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1、第十三章 酶类药物的分析1本讲稿第一页，共五十九页第一节第一节 概述概述n在在生生物物体体内内，酶酶能能降降低低生生化化反反应应活活化化能能，加加快快可可逆逆反反应应的进行速度，使之尽快达到平衡。的进行速度，使之尽快达到平衡。n一、酶的特性一、酶的特性n二、酶的分类二、酶的分类n三、酶的化学组成三、酶的化学组成n四、酶的催化反应机制四、酶的催化反应机制n五、酶催化反应动力学五、酶催化反应动力学2本讲稿第二页，共五十九页一、酶的特性一、酶的特性 1酶是高效催化剂。酶是高效催化剂。n2酶对底物的结构具有严格的选择性。酶对底物的结构具有严格的选择性。n（1）相对专一性：）相对专一性：n（2）绝对专一
2、性）绝对专一性:n（3）立体异构专一性）立体异构专一性:n3酶催化反应的反应条件温和。酶催化反应的反应条件温和。n4酶的催化活性在生物体内受多种因素的调节酶的催化活性在生物体内受多种因素的调节。3本讲稿第三页，共五十九页二、酶的分类二、酶的分类n氧化还原酶氧化还原酶n转移酶转移酶n水解酶水解酶n裂合酶裂合酶n异构酶异构酶n合成酶（或称连接酶）合成酶（或称连接酶）4本讲稿第四页，共五十九页三、酶的化学组成三、酶的化学组成 n分为分为简单酶和结合酶简单酶和结合酶两大类。两大类。n结结合合酶酶类类中中除除含含有有蛋蛋白白外外，还还含含有有某某种种热热稳稳定定的的非非蛋蛋白白质质的的小小分分子子物物质
3、质，二二者者结结合合起起来来，称称为为“全全酶酶”，才呈现生物催化活性。，才呈现生物催化活性。n结合酶结合酶 =酶蛋白酶蛋白+辅助因子辅助因子5本讲稿第五页，共五十九页四、酶的催化反应机制四、酶的催化反应机制 n1酶酶-底底物物复复合合物物的的形形成成 在在酶酶促促反反应应中中，反反应应底底物物首首先先与与酶酶分分子子上上活活性性部部位位结结合合，形形成成酶酶-底底物物复复合合物物，降低反应的降低反应的活性能活性能，使酶促反应顺利进行。，使酶促反应顺利进行。n2酶酶-底物复合物加速反应速率的原因底物复合物加速反应速率的原因n（1）定向作用与底物浓缩）定向作用与底物浓缩 n（2）酶使底物分子变形
4、）酶使底物分子变形 n（3）酸碱催化）酸碱催化n（4）共价催化）共价催化。6本讲稿第六页，共五十九页五、酶催化反应动力学五、酶催化反应动力学 n酶酶的的活活力力单单位位 酶酶活活性性单单位位（U）是是酶酶活活性性高高低低的一种量度，用的一种量度，用U/g或或U/ml表示。表示。n酶酶活活力力单单位位定定义义：在在规规定定的的条条件件下下，每每分分钟钟能能转转化化1mol底底物物所所需需要要的的酶酶量量，称称一一个个酶酶的的活力单位。活力单位。n酶酶的的比比活活力力 每每毫毫克克酶酶蛋蛋白白所所含含酶酶活活力力，U/mg。7本讲稿第七页，共五十九页Michaelis-MentenMichaeli
5、s-Menten快速平衡学说快速平衡学说n底底物物浓浓度度的的增增加加，反反应应速速度度上升呈上升呈双曲线双曲线。n在在低低底底物物浓浓度度时时，反反应应速速度度呈呈直直线线上上升升，表表现现为为一一级级反应反应。n在在高高浓浓度度时时，反反应应速速度度达达到到一个极限值，呈现一个极限值，呈现零级反应零级反应。8本讲稿第八页，共五十九页米氏方程米氏方程n酶反应动力学方程式：酶反应动力学方程式：nV反应初速度反应初速度nVm最大反应速度最大反应速度nKs 米米氏氏常常数数，Ks=K1/K1，Ks为为ES的的解解离离常常数数，表表示示酶与底物的亲和力酶与底物的亲和力。nKs为为反反应应速速度度V是
