多肽的自由 氨基经与异硫氰酸苯酯氨基经与异硫氰酸苯酯氨基经与异硫氰酸苯酯氨基经与异硫氰酸苯酯(PITC)(PITC)试试试试剂耦联后，与其紧邻的第二个残基的键合力大大减弱，很容剂耦联后，与其紧邻的第二个残基的键合力大大减弱，很容剂耦联后，与其紧邻的第二个残基的键合力大大减弱，很容剂耦联后，与其紧邻的第二个残基的键合力大大减弱，很容易断裂。易断裂。易断裂。易断裂。第三张，PPT共二十二页，创作于2022年6月二、裂二、裂二、裂二、裂 解解解解 在无水条件下酸裂解，仅仅切下反应的那个残基。紧挨的在无水条件下酸裂解，仅仅切下反应的那个残基。紧挨的在无水条件下酸裂解，仅仅切下反应的那个残基
8、。紧挨的在无水条件下酸裂解，仅仅切下反应的那个残基。紧挨的第二个氨基酸残基暴露出自由的第二个氨基酸残基暴露出自由的第二个氨基酸残基暴露出自由的第二个氨基酸残基暴露出自由的 氨基，又可与氨基，又可与氨基，又可与氨基，又可与PITCPITC进行进行进行进行耦联反应。耦联反应。耦联反应。耦联反应。第四张，PPT共二十二页，创作于2022年6月三、转三、转三、转三、转 化化化化 ATZATZ氨基酸不稳定，在三氟乙酸水溶液氨基酸不稳定，在三氟乙酸水溶液氨基酸不稳定，在三氟乙酸水溶液氨基酸不稳定，在三氟乙酸水溶液(25(25)中可转化中可转化中可转化中可转化成稳定的成稳定的成稳定的成稳定的PTHPTH氨基
9、酸。氨基酸。氨基酸。氨基酸。第五张，PPT共二十二页，创作于2022年6月第六张，PPT共二十二页，创作于2022年6月四、四、四、四、PTHPTH氨基酸的鉴定氨基酸的鉴定氨基酸的鉴定氨基酸的鉴定 可以通过薄层层析、气相色谱、高效液相色谱及可以通过薄层层析、气相色谱、高效液相色谱及可以通过薄层层析、气相色谱、高效液相色谱及可以通过薄层层析、气相色谱、高效液相色谱及质谱等各种手段进行分析。近年来由于高效液相色质谱等各种手段进行分析。近年来由于高效液相色质谱等各种手段进行分析。近年来由于高效液相色质谱等各种手段进行分析。近年来由于高效液相色谱技术具有分析速度快、灵敏度高、定性定量准确谱技术具有分析
10、速度快、灵敏度高、定性定量准确谱技术具有分析速度快、灵敏度高、定性定量准确谱技术具有分析速度快、灵敏度高、定性定量准确等诸多优点，并且仪器自身结构也日臻完善，被广等诸多优点，并且仪器自身结构也日臻完善，被广等诸多优点，并且仪器自身结构也日臻完善，被广等诸多优点，并且仪器自身结构也日臻完善，被广泛应用于泛应用于泛应用于泛应用于PTHPTH氨基酸的鉴定。通常选用氨基酸的鉴定。通常选用氨基酸的鉴定。通常选用氨基酸的鉴定。通常选用C18C18反反反反相柱进行分离。相柱进行分离。相柱进行分离。相柱进行分离。第七张，PPT共二十二页，创作于2022年6月第二节第二节第二节第二节 N N端蛋白质序列仪端蛋白
11、质序列仪端蛋白质序列仪端蛋白质序列仪三、气相序列仪三、气相序列仪三、气相序列仪三、气相序列仪 自动化蛋白质序列仪刚问世时，需要样品量为自动化蛋白质序列仪刚问世时，需要样品量为自动化蛋白质序列仪刚问世时，需要样品量为自动化蛋白质序列仪刚问世时，需要样品量为1 12mg2mg。19781978年年年年TarrTarr等将一种四级铵盐聚合物等将一种四级铵盐聚合物等将一种四级铵盐聚合物等将一种四级铵盐聚合物“polybrene”polybrene”引入了蛋白质、多肽的序列测引入了蛋白质、多肽的序列测引入了蛋白质、多肽的序列测引入了蛋白质、多肽的序列测定，它能和肽链中的极性基团作用定，它能和肽链中的极性
12、基团作用定，它能和肽链中的极性基团作用定，它能和肽链中的极性基团作用(非共价键合非共价键合非共价键合非共价键合)而将蛋白质和多肽有效而将蛋白质和多肽有效而将蛋白质和多肽有效而将蛋白质和多肽有效地固定在玻璃纤维支持膜上，防止了萃取时样品的损失。为了适应分子地固定在玻璃纤维支持膜上，防止了萃取时样品的损失。为了适应分子地固定在玻璃纤维支持膜上，防止了萃取时样品的损失。为了适应分子地固定在玻璃纤维支持膜上，防止了萃取时样品的损失。为了适应分子生物学对蛋白质微量分析的要求，生物学对蛋白质微量分析的要求，生物学对蛋白质微量分析的要求，生物学对蛋白质微量分析的要求，2020世纪世纪世纪世纪8080年代初，