6、是最最大大反反应应速速度度Vm一一半半时时所所需需底底物物浓浓度度，即即V=1/2 Vm时，时，Ks=S。9本讲稿第九页，共五十九页Briggs-Haldane稳态学说稳态学说 nES的的形形成成速速度度与与ES的的解解离离速速度度相相等等，达达到到动动态态平平衡衡，即即“稳态稳态”，反应方程式：，反应方程式：nKm取代了取代了Ks，当当V=1/2 Vm时，时，Km=S。nKm也可表示为底物与酶的亲和力。也可表示为底物与酶的亲和力。10本讲稿第十页，共五十九页第二节第二节 酶类药物的鉴别与检查酶类药物的鉴别与检查n鉴别方法常用鉴别方法常用蛋白质鉴别方法蛋白质鉴别方法，如在碱性条件下的，如在碱性
7、条件下的双缩脲反应。双缩脲反应。n专用于酶的鉴别方法：专用于酶的鉴别方法：n 酶活性试验：与特异性底物反应（酶活性试验：与特异性底物反应（胰蛋白酶胰蛋白酶）。）。n 沉淀试验沉淀试验：胃蛋白酶胃蛋白酶n 动物试验：动物试验：透明质酸酶透明质酸酶水解粘多糖。水解粘多糖。11本讲稿第十一页，共五十九页酶类药物的检查酶类药物的检查 n酶酶类类药药物物是是生生化化产产品品和和微微生生物物发发酵酵产产品品，在在生生产产过过程程中中可可能能带带入入微微量量的的脂脂肪肪类类物物质质、其其他他的的酶酶类类和和大分子杂质大分子杂质，影响酶质量，需有含量限度。，影响酶质量，需有含量限度。12本讲稿第十二页，共五十
8、九页酶类药物的检查酶类药物的检查n（一）脂肪含量限度检查一）脂肪含量限度检查n检检查查方方法法，乙乙醚醚浸浸提提，干干燥燥，精精密密称称定定，脂脂肪肪不不得得过规定的含量过规定的含量。n（二）其他酶类含量限度检查二）其他酶类含量限度检查n胰胰蛋蛋白白酶酶、糜糜蛋蛋白白酶酶均均是是从从牛牛、猪猪的的胰胰脏脏中中提提取取的的蛋蛋白白分分解解酶酶。提提取取胰胰蛋蛋白白酶酶时时又又易易带带入入微微量量的的糜糜蛋蛋白白酶酶。n（三）大分子活性物质含量限度检查（三）大分子活性物质含量限度检查13本讲稿第十三页，共五十九页胰蛋白酶制品中糜蛋白酶的含量胰蛋白酶制品中糜蛋白酶的含量n每每2500U胰蛋白酶中不得
9、多于胰蛋白酶中不得多于50U的糜蛋白酶。的糜蛋白酶。n糜蛋白酶专属水解糜蛋白酶专属水解芳香氨基酸芳香氨基酸（L-酪氨酸、酪氨酸、L-苯丙氨苯丙氨酸）酸）的羧基形成的肽键、酰胺键和酯键的羧基形成的肽键、酰胺键和酯键。n用用N-乙酰乙酰-L-酪氨酸乙酯酪氨酸乙酯（N-Acetyl-L-Tyrosine Ethylester，ATEE）作底物，通过分光光度法测定作底物，通过分光光度法测定此此酶对底物的水解速率酶对底物的水解速率来检查该酶的含量限度。来检查该酶的含量限度。14本讲稿第十四页，共五十九页第三节第三节酶活力测定方法酶活力测定方法n固定时间法固定时间法 n连续监测法连续监测法 n（一）、需（
10、一）、需NAD+或或NADP+作指示的连续监测法：作指示的连续监测法：n直接测定法直接测定法 n偶联法偶联法n三联酶活测定三联酶活测定n（二）、不需（二）、不需NAD+或或NADP+作指示的连续监测法：作指示的连续监测法：n固定浓度法固定浓度法 15本讲稿第十五页，共五十九页一、固定时间法一、固定时间法 n在适宜的条件下，使酶和底物共同保温在适宜的条件下，使酶和底物共同保温一定时间一定时间，然后测定然后测定产物生成的量产物生成的量或或底物消耗的量底物消耗的量从而间接推从而间接推算出酶的含量（或活力）。算出酶的含量（或活力）。n nE表表示示酶酶浓浓度度，P为为反反应应产产物物浓浓度度，t 表表
11、示示酶酶作用时间，作用时间，K为常数。为常数。16本讲稿第十六页，共五十九页注意事项注意事项n缺缺点点：无无法法了了解解整整个个反反应应过过程是否都是零级反应。程是否都是零级反应。n注意事项：注意事项：n1、底物饱和、底物饱和n2、时间、时间17本讲稿第十七页，共五十九页二、连续监测法二、连续监测法 n在酶反应过程中，在酶反应过程中，连续记录不同时间的底物消耗量或产物连续记录不同时间的底物消耗量或产物生成量生成量。n（一）、需（一）、需NAD+或或NADP+作指示的连续监测法作指示的连续监测法n（二）、不需（二）、不需NAD+或或NADP+作指示的连续监测法作指示的连续监测法18本讲稿第十八页
12、，共五十九页（一）、需（一）、需NAD+或或NADP+作指示的连续监测法：作指示的连续监测法：n还原型辅酶（还原型辅酶（NADH和和NADPH）在在340nm处有紫外吸处有紫外吸收收，氧化型辅酶（，氧化型辅酶（NAD+和和NADP+）在在340nm处无紫处无紫外吸收外吸收.n利用利用340nm处每分钟处每分钟吸收度升高或降低的速率吸收度升高或降低的速率与酶活与酶活性成正比的关系，推算出酶的活力单位。性成正比的关系，推算出酶的活力单位。n包括：包括：n直接测定法直接测定法 n偶联法偶联法n三联酶活测定三联酶活测定19本讲稿第十九页，共五十九页直接测定法直接测定法n大大多多数数需需NADH（NAD
13、PH）参参加加的的脱脱氢氢酶酶，可可利利用用紫紫外外分分光光光光度度法法直直接接测测定定反反应应体体系系在在340nm处处吸吸收度的变化收度的变化，计算酶活力单位。，计算酶活力单位。n丙酮酸丙酮酸NADHH+乳酸乳酸NAD+n340nm处处吸吸收收度度降降低低的的速速率率与与NADH的的氧氧化化速速率率成成正比，正比，与与LDH的活力成正比的活力成正比。20本讲稿第二十页，共五十九页偶联法偶联法n此类酶催化反应不需此类酶催化反应不需NAD+或或NADP+，但当与需但当与需NAD+或或NADP+的脱氢酶反应偶联的脱氢酶反应偶联以后，能用以后，能用紫外紫外分光光度法测分光光度法测定定.n由脱氢酶引
14、起的反应为由脱氢酶引起的反应为指示反应指示反应，脱氢酶是指示酶，指示，脱氢酶是指示酶，指示酶活力要比测定酶活力至少大酶活力要比测定酶活力至少大100倍倍。n例如：谷草转氨酶的测定：例如：谷草转氨酶的测定：21本讲稿第二十一页，共五十九页三联酶活测定三联酶活测定n引引入入一一个个辅辅助助酶酶反反应应，将将被被测测酶酶反反应应系系统统与与指指示示酶酶反反应应系系统统联联系系起起来来，组组成成一一个个“三三合合一一”酶酶反反应应系系统统，使使底底物物转转化化率率、辅辅助助酶酶反反应应和和NADH（NADPH）氧氧化化速速率率之之间间成成正正比比函函数数关关系系，辅辅助助酶酶和和指指示示酶酶的的活力必
15、须大大超过测定酶活力活力必须大大超过测定酶活力。n例如：磷酸肌酸例如：磷酸肌酸+ADP 肌酸肌酸ATP (1)n葡萄糖葡萄糖ATP G-6-P ADP (2)nG-6-P +NADP+葡萄糖酸葡萄糖酸-6-磷酸磷酸 NADPH H+(3)n(1)被被测测反反应应，(2)辅辅助助反反应应，HK（己己糖糖激激酶酶）辅辅助助酶酶，(3)指指示示反反应应，G-6-PDH（6磷酸葡萄糖脱氢酶）指示酶。磷酸葡萄糖脱氢酶）指示酶。22本讲稿第二十二页，共五十九页（二）不需（二）不需NAD+或或NADP+指示的连续监测指示的连续监测法：法：n酶底物大多是人工合成的酶底物大多是人工合成的“色素元色素元”，其本身
16、无，其本身无色，经色，经酶作用后释放出有色的反应产物酶作用后释放出有色的反应产物。根据反。根据反应过程中吸收度增高速率，算出酶活力单位。应过程中吸收度增高速率，算出酶活力单位。n例如：例如：n磷酸对硝基苯酚酯磷酸对硝基苯酚酯 对硝基苯酚对硝基苯酚23本讲稿第二十三页，共五十九页三、固定浓度法三、固定浓度法n根根据据酶酶催催化化反反应应，使使反反应应产产物物达达到到额额定定的的浓浓度度时时其其反应时间与酶浓度成反比反应时间与酶浓度成反比的原理进行设计的。的原理进行设计的。n P=KEtn测定时间测定时间.n以以所所需需时时间间的的倒倒数数（1/t）对对酶酶浓浓度度作作图图即即可可制制备标准曲线。