13、年代初，年代初，年代初，HewickHewick及及及及HunkpillarHunkpillar等人改进了自动化蛋白质序列仪中的仪器结构，它用弹筒型等人改进了自动化蛋白质序列仪中的仪器结构，它用弹筒型等人改进了自动化蛋白质序列仪中的仪器结构，它用弹筒型等人改进了自动化蛋白质序列仪中的仪器结构，它用弹筒型玻璃反应室玻璃反应室玻璃反应室玻璃反应室(内部体积约内部体积约内部体积约内部体积约0.05m1)0.05m1)代替了液相序列仪中的旋转玻璃杯，用代替了液相序列仪中的旋转玻璃杯，用代替了液相序列仪中的旋转玻璃杯，用代替了液相序列仪中的旋转玻璃杯，用polybrenepolybrene固定样品，固定
14、样品，固定样品，固定样品，EdamnEdamn降解反应中有的试剂如三甲胺以气体方式降解反应中有的试剂如三甲胺以气体方式降解反应中有的试剂如三甲胺以气体方式降解反应中有的试剂如三甲胺以气体方式输送，其他试剂以流动或液相脉冲方式输送。此仪器较之以前几种序列输送，其他试剂以流动或液相脉冲方式输送。此仪器较之以前几种序列输送，其他试剂以流动或液相脉冲方式输送。此仪器较之以前几种序列输送，其他试剂以流动或液相脉冲方式输送。此仪器较之以前几种序列仪具有以下明显优点：仪具有以下明显优点：仪具有以下明显优点：仪具有以下明显优点：灵敏度高，耗费样品量少，通常仅需灵敏度高，耗费样品量少，通常仅需灵敏度高，耗费样品
15、量少，通常仅需灵敏度高，耗费样品量少，通常仅需5050100pmol100pmol；试剂和溶剂消耗少，大约是液相序列仪的试剂和溶剂消耗少，大约是液相序列仪的试剂和溶剂消耗少，大约是液相序列仪的试剂和溶剂消耗少，大约是液相序列仪的l l1010，降低了费用；，降低了费用；，降低了费用；，降低了费用；缩短了每步降解循环时间，提高了分析效率。缩短了每步降解循环时间，提高了分析效率。缩短了每步降解循环时间，提高了分析效率。缩短了每步降解循环时间，提高了分析效率。2020世纪世纪世纪世纪8080年代末又对气相序列仪进行了部分改进，即将原来三氟乙酸年代末又对气相序列仪进行了部分改进，即将原来三氟乙酸年代末
16、又对气相序列仪进行了部分改进，即将原来三氟乙酸年代末又对气相序列仪进行了部分改进，即将原来三氟乙酸以气体方式输送改为液相脉冲方式，称为脉冲液相序列仪，以适应不同以气体方式输送改为液相脉冲方式，称为脉冲液相序列仪，以适应不同以气体方式输送改为液相脉冲方式，称为脉冲液相序列仪，以适应不同以气体方式输送改为液相脉冲方式，称为脉冲液相序列仪，以适应不同样品的分析需要。另外，由于载有活性基团的功能性样品的分析需要。另外，由于载有活性基团的功能性样品的分析需要。另外，由于载有活性基团的功能性样品的分析需要。另外，由于载有活性基团的功能性PVDFPVDF膜的问世，膜的问世，膜的问世，膜的问世，蛋白质和多肽可
17、以共价固定在此类膜上，直接在上述两种序列仪上进行蛋白质和多肽可以共价固定在此类膜上，直接在上述两种序列仪上进行蛋白质和多肽可以共价固定在此类膜上，直接在上述两种序列仪上进行蛋白质和多肽可以共价固定在此类膜上，直接在上述两种序列仪上进行固相序列分析。固相序列分析。固相序列分析。固相序列分析。第八张，PPT共二十二页，创作于2022年6月 在这两种序列仪中，在这两种序列仪中，在这两种序列仪中，在这两种序列仪中，EdmanEdman降解后的降解后的降解后的降解后的PTHPTH氨基酸衍生物可及时直接氨基酸衍生物可及时直接氨基酸衍生物可及时直接氨基酸衍生物可及时直接从转化腔中自动输入高效液相色谱仪中进行
18、从转化腔中自动输入高效液相色谱仪中进行从转化腔中自动输入高效液相色谱仪中进行从转化腔中自动输入高效液相色谱仪中进行PTHPTH氨基酸衍生物的定性及氨基酸衍生物的定性及氨基酸衍生物的定性及氨基酸衍生物的定性及定量分析，这样不仅快速可靠，而且防止了样品的损失。这两台仪器统一定量分析，这样不仅快速可靠，而且防止了样品的损失。这两台仪器统一定量分析，这样不仅快速可靠，而且防止了样品的损失。这两台仪器统一定量分析，这样不仅快速可靠，而且防止了样品的损失。这两台仪器统一用电脑控制，包括化学反应和分析鉴定以及数据的自动记录和处理。图用电脑控制，包括化学反应和分析鉴定以及数据的自动记录和处理。图用电脑控制，包
19、括化学反应和分析鉴定以及数据的自动记录和处理。图用电脑控制，包括化学反应和分析鉴定以及数据的自动记录和处理。图4.24.2为标准为标准为标准为标准PTHPTH氨基酸的色谱分离图。由图可见，欲在氨基酸的色谱分离图。由图可见，欲在氨基酸的色谱分离图。由图可见，欲在氨基酸的色谱分离图。由图可见，欲在20min20min内将各组分内将各组分内将各组分内将各组分较好分离，需选择合适的色谱条件，表较好分离，需选择合适的色谱条件，表较好分离，需选择合适的色谱条件，表较好分离，需选择合适的色谱条件，表4.14.1列出了各种条件的改变导致个列出了各种条件的改变导致个列出了各种条件的改变导致个列出了各种条件的改变
20、导致个别组分位置的迁移及图谱的改善。别组分位置的迁移及图谱的改善。别组分位置的迁移及图谱的改善。别组分位置的迁移及图谱的改善。第九张，PPT共二十二页，创作于2022年6月第十张，PPT共二十二页，创作于2022年6月第三节第三节第三节第三节 影响影响影响影响N N端端端端EdmanEdman反应裂解率的因素反应裂解率的因素反应裂解率的因素反应裂解率的因素 在测序中往往可以发现，即使在测序中往往可以发现，即使在测序中往往可以发现，即使在测序中往往可以发现，即使N N端很均一的蛋白质端很均一的蛋白质端很均一的蛋白质端很均一的蛋白质(第一个循环出现单第一个循环出现单第一个循环出现单第一个循环出现单
21、个氨基酸残基个氨基酸残基个氨基酸残基个氨基酸残基)，经过十几个循环后背景明显不及第一个残基清晰。这是，经过十几个循环后背景明显不及第一个残基清晰。这是，经过十几个循环后背景明显不及第一个残基清晰。这是，经过十几个循环后背景明显不及第一个残基清晰。这是由于由于由于由于EdmanEdman反应是一个化学过程，在其耦联、裂解、转化等步骤都有可反应是一个化学过程，在其耦联、裂解、转化等步骤都有可反应是一个化学过程，在其耦联、裂解、转化等步骤都有可反应是一个化学过程，在其耦联、裂解、转化等步骤都有可能发生一些副反应，从而影响最终裂解效率。目前最佳产率为能发生一些副反应，从而影响最终裂解效率。目前最佳产率
22、为能发生一些副反应，从而影响最终裂解效率。目前最佳产率为能发生一些副反应，从而影响最终裂解效率。目前最佳产率为95959898。因此，经过。因此，经过。因此，经过。因此，经过5050次循环后，次循环后，次循环后，次循环后，PTHPTH氨基酸分析谱中将出现较多杂峰，氨基酸分析谱中将出现较多杂峰，氨基酸分析谱中将出现较多杂峰，氨基酸分析谱中将出现较多杂峰，影响正确辨认，也就是说对于一般蛋白质最多能分析至影响正确辨认，也就是说对于一般蛋白质最多能分析至影响正确辨认，也就是说对于一般蛋白质最多能分析至影响正确辨认，也就是说对于一般蛋白质最多能分析至N N端第端第端第端第5050个氨基个氨基个氨基个氨基
23、酸左右，欲知全顺序，则需将蛋白质降解成一系列肽段分析后再拼接。酸左右，欲知全顺序，则需将蛋白质降解成一系列肽段分析后再拼接。酸左右，欲知全顺序，则需将蛋白质降解成一系列肽段分析后再拼接。酸左右，欲知全顺序，则需将蛋白质降解成一系列肽段分析后再拼接。对于有些蛋白质由于含有较多的对对于有些蛋白质由于含有较多的对对于有些蛋白质由于含有较多的对对于有些蛋白质由于含有较多的对EdmanEdman反应敏感的残基或肽键，裂反应敏感的残基或肽键，裂反应敏感的残基或肽键，裂反应敏感的残基或肽键，裂解效率将更低。解效率将更低。解效率将更低。解效率将更低。循环至循环至循环至循环至SerSer和和和和ThrThr时产