17、备标准曲线。n优点：优点：1、记录时间。、记录时间。2、准确、准确24本讲稿第二十四页，共五十九页二、底物与产物的测定方法二、底物与产物的测定方法（酶反应的检测方酶反应的检测方法法）1、化学方法化学方法：用化学法测定其中某一底物或产物的变化值。：用化学法测定其中某一底物或产物的变化值。n2、分光光度法分光光度法：常用的有常用的有比色法比色法和和紫外分光光度法紫外分光光度法。n3、荧光测定法：荧光测定法：简单、灵敏、快速简单、灵敏、快速。n4、电化学分析法电化学分析法n（1）离子选择性电极分析法离子选择性电极分析法n（2）微电流法微电流法n5、其他方法其他方法n如测定气体的测压法，测定产物旋光度
18、变化值的旋光测定法。如测定气体的测压法，测定产物旋光度变化值的旋光测定法。25本讲稿第二十五页，共五十九页第五节第五节 酶类药物的检测酶类药物的检测 n肽键水解酶肽键水解酶 n1、胰蛋白酶胰蛋白酶n2、弹性蛋白酶弹性蛋白酶n3、尿激酶尿激酶（气泡上升法气泡上升法）n脂键水解酶脂键水解酶胰脂肪酶胰脂肪酶 n糖苷键水解酶糖苷键水解酶 溶菌酶溶菌酶n其它其它（超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶）26本讲稿第二十六页，共五十九页一、肽键水解酶一、肽键水解酶n1、胰蛋白酶、胰蛋白酶n2、弹性蛋白酶、弹性蛋白酶n3、尿激酶、尿激酶27本讲稿第二十七页，共五十九页1、胰蛋白酶、胰蛋白酶比色法比色法n胰胰蛋蛋白白酶
19、酶：由由牛牛、羊羊、猪猪等等动动物物的的胰胰脏脏中中提提取取的的一一种种蛋白水解酶蛋白水解酶。n牛牛胰胰蛋蛋白白酶酶：233个个氨氨基基酸酸，分分子子量量24000，等等电电点点10.1。n猪猪胰胰蛋蛋白白酶酶：214个个氨氨基基酸酸，分分子子量量23400，等等电电点点10.8。n胰胰蛋蛋白白酶酶最最适适pH为为7.68.0，电电泳泳纯纯的的胰胰蛋蛋白白酶酶的的比活为比活为8000单位单位/mg。28本讲稿第二十八页，共五十九页原理原理n胰胰蛋蛋白白酶酶专专一一作作用用于于赖赖氨氨酸酸、精精氨氨酸酸等等碱碱性性氨氨基基酸酸的的羧羧基基组组成的成的肽键、酰胺键及酯键肽键、酰胺键及酯键，水解速度
20、为酯键，水解速度为酯键酰胺键酰胺键肽键。肽键。nBAEE(Benzoyl-L-Arginine-Ethyl-Ester)nBAA(Benzoyl-L-Arginine-Anide)n苯苯甲甲酰酰L精精氨氨酸酸乙乙酯酯（BAEE）在在胰胰蛋蛋白白酶酶的的作作用用下下，酯酯键键被被水水解解生生成成苯苯甲甲酰酰L精精氨氨酸酸，在在253nm波波长长处处的的吸吸收收度度随酶促反应递增，根据活力单位定义计算酶活力。随酶促反应递增，根据活力单位定义计算酶活力。29本讲稿第二十九页，共五十九页测定法：测定法：n取呈取呈直线的吸收度直线的吸收度，按下式计算：，按下式计算：nP为为每每mg供试中含胰蛋白酶的量供
21、试中含胰蛋白酶的量，U；A1为直为直线上终止的吸收度；线上终止的吸收度；nA2为直线上开始的吸收度；为直线上开始的吸收度；nT为为A1至至A2读数的时间，读数的时间，min；nW为测定液中供试品的量，为测定液中供试品的量，mg；n吸收度每分钟改变吸收度每分钟改变0.003，即相当于，即相当于1个胰个胰蛋白酶单位蛋白酶单位。30本讲稿第三十页，共五十九页 2、胰胰弹性蛋白酶弹性蛋白酶n胰弹性蛋白酶：胰弹性蛋白酶：为肽链内断酶为肽链内断酶，存在于哺乳动物胰，存在于哺乳动物胰脏。脏。n弹性酶用于治疗高血脂症、动脉粥样硬化和脂肪弹性酶用于治疗高血脂症、动脉粥样硬化和脂肪肝。肝。n胰弹性蛋白酶是由胰弹性