24、率突然降低，这是因为在进行这两个氨基酸残基时产率突然降低，这是因为在进行这两个氨基酸残基时产率突然降低，这是因为在进行这两个氨基酸残基时产率突然降低，这是因为在进行这两个氨基酸残基分析前一个循环中，三氟乙酸除起裂解作用外，可能与分析前一个循环中，三氟乙酸除起裂解作用外，可能与分析前一个循环中，三氟乙酸除起裂解作用外，可能与分析前一个循环中，三氟乙酸除起裂解作用外，可能与SerSer和和和和ThrThr上的羟上的羟上的羟上的羟基反应，继而部分封闭基反应，继而部分封闭基反应，继而部分封闭基反应，继而部分封闭SerSer和和和和ThrThr的的的的N N端端端端氨基。氨基。氨基。氨基。另外，丝氨酸和
25、苏氨酸的另外，丝氨酸和苏氨酸的另外，丝氨酸和苏氨酸的另外，丝氨酸和苏氨酸的PTI-PTI-汀生物也会部分转化成其他产物，造汀生物也会部分转化成其他产物，造汀生物也会部分转化成其他产物，造汀生物也会部分转化成其他产物，造成产率的降低。成产率的降低。成产率的降低。成产率的降低。耦联试剂耦联试剂耦联试剂耦联试剂PITCPITC本身也将发生下列副反应，形成一些本身也将发生下列副反应，形成一些本身也将发生下列副反应，形成一些本身也将发生下列副反应，形成一些“杂质杂质杂质杂质”。测序完成。测序完成。测序完成。测序完成后，电脑将每个循环的产率处理，得出起始产率后，电脑将每个循环的产率处理，得出起始产率后，电
26、脑将每个循环的产率处理，得出起始产率后，电脑将每个循环的产率处理，得出起始产率(initial yield)(initial yield)和重复产和重复产和重复产和重复产率率率率 (repetitive yield)(repetitive yield)，其中通过起始产率可以估计蛋白质的真实含量，其中通过起始产率可以估计蛋白质的真实含量，其中通过起始产率可以估计蛋白质的真实含量，其中通过起始产率可以估计蛋白质的真实含量，有时可以推测有时可以推测有时可以推测有时可以推测N N端是否封闭端是否封闭端是否封闭端是否封闭(和氨基酸组成分析测得的含量相差甚远和氨基酸组成分析测得的含量相差甚远和氨基酸组成分
27、析测得的含量相差甚远和氨基酸组成分析测得的含量相差甚远)，而，而，而，而重复产率则表明机器是否正常运转。另外，如果蛋白质或多肽中含有重复产率则表明机器是否正常运转。另外，如果蛋白质或多肽中含有重复产率则表明机器是否正常运转。另外，如果蛋白质或多肽中含有重复产率则表明机器是否正常运转。另外，如果蛋白质或多肽中含有过多的过多的过多的过多的SerSer、ThrThr、GluGlu、TrpTrp等氨基酸残基，也将降低这两个数值。等氨基酸残基，也将降低这两个数值。等氨基酸残基，也将降低这两个数值。等氨基酸残基，也将降低这两个数值。第十一张，PPT共二十二页，创作于2022年6月第六节第六节第六节第六节
28、C C端序列分析端序列分析端序列分析端序列分析 虽然建立在虽然建立在虽然建立在虽然建立在EdmanEdman化学法上的自动化化学法上的自动化化学法上的自动化化学法上的自动化N N端测序技术日趋成熟，但仍端测序技术日趋成熟，但仍端测序技术日趋成熟，但仍端测序技术日趋成熟，但仍有不少问题需借助有不少问题需借助有不少问题需借助有不少问题需借助C C端序列分析来解决。端序列分析来解决。端序列分析来解决。端序列分析来解决。C C端测序尤其适合于基因重组蛋端测序尤其适合于基因重组蛋端测序尤其适合于基因重组蛋端测序尤其适合于基因重组蛋白是否正确表达的鉴定和大规模生产时的质量控制、白是否正确表达的鉴定和大规模