22、蛋白酶是由240个氨基酸组成的单一肽链，个氨基酸组成的单一肽链，有四对二硫键。分子量为有四对二硫键。分子量为25900，等电点为等电点为pH9.5。n胰弹性蛋白酶除水解弹性蛋白外，还可以水解血红蛋胰弹性蛋白酶除水解弹性蛋白外，还可以水解血红蛋白、酪蛋白等蛋白。白、酪蛋白等蛋白。n刚果红弹性蛋白刚果红弹性蛋白。31本讲稿第三十一页，共五十九页原理原理n刚果红弹性蛋白法刚果红弹性蛋白法：以刚果红弹性蛋白为底物，由于刚果：以刚果红弹性蛋白为底物，由于刚果红弹性蛋白酶结合的共价键能被弹性酶水解，根据红弹性蛋白酶结合的共价键能被弹性酶水解，根据刚果红在刚果红在495nm处有最大吸收，由标准曲线即可查得弹
23、性酶单位数。处有最大吸收，由标准曲线即可查得弹性酶单位数。n单位：单位：20分钟水解分钟水解1mg刚果红弹性蛋白所需的酶量为一个弹刚果红弹性蛋白所需的酶量为一个弹性酶活力单位。性酶活力单位。32本讲稿第三十二页，共五十九页方法方法:n 33本讲稿第三十三页，共五十九页3、尿激酶、尿激酶n由人尿中分离提纯后制得的一种碱性蛋白水解酶。由人尿中分离提纯后制得的一种碱性蛋白水解酶。n主要作用是激活人体内主要作用是激活人体内纤维蛋白溶解酶原纤维蛋白溶解酶原使其成为有使其成为有活性的纤维蛋白溶酶活性的纤维蛋白溶酶，从而解聚血纤维蛋白，溶解血栓。，从而解聚血纤维蛋白，溶解血栓。n天然尿激酶的分子量为天然尿激
24、酶的分子量为54000，其作用于纤维蛋白溶其作用于纤维蛋白溶解酶原的赖氨酸或精氨酸键使其裂解成纤维蛋白溶解酶解酶原的赖氨酸或精氨酸键使其裂解成纤维蛋白溶解酶。34本讲稿第三十四页，共五十九页效价测定原理效价测定原理(气泡上升法气泡上升法)n尿激酶尿激酶激活人体内激活人体内纤维蛋白溶解酶原纤维蛋白溶解酶原使其转化成使其转化成纤维蛋白溶酶纤维蛋白溶酶；n纤维蛋白原纤维蛋白原在在凝血酶凝血酶的作用下，转变成的作用下，转变成纤维蛋白凝块纤维蛋白凝块，此凝块在，此凝块在纤维蛋白溶酶纤维蛋白溶酶作作用下，水解为可溶性小分子多肽。用下，水解为可溶性小分子多肽。n在在纤维蛋白溶酶原纤维蛋白溶酶原过量的情况下，
25、过量的情况下，尿激酶量尿激酶量与与纤维蛋白凝块的溶解时间纤维蛋白凝块的溶解时间的对数成的对数成直线关系。直线关系。35本讲稿第三十五页，共五十九页操作操作n试管中加试管中加纤维蛋白原溶液纤维蛋白原溶液0.3ml（37水浴）水浴）n标准品溶液标准品溶液1.0mln加混合溶液加混合溶液0.4mln立即摇匀计时，立即摇匀计时，反应系统应在反应系统应在3045秒内凝结秒内凝结，当，当凝凝块内小气泡上升到系统体积一半时块内小气泡上升到系统体积一半时作为反应终点。作为反应终点。n以尿激酶的浓度为横坐标，以反应时间的对数为纵坐标。以尿激酶的浓度为横坐标，以反应时间的对数为纵坐标。36本讲稿第三十六页，共五十
26、九页二、脂键水解酶二、脂键水解酶胰脂肪酶胰脂肪酶n胰脂肪酶是一种水解酶，在一定条件下把胰脂肪酶是一种水解酶，在一定条件下把甘油甘油三脂类脂肪三脂类脂肪逐步水解，最后生成逐步水解，最后生成甘油及相应的脂甘油及相应的脂肪酸肪酸。n底物底物:橄榄油橄榄油npH指示连续滴定法：稳定指示连续滴定法：稳定pH条件下避免因条件下避免因pH值值改变而引起酶活力的改变。改变而引起酶活力的改变。n用已知浓度的用已知浓度的标准碱溶液标准碱溶液滴定，可定量地测定滴定，可定量地测定脂肪脂肪酸酸的量，从而得知的量，从而得知脂肪酶脂肪酶活力。活力。37本讲稿第三十七页，共五十九页测定测定n 38本讲稿第三十八页，共五十九页
27、计算计算n每分钟每分钟水解橄榄油水解橄榄油产生产生1mol脂肪酸脂肪酸的酶量，为的酶量，为1个活力单位。个活力单位。n每克含有的胰脂肪酶单位每克含有的胰脂肪酶单位nA:供试品消耗供试品消耗NaOH（0.1mol/L）的体积的体积nB:空白消耗空白消耗NaOH（0.1mol/L）的体积的体积nW:供试品取样量（供试品取样量（g）nN:供试品稀释倍数。供试品稀释倍数。39本讲稿第三十九页，共五十九页三、糖苷键水解酶三、糖苷键水解酶 溶菌酶溶菌酶n蛋清中提取的能蛋清中提取的能分解粘多糖的碱性水解酶分解粘多糖的碱性水解酶。n主要作用于革兰氏阳性菌，使胞壁中的肽聚糖分主要作用于革兰氏阳性菌，使胞壁中的肽