29、生产时的质量控制、白是否正确表达的鉴定和大规模生产时的质量控制、白是否正确表达的鉴定和大规模生产时的质量控制、N N端封闭蛋白的分端封闭蛋白的分端封闭蛋白的分端封闭蛋白的分析以及析以及析以及析以及DNADNA探针的设计。探针的设计。探针的设计。探针的设计。由于选择性对由于选择性对由于选择性对由于选择性对C C端羧基进行耦联修饰并从端羧基进行耦联修饰并从端羧基进行耦联修饰并从端羧基进行耦联修饰并从C C端逐一将氨基酸残基切下端逐一将氨基酸残基切下端逐一将氨基酸残基切下端逐一将氨基酸残基切下较较较较N N端测序困难，在过去的近端测序困难，在过去的近端测序困难，在过去的近端测序困难，在过去的近202
30、0年里，虽然为数不少的蛋白质化学家致年里，虽然为数不少的蛋白质化学家致年里，虽然为数不少的蛋白质化学家致年里，虽然为数不少的蛋白质化学家致力于力于力于力于C C端测序研究，但目前仍不能和端测序研究，但目前仍不能和端测序研究，但目前仍不能和端测序研究，但目前仍不能和N N端测序技术程度媲美。蛋白质化学端测序技术程度媲美。蛋白质化学端测序技术程度媲美。蛋白质化学端测序技术程度媲美。蛋白质化学工作者曾利用羧肽酶分析工作者曾利用羧肽酶分析工作者曾利用羧肽酶分析工作者曾利用羧肽酶分析C C端氨基酸残基，但是由于不同的羧肽酶对个端氨基酸残基，但是由于不同的羧肽酶对个端氨基酸残基，但是由于不同的羧肽酶对个端
31、氨基酸残基，但是由于不同的羧肽酶对个别氨基酸残基有选择性，使用时仍有一定困难。别氨基酸残基有选择性，使用时仍有一定困难。别氨基酸残基有选择性，使用时仍有一定困难。别氨基酸残基有选择性，使用时仍有一定困难。最近，由于对化学法测定最近，由于对化学法测定最近，由于对化学法测定最近，由于对化学法测定C C端技术进行了一系列改进，已有了自动化端技术进行了一系列改进，已有了自动化端技术进行了一系列改进，已有了自动化端技术进行了一系列改进，已有了自动化C C端序列仪问世。所以介绍一种自动化端序列仪问世。所以介绍一种自动化端序列仪问世。所以介绍一种自动化端序列仪问世。所以介绍一种自动化C C端测序方法的原理及
32、应用。端测序方法的原理及应用。端测序方法的原理及应用。端测序方法的原理及应用。第十二张，PPT共二十二页，创作于2022年6月一、一、一、一、C C端分析原理端分析原理端分析原理端分析原理 基于与基于与基于与基于与N N端端端端EdmanEdman降解类似的原理，降解类似的原理，降解类似的原理，降解类似的原理，C C端分析采用化学试端分析采用化学试端分析采用化学试端分析采用化学试剂与蛋白质和多肽的剂与蛋白质和多肽的剂与蛋白质和多肽的剂与蛋白质和多肽的 羧基反应，反应后的羧基反应，反应后的羧基反应，反应后的羧基反应，反应后的C C端衍生物被端衍生物被端衍生物被端衍生物被切割下来，通过切割下来，通
33、过切割下来，通过切割下来，通过HPLCHPLC系统进行分离分析。系统进行分离分析。系统进行分离分析。系统进行分离分析。一个完整的一个完整的一个完整的一个完整的C C端序列分析包括以下几个步骤：端序列分析包括以下几个步骤：端序列分析包括以下几个步骤：端序列分析包括以下几个步骤：(1)(1)活化活化活化活化 蛋白质和多肽蛋白质和多肽蛋白质和多肽蛋白质和多肽C C端的自由羧基与乙酸酐反应生成混合酸酐，并进一步端的自由羧基与乙酸酐反应生成混合酸酐，并进一步端的自由羧基与乙酸酐反应生成混合酸酐，并进一步端的自由羧基与乙酸酐反应生成混合酸酐，并进一步环化成嗯唑酮，而侧链上的羧基形成的混合酸酐难以成环。环化
34、成嗯唑酮，而侧链上的羧基形成的混合酸酐难以成环。环化成嗯唑酮，而侧链上的羧基形成的混合酸酐难以成环。环化成嗯唑酮，而侧链上的羧基形成的混合酸酐难以成环。C C端的嗯唑端的嗯唑端的嗯唑端的嗯唑酮在硫氰四丁铵的作用下，转化为乙内酰硫脲酮在硫氰四丁铵的作用下，转化为乙内酰硫脲酮在硫氰四丁铵的作用下，转化为乙内酰硫脲酮在硫氰四丁铵的作用下，转化为乙内酰硫脲(thiohydantoin(thiohydantoin，TH)TH)。第十三张，PPT共二十二页，创作于2022年6月(2)(2)酰胺化保护侧链羧基酰胺化保护侧链羧基酰胺化保护侧链羧基酰胺化保护侧链羧基 侧链羧基形成混合酸酐后，与硫氰哌啶进一步作用