28、聚糖分解导致细菌溶解。解导致细菌溶解。n溶菌酶具有抗菌、抗病毒等作用。溶菌酶具有抗菌、抗病毒等作用。n溶菌酶分子量为溶菌酶分子量为1400015000，由，由129个氨基酸残个氨基酸残基组成，等电点为基组成，等电点为10.011.1。n溶菌酶属糖苷水解酶，能以某些细菌细胞中的多溶菌酶属糖苷水解酶，能以某些细菌细胞中的多糖为底物。糖为底物。40本讲稿第四十页，共五十九页效价测定比浊法效价测定比浊法n以以溶酶小球菌溶酶小球菌为底物，主要成分为粘多糖，粘多糖由为底物，主要成分为粘多糖，粘多糖由NAG和和NAM重复而成。重复而成。n溶菌酶水解专属性强，它只能水解溶菌酶水解专属性强，它只能水解NAM C
29、1 和和NAG C4之间的之间的1，4糖苷键。糖苷键。n溶酶小球菌胞壁中的粘多糖经过溶菌酶的水解作用后，溶酶小球菌胞壁中的粘多糖经过溶菌酶的水解作用后，菌体因渗透压不平衡，导致菌体因渗透压不平衡，导致溶菌溶菌，溶液的，溶液的吸收度下降吸收度下降。n在一定的条件下，每分钟在一定的条件下，每分钟吸收度下降吸收度下降0.001为一个为一个酶活力单位。酶活力单位。41本讲稿第四十一页，共五十九页比浊法测定比浊法测定n计算：计算：n酶活力单位（酶活力单位（u/mg）=nW为测试液中供试品的重为测试液中供试品的重量（量（g）42本讲稿第四十二页，共五十九页比色法测定溶菌酶活性比色法测定溶菌酶活性 n用用染
30、染料料艳艳红红K2BP标标记记的的M.Lysodeikticus为为底底物，酶催化细胞壁分解时游离出染色碎片（产物）物，酶催化细胞壁分解时游离出染色碎片（产物）n反反应应后后离离心心除除去去未未分分解解底底物物，上上清清液液比比色色，吸吸收收度度为溶菌酶活力的函数为溶菌酶活力的函数。43本讲稿第四十三页，共五十九页溶菌酶效价测定比色法溶菌酶效价测定比色法n 44本讲稿第四十四页，共五十九页四、超氧化物歧化酶四、超氧化物歧化酶n由由哺乳动物红细胞哺乳动物红细胞分离而得的金属酶，能分离而得的金属酶，能催化催化超氧化物游离基转化成过氧化氢和氧超氧化物游离基转化成过氧化氢和氧。n来源于牛、猪、人红血球
31、的超氧化物歧化酶来源于牛、猪、人红血球的超氧化物歧化酶（SOD）含铜和锌，分子量含铜和锌，分子量32000左右。左右。nSOD对热较稳定，在对热较稳定，在pH5.39.5范围内对酶活范围内对酶活性影响不大。性影响不大。n牛红细胞牛红细胞SOD PI为为4.95。45本讲稿第四十五页，共五十九页效价测定效价测定nSOD测定方法：测定方法：n直接法：直接测定反应过程中直接法：直接测定反应过程中O2-的变化。的变化。n间接法：同时使用间接法：同时使用氧自由基指示清除剂氧自由基指示清除剂，SOD与指示剂清与指示剂清除剂竞争除剂竞争O2-，从而抑制指示剂清除剂与从而抑制指示剂清除剂与O2-的结合，根据的
32、结合，根据指示剂清除剂与指示剂清除剂与O2-反应速度的变化反应速度的变化可间接测定可间接测定SOD的活的活性。性。n间接法包括：间接法包括：黄嘌呤氧化酶细胞色素黄嘌呤氧化酶细胞色素C法法和和联苯三酚法联苯三酚法。46本讲稿第四十六页，共五十九页黄嘌呤氧化酶细胞色素黄嘌呤氧化酶细胞色素C法法n原理：原理：在有氧条件下，黄嘌呤氧化酶能催化黄嘌呤成尿酸，与在有氧条件下，黄嘌呤氧化酶能催化黄嘌呤成尿酸，与此同时产生此同时产生O2-，氧化型细胞色素氧化型细胞色素C被被O2-还原为还原型细胞还原为还原型细胞色素色素C，后者在后者在550nm有最大吸收，因此测定氧化性细胞色有最大吸收，因此测定氧化性细胞色素