35、形成酰侧链羧基形成混合酸酐后，与硫氰哌啶进一步作用形成酰侧链羧基形成混合酸酐后，与硫氰哌啶进一步作用形成酰侧链羧基形成混合酸酐后，与硫氰哌啶进一步作用形成酰胺，以保护侧链。胺，以保护侧链。胺，以保护侧链。胺，以保护侧链。第十四张，PPT共二十二页，创作于2022年6月(3)(3)烷基化烷基化烷基化烷基化 由于由于由于由于C C端环化形成的端环化形成的端环化形成的端环化形成的THTH衍生物较为稳定而不易被切割，因衍生物较为稳定而不易被切割，因衍生物较为稳定而不易被切割，因衍生物较为稳定而不易被切割，因此产率不高。用溴甲基萘选择性地烷基化修饰硫原子，形成此产率不高。用溴甲基萘选择性地烷基化修饰硫原
36、子，形成此产率不高。用溴甲基萘选择性地烷基化修饰硫原子，形成此产率不高。用溴甲基萘选择性地烷基化修饰硫原子，形成Alkylated-TH(ATH)Alkylated-TH(ATH)衍生物，裂解产率将大大提高。衍生物，裂解产率将大大提高。衍生物，裂解产率将大大提高。衍生物，裂解产率将大大提高。第十五张，PPT共二十二页，创作于2022年6月(4)(4)修饰修饰修饰修饰ThrThr和和和和SerSer的羟基的羟基的羟基的羟基 蛋白质和多肽中的羟基会干扰测序，因此需要修饰。在活蛋白质和多肽中的羟基会干扰测序，因此需要修饰。在活蛋白质和多肽中的羟基会干扰测序，因此需要修饰。在活蛋白质和多肽中的羟基会干
37、扰测序，因此需要修饰。在活化过程中，乙酸酐也会与羟基反应将其乙酰化，但反应不完化过程中，乙酸酐也会与羟基反应将其乙酰化，但反应不完化过程中，乙酸酐也会与羟基反应将其乙酰化，但反应不完化过程中，乙酸酐也会与羟基反应将其乙酰化，但反应不完全，在全，在全，在全，在NN甲基咪唑甲基咪唑甲基咪唑甲基咪唑(NMl)(NMl)和乙酸酐的共同作用下，和乙酸酐的共同作用下，和乙酸酐的共同作用下，和乙酸酐的共同作用下，ThrThr和和和和SerSer上的羟基基本被乙酰化。上的羟基基本被乙酰化。上的羟基基本被乙酰化。上的羟基基本被乙酰化。第十六张，PPT共二十二页，创作于2022年6月(5)(5)裂解和衍生裂解和衍
38、生裂解和衍生裂解和衍生 C C端的端的端的端的ATHATH衍生物在酸性条件下与衍生物在酸性条件下与衍生物在酸性条件下与衍生物在酸性条件下与NCSNCS反应而被反应而被反应而被反应而被裂解生成裂解生成裂解生成裂解生成ATHATH氨基酸，新的氨基酸，新的氨基酸，新的氨基酸，新的C C端自动形成端自动形成端自动形成端自动形成THTH，而不必重新，而不必重新，而不必重新，而不必重新活化。活化。活化。活化。因此，整个测序过程只需在开始时对因此，整个测序过程只需在开始时对因此，整个测序过程只需在开始时对因此，整个测序过程只需在开始时对C C端进行一次性活端进行一次性活端进行一次性活端进行一次性活化，并修饰
39、化，并修饰化，并修饰化，并修饰AspAsp和和和和GluGlu侧链羧基以及侧链羧基以及侧链羧基以及侧链羧基以及TheThe和和和和SerSer的羟基。实的羟基。实的羟基。实的羟基。实际上，循环反应的只有烷基化和裂解两步，其全过程图解如际上，循环反应的只有烷基化和裂解两步，其全过程图解如际上，循环反应的只有烷基化和裂解两步，其全过程图解如际上，循环反应的只有烷基化和裂解两步，其全过程图解如下图。下图。下图。下图。第十七张，PPT共二十二页，创作于2022年6月二、二、二、二、C C端蛋白质序列仪端蛋白质序列仪端蛋白质序列仪端蛋白质序列仪 近年来，已有商品化的近年来，已有商品化的近年来，已有商品化