33、素C在加入在加入SOD前后的光吸收变化可间接计算酶活性。前后的光吸收变化可间接计算酶活性。47本讲稿第四十七页，共五十九页方法方法n48本讲稿第四十八页，共五十九页注意点注意点n在特定条件下，在特定条件下，25（pH7.8）每分钟抑制细胞色每分钟抑制细胞色素素C还原速率达还原速率达50所需要的酶量为一个活力单位。所需要的酶量为一个活力单位。n注意事项：注意事项：n重金属离子易使黄嘌呤氧化酶失活，因此反应体系中必重金属离子易使黄嘌呤氧化酶失活，因此反应体系中必须添加须添加EDTA。n反应体系中含过氧化氢酶可引起还原型细胞色素反应体系中含过氧化氢酶可引起还原型细胞色素C发生过氧化作用，从而干扰检测
34、的正确。发生过氧化作用，从而干扰检测的正确。49本讲稿第四十九页，共五十九页联苯三酚法联苯三酚法n原理：原理：在碱性条件下，联苯三酚会发生自氧化生在碱性条件下，联苯三酚会发生自氧化生成红成红 酚，同时生成酚，同时生成O2-。n定义定义:在一定条件下，在一定条件下，每分钟抑制联苯三酚自氧化速每分钟抑制联苯三酚自氧化速率达率达50的酶量的酶量为一个酶活力单位。为一个酶活力单位。50本讲稿第五十页，共五十九页操作操作n定义定义:在一定条件下，在一定条件下，每分钟抑制联苯三酚自氧化速每分钟抑制联苯三酚自氧化速率达率达50的酶量的酶量为一个酶活力单位。为一个酶活力单位。51本讲稿第五十一页，共五十九页实
35、例：尿激酶（实例：尿激酶（urokinase）n本本品品系系从从新新鲜鲜人人尿尿中中提提取取的的一一种种激激活活纤纤维维蛋蛋白白溶溶酶酶原原的酶。的酶。n由由高高分分子子量量54000和和低低分分子子量量33000组组成成的的混混合合物物，高高分分子子量量含含量量不不得得少少于于90%，每每1mg蛋蛋白白中尿激酶活力不得少于中尿激酶活力不得少于12万万U，蛋白分解药物。蛋白分解药物。52本讲稿第五十二页，共五十九页尿激酶尿激酶n（一）性状（一）性状n本品为白色非结晶状粉末本品为白色非结晶状粉末n（二）鉴别（二）鉴别n取取比比活活力力测测定定项项下下的的供供试试品品溶溶液液，用用巴巴比比妥妥-氯
36、氯化化钠钠缓缓冲冲液液（pH7.8）稀稀释释成成每每1ml中中含含20U的的溶溶液液，吸吸取取1ml，加加纤纤维维蛋蛋白白原原溶溶液液0.3ml，再再依依次次加加入入纤纤维维蛋蛋白白溶溶酶酶原原溶溶液液0.2ml，凝凝 血血 酶酶 溶溶 液液0.2ml，迅迅 速速 摇摇 匀匀，立立 即即 置置370.5恒恒温温水水浴浴中中保保温温，记记时时，反反应应系系统统应应在在3045s内内凝凝结结，且且凝凝块块在在15min内内重重新新溶溶解解。以以0.9%氯氯化化钠溶液作空白，同法操作，凝块在钠溶液作空白，同法操作，凝块在2h内不溶。内不溶。53本讲稿第五十三页，共五十九页（三）检查（三）检查 n1溶
37、液的澄清度与颜色，溶液的澄清度与颜色，应澄清无色。应澄清无色。n2分分子子组组分分比比 取取本本品品，加加水水制制成成每每1ml中中含含2mg的的溶溶液液后后，加加入入等等体体积积的的缓缓冲冲液液（取取浓浓缩缩胶胶缓缓冲冲液液2.5ml，20%十十二二烷烷基基磺磺酸酸钠钠溶溶液液2.5ml，20%十十二二烷烷基基磺磺酸酸钠钠溶溶液液的的10ml），置置水水浴浴中中3min，放放冷冷，作作为为供供试试品品溶溶液液；取取供供试试品品溶溶液液10l，加加至至样样品品孔孔，照照电电泳泳法法测测定定，按按下下式式计计算高分子尿激酶相对含量（算高分子尿激酶相对含量（%）。）。54本讲稿第五十四页，共五十九