40、的近年来，已有商品化的C C端序列仪问世。端序列仪问世。端序列仪问世。端序列仪问世。C C端序列仪一般端序列仪一般端序列仪一般端序列仪一般由由由由N N端序列仪改装而成，其基本结构与后者相似，两者的不端序列仪改装而成，其基本结构与后者相似，两者的不端序列仪改装而成，其基本结构与后者相似，两者的不端序列仪改装而成，其基本结构与后者相似，两者的不同之处主要在于：同之处主要在于：同之处主要在于：同之处主要在于：反应所用的试剂不同，因此两者不可兼容，否则极易堵反应所用的试剂不同，因此两者不可兼容，否则极易堵反应所用的试剂不同，因此两者不可兼容，否则极易堵反应所用的试剂不同，因此两者不可兼容，否则极易堵
41、塞管道；塞管道；塞管道；塞管道；在在在在C C端序列仪中，所有的化学反应均在弹筒型反应室中端序列仪中，所有的化学反应均在弹筒型反应室中端序列仪中，所有的化学反应均在弹筒型反应室中端序列仪中，所有的化学反应均在弹筒型反应室中进行，切割下来的进行，切割下来的进行，切割下来的进行，切割下来的ATHAAATHAA仅在转化腔内干燥和溶解后即仅在转化腔内干燥和溶解后即仅在转化腔内干燥和溶解后即仅在转化腔内干燥和溶解后即进入进入进入进入HPLCHPLC系统分离分析；而在系统分离分析；而在系统分离分析；而在系统分离分析；而在N N端测序仪中，端测序仪中，端测序仪中，端测序仪中，ATZ AAATZ AA需需需需
42、在转化腔中转化为在转化腔中转化为在转化腔中转化为在转化腔中转化为PTH-AAPTH-AA。第十八张，PPT共二十二页，创作于2022年6月第十九张，PPT共二十二页，创作于2022年6月 四、影响四、影响四、影响四、影响C C端测序反应产率的因素端测序反应产率的因素端测序反应产率的因素端测序反应产率的因素 C C端测序副反应较多，最高初始产率仅为端测序副反应较多，最高初始产率仅为端测序副反应较多，最高初始产率仅为端测序副反应较多，最高初始产率仅为2020，而对于，而对于，而对于，而对于GluGlu，AspAsp，SerSer，ThrThr等氨基酸，其产率将更低。如等氨基酸，其产率将更低。如等氨
43、基酸，其产率将更低。如等氨基酸，其产率将更低。如C C端富含上述几种氨基酸，测序端富含上述几种氨基酸，测序端富含上述几种氨基酸，测序端富含上述几种氨基酸，测序将十分困难。另外，一旦遇到将十分困难。另外，一旦遇到将十分困难。另外，一旦遇到将十分困难。另外，一旦遇到ProPro，由于吡咯环的存在而不能与乙酸酐，由于吡咯环的存在而不能与乙酸酐，由于吡咯环的存在而不能与乙酸酐，由于吡咯环的存在而不能与乙酸酐反应成环，整个测序过程将终止。反应成环，整个测序过程将终止。反应成环，整个测序过程将终止。反应成环，整个测序过程将终止。到目前为止，到目前为止，到目前为止，到目前为止，C C端测序可测端测序可测端测
44、序可测端测序可测1 11010个残基，一次测序需要的量比个残基，一次测序需要的量比个残基，一次测序需要的量比个残基，一次测序需要的量比N N端测端测端测端测序要大得多，至少需序要大得多，至少需序要大得多，至少需序要大得多，至少需1nmol1nmol。此外，因为不同的氨基酸反应产率不同，所以，对图谱的分析也比此外，因为不同的氨基酸反应产率不同，所以，对图谱的分析也比此外，因为不同的氨基酸反应产率不同，所以，对图谱的分析也比此外，因为不同的氨基酸反应产率不同，所以，对图谱的分析也比N N端测序复杂，需要较多的经验。目前端测序复杂，需要较多的经验。目前端测序复杂，需要较多的经验。目前端测序复杂，需要
45、较多的经验。目前C C端测序结果最好的一个样品是马端测序结果最好的一个样品是马端测序结果最好的一个样品是马端测序结果最好的一个样品是马肌红蛋白原，可测肌红蛋白原，可测肌红蛋白原，可测肌红蛋白原，可测C C端端端端1010个以上残基，通常将其作为标准样品来判断仪个以上残基，通常将其作为标准样品来判断仪个以上残基，通常将其作为标准样品来判断仪个以上残基，通常将其作为标准样品来判断仪器的稳定性。器的稳定性。器的稳定性。器的稳定性。另外，由于副反应的存在，有的氨基酸将生成不止一种另外，由于副反应的存在，有的氨基酸将生成不止一种另外，由于副反应的存在，有的氨基酸将生成不止一种另外，由于副反应的存在，有的