38、页（三）检查（三）检查n3干干燥燥失失重重 取取本本品品，以以五五氧氧化化二二磷磷为为干干燥燥剂剂，在在60减压干燥至恒重，减失重量不得过减压干燥至恒重，减失重量不得过5.0%。n4异异常常毒毒性性取取本本品品，加加氯氯化化钠钠注注射射液液制制成成每每1ml中中含含5000U的的溶溶液液，依依法法检检查查，按按静静脉脉注注射射法法给给药药，应应符符合规定。合规定。n5热热原原 取取本本品品，加加氯氯化化钠钠注注射射液液制制成成每每1ml中中含含20000U的的溶溶液液，依依法法检检测测，按按家家兔兔体体重重每每1kg注注射射1ml，应符合规定。应符合规定。55本讲稿第五十五页，共五十九页6.凝
39、血质样活性物质凝血质样活性物质n（1）血浆的制备）血浆的制备 。n（2）复复钙钙试试验验 取取小小试试管管，加加血血浆浆0.1ml、6-氨氨基基己己酸酸溶溶液液0.1ml及及巴巴比比妥妥缓缓冲冲液液0.1ml，再再加加入入氯氯化化钙钙溶溶液液观观察察凝凝固固时时间间。以以凝凝固固时时间间最最短短的的一一管管所所加加的的氯氯化化钙钙量量，为为复复钙试验的氯化钙溶液用量。钙试验的氯化钙溶液用量。n（3）测测定定法法 取取小小试试管管加加入入上上述述倍倍比比稀稀释释的的供供试试品品溶溶液液各各0.1ml，再再依依次次加加入入上上述述6-氨氨基基己己酸酸溶溶液液和和血血浆浆各各0.1ml，轻轻轻轻摇摇
40、匀匀，在在25水水浴浴中中，静静置置23min，迅迅速速加加入入已已预预温温至至25的的复复钙钙试试验验所所需需的的上上述述氯氯化化钙钙溶溶液液用用量量，混混匀匀，记记录录放放入入时时间间。注注意观察血浆凝固，观察时轻轻倾斜，避免影响凝血过程，记录凝固时间意观察血浆凝固，观察时轻轻倾斜，避免影响凝血过程，记录凝固时间。n空白对照管凝固时间减去供试品管凝固时间等于空白对照管凝固时间减去供试品管凝固时间等于复钙试验凝固缩短时间复钙试验凝固缩短时间。n在在单单对对数数纸纸上上，以以供供试试品品溶溶液液的的浓浓度度为为纵纵坐坐标标，以以复复钙钙试试验验凝凝固固缩缩短短时时间间（s）为为横横坐坐标标，绘
41、绘图图，连连接接不不同同稀稀释释度度的的供供试试品品各各点点，应应成成一一直直线线，此此直直线线外外延延至至纵纵轴轴，与与纵纵轴轴的的交交点点即即表表示示供供试试品品浓浓度度，也也是是凝凝血血质质样样活活性性为为零零值值时时的的供供试试品品酶酶活活力力，按按每每1ml中中供供试品的单位表示，每试品的单位表示，每1ml应大于应大于150U。56本讲稿第五十六页，共五十九页（四）（四）效价测定效价测定(气泡上升法气泡上升法)n原理：原理：激活人体内纤维蛋白溶解酶原使其转化成纤维蛋白溶酶，激活人体内纤维蛋白溶解酶原使其转化成纤维蛋白溶酶，因纤维蛋白溶酶因纤维蛋白溶酶具有较强的蛋白水解酶的能力。具有较
42、强的蛋白水解酶的能力。n纤维蛋白原在凝血酶的作用下，转变成纤维蛋白凝块，此凝块在纤维蛋白溶酶作纤维蛋白原在凝血酶的作用下，转变成纤维蛋白凝块，此凝块在纤维蛋白溶酶作用下，水解为可溶性小分子多肽。在纤维蛋白溶酶原过量的情况下，用下，水解为可溶性小分子多肽。在纤维蛋白溶酶原过量的情况下，尿激酶量与尿激酶量与纤维蛋白凝块的溶解时间的对数成直线关系纤维蛋白凝块的溶解时间的对数成直线关系。57本讲稿第五十七页，共五十九页操作操作n 58本讲稿第五十八页，共五十九页计算：计算：n以尿激酶的浓度为横坐标，以反应时间的对数为以尿激酶的浓度为横坐标，以反应时间的对数为纵坐标纵坐标。n注意：注意：n影响效价测定的主要因素是影响效价测定的主要因素是纤维蛋白溶解酶原、凝血酶及纤维蛋白溶解酶原、凝血酶及纤维蛋白原纤维蛋白原，如发现标准曲线斜率低于，如发现标准曲线斜率低于0.3，直线平坦，直线平坦，则纤维蛋白溶解酶原、凝血酶可能失活，需重新标定或则纤维蛋白溶解酶原、凝血酶可能失活，需重新标定或更换。更换。n效价测定过程中，各试剂需置效价测定过程中，各试剂需置37水浴中。水浴中。59本讲稿第五十九页，共五十九页