46、氨基酸将生成不止一种ATHATH衍生物。衍生物。衍生物。衍生物。如如如如ArgArg的的的的ATHATH衍生物可能被乙酰化或烷化；衍生物可能被乙酰化或烷化；衍生物可能被乙酰化或烷化；衍生物可能被乙酰化或烷化；Tyr-ATHTyr-ATH可被乙酰化；可被乙酰化；可被乙酰化；可被乙酰化；CysCys被修饰后将形成丙烯酰胺化的被修饰后将形成丙烯酰胺化的被修饰后将形成丙烯酰胺化的被修饰后将形成丙烯酰胺化的Cys-ATHCys-ATH以及脱氢以及脱氢以及脱氢以及脱氢Ala-ATHAla-ATH；脱水；脱水；脱水；脱水Thr-Thr-ATHATH将产生两个非对映异构体。将产生两个非对映异构体。将产生两个非
47、对映异构体。将产生两个非对映异构体。第二十张，PPT共二十二页，创作于2022年6月五、结语和展望五、结语和展望五、结语和展望五、结语和展望 目前，目前，目前，目前，C C端序列测序技术已初步成熟，并开始发挥作用。但其反应的端序列测序技术已初步成熟，并开始发挥作用。但其反应的端序列测序技术已初步成熟，并开始发挥作用。但其反应的端序列测序技术已初步成熟，并开始发挥作用。但其反应的效率与效率与效率与效率与N N端端端端EdmanEdman降解测序法有一定的差距。降解测序法有一定的差距。降解测序法有一定的差距。降解测序法有一定的差距。因此，目前的主要问题是如何提高反应的产率，特别是如何改善因此，目前
48、的主要问题是如何提高反应的产率，特别是如何改善因此，目前的主要问题是如何提高反应的产率，特别是如何改善因此，目前的主要问题是如何提高反应的产率，特别是如何改善T T，S S，D D，E E几种氨基酸的测定，以及如何解决几种氨基酸的测定，以及如何解决几种氨基酸的测定，以及如何解决几种氨基酸的测定，以及如何解决P P终止测序的问题。如果在终止测序的问题。如果在终止测序的问题。如果在终止测序的问题。如果在上述几方面取得进展，将使上述几方面取得进展，将使上述几方面取得进展，将使上述几方面取得进展，将使C C端可测残基数大大增加，并减少样品所需端可测残基数大大增加，并减少样品所需端可测残基数大大增加，并
49、减少样品所需端可测残基数大大增加，并减少样品所需量。另外，近年来发现，很多活性多肽的量。另外，近年来发现，很多活性多肽的量。另外，近年来发现，很多活性多肽的量。另外，近年来发现，很多活性多肽的C C端是酰胺化的，如果能检测端是酰胺化的，如果能检测端是酰胺化的，如果能检测端是酰胺化的，如果能检测酰胺化的酰胺化的酰胺化的酰胺化的C C端残基，将对活性多肽的研究有很大的帮助。端残基，将对活性多肽的研究有很大的帮助。端残基，将对活性多肽的研究有很大的帮助。端残基，将对活性多肽的研究有很大的帮助。C C端测序技术仍处于研究和发展阶段，虽然该技术还不尽完善，但对端测序技术仍处于研究和发展阶段，虽然该技术还
50、不尽完善，但对端测序技术仍处于研究和发展阶段，虽然该技术还不尽完善，但对端测序技术仍处于研究和发展阶段，虽然该技术还不尽完善，但对于确认表达蛋白的于确认表达蛋白的于确认表达蛋白的于确认表达蛋白的C C端是否正确，以及判断在表达、纯化过程中是否发端是否正确，以及判断在表达、纯化过程中是否发端是否正确，以及判断在表达、纯化过程中是否发端是否正确，以及判断在表达、纯化过程中是否发生了不必要的加工大有帮助。生了不必要的加工大有帮助。生了不必要的加工大有帮助。生了不必要的加工大有帮助。第二十一张，PPT共二十二页，创作于2022年6月感感谢谢大大家家观观看看第二十二张，PPT共二十二页，创作于2022年