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1、第二章 热灭活乳酸菌微生态制剂全新的益生素概念,主要内容,一、传统益生素概念二、热灭活的乳酸菌三、国外产品临床试验结果四、我们的研究五、下一步研究,1、益生菌和益生素(Probiotic),益生菌是指能够在人或动物体内存活，对宿主的生命健康有益的一类微生物。它是人或动物胃肠道共生微生物的培养物或其发酵产品，故又称活菌制剂或微生态制剂。由活体微生物及其代谢产物制成的有益微生物活性制剂称作益生素。（袁铁铮和姚斌，2004，中国生物工程杂志）,一：传统益生素概念,乳杆菌(Lactobacillus plantarum/acidophilus),一：传统益生素概念,枯草芽孢杆菌(Bacillus su
2、btilis),一：传统益生素概念,粪链球菌(Streptococcus faecalis),附着在小肠表面,一：传统益生素概念,酵母菌(Yeast),啤酒酵母 Saccharomyces cerevisiae,一：传统益生素概念,酵母菌(yeast),假丝酵母 Candida albicans,一：传统益生素概念,益生素的作用机理-2,前因：益生菌进入畜禽肠道后，在复杂的微生态环境中与近400种正常菌会合，显现出栖生、偏生、共生、竞争或吞噬等复杂关系，从而对宿主产生营养、免疫、刺激生长及生物拮抗等生物作用，以保持胃肠道微生态环境的平衡，提高动物生长性能，防病治病，最终取得良好的保健效果或经济
3、效益。益生素的饲喂作用机理概括起来有三大方面，即保健、促生长和防治疾病。,一：传统益生素概念,益生素作用机理-3,保健：作用机制理论基础是微生态平衡论、失调论。从微生态学角度讲，人或畜禽肠胃道疾病是由于体内菌群平衡失调所引起，使用益生素后体内有益菌群逐渐增加，并消耗氧气而造成厌氧环境，从而抑制致病性需氧菌生长。有益菌产生的有机酸降低pH值，产生溶菌酶、过氧化氢等物质抑制有害菌及毒素的产生，恢复或维持正常菌群原有的平衡状态，达到保健的目的。,一：传统益生素概念,促进生长：其作用机制理论基础是微生物营养论。即产生多种消化酶，提高饲料转化率和促进肠内营养物质的消化、吸收；降低大肠菌群数，减少营养物质
4、内耗。产生的代谢产物可以抑制肠内胺和氨的产生；产生蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等消化酶，有利于物质的分解；合成B族维生素，氨基酸、未明促生长因子等营养物质。,一：传统益生素概念,防治疾病： 竞争性排斥作用（competitive exclusion, CE）;免疫刺激作用；以IgA为主。减少胺或氨的产生；减少致癌致变物质的产生；代谢产物对致病菌的直接杀灭作用。,一：传统益生素概念,4、存在的缺点和问题,1、受环境条件(温度、水分、酸碱度等)的影响，其活菌制剂在生产、运输中易失活，从而降低使用效果；2、饲料加工的高温过程使大量的活菌致死，导致有效成份损失；3、饲料中添加的或在治疗过程使用的抗生素和化学
5、合成抗菌剂，对益生菌同样具有杀灭或抑制作用；4、进入消化道后不能有效抵抗盐酸、胆盐，来不及到达肠道或无法长时间定植肠道发挥其功效；二度感染的可能。5、对动物肠道疾病的治疗效果仍不尽人意。,一：传统益生素概念,4、克服缺点的技术与方法,1、选育优良菌种或利用芽孢。耐高温、耐酸、耐胆盐或耐氧等。甚至有的公司在宣传其具有耐药性的乳酸菌。2、将活菌制成微胶囊。保护作用，隔离高温、氧气和胃酸。很有效，但成本高。3、饲料高温加工后再喷涂。避免高温失活。,一：传统益生素概念,二、热灭活的乳酸菌制剂,概念：有人尝试将乳酸菌培养好之后，将细胞热灭活(heat-killed)后，仍保持细胞的完整性（或碎片）作为益
6、生素使用，结果发现同样具有活菌的效果。后来我们将乳酸菌发酵代谢产物也加入其中，预防和治疗人和动物腹泻效果更加理想。,1、发展历史,法国Laboratoire du Lactol公司是这方面的先驱。医学博士皮埃尔、布卡德(Pierre Boucard)先生于一九零七年创建。并率先研究和开发出热灭活的乳酸菌细胞制成的微生态制剂。用于预防及治疗人或畜禽的腹泻，包括抗生素相关性、细菌性和病毒性腹泻。目前作为人或动物用药在全球取得了空前成功。 1998年我们首次在国内做了介绍与报道，并于当年展开研究。,二：热灭活的乳酸菌,2、热灭活乳酸菌制剂的优点,1、收集纯细胞，可制成高浓度制剂，如100-1000亿
7、/克甚至更高；2、灭活的细胞不再担心环境条件的影响；3、不再担心二度感染；4、同微胶囊比，生产成本大大降低。5、同抗生素一起使用有协同作用；6、不用选育耐高温、耐抗生素菌种。7、避免了噬菌体的爆发。,二：热灭活的乳酸菌,3、作用特点,1、细胞浓度高，见效快；2、耐高温、耐抗生素、耐胃酸和胆盐，效果稳定。3、粘附到肠细胞皮面，竞争性排斥有害菌；4、选择性抑杀有害菌，而对乳酸菌没有作用。可作为治疗药物；5、细胞壁多糖的免疫刺激作用；6、吸附生物毒素，如黄曲霉毒素；7、预防与治疗的作用。,二：热灭活的乳酸菌,4、作用机理（竞争性排斥）,灭活的乳酸菌细胞粘附到肠细胞表面形成具保护作用的生物膜，竞争性排
8、斥有害菌的粘附与侵入。,German和Fourniat研究证实热灭活的LB菌株粘附于HeLa细胞，并对E.coli B41的粘附有阻碍作用,二：热灭活的乳酸菌,Adhesion of Strain LB onto HeLa cellsinducing against the adhesion of E.coli B41,二：热灭活的乳酸菌,Adhesion of the Heat-killed LB Strain to the Brush Border of Intestinal Epithelia Cells,二：热灭活的乳酸菌,竞争排斥的原理,二：热灭活的乳酸菌,4、作用机理（抑菌活性）,
9、产生的乳酸、类细菌素、类抗生素等物质对胃肠道致病菌有抑杀作用。而对产酸菌没有抑杀作用。German等（1980）发现，有热灭活的LB存在时，68%的外源菌（沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌）和64%肠道致病菌的生长被延迟了10小时。,二：热灭活的乳酸菌,二：热灭活的乳酸菌,二：热灭活的乳酸菌,5、作用机理(刺激产酸菌生长),发酵过程中产生的大量B族维生素（B2）能作为刺激产酸菌，如乳酸菌生长的生长因子（growth factor）。,二：热灭活的乳酸菌,4、作用机理（免疫刺激作用）,给受试动物以灭活的LB菌刺激，使IgA局部水平显著提高。Lysates由多种细菌与真菌组成。,二：热灭活的乳酸
10、菌,5、灭活菌益生素菌种要求,国家有关部门批准使用的菌种；对人或动物肠道有很强的粘附能力；代谢产物对致病菌有抑杀作用；能产生生长因子，促进产酸菌的生长。对环境条件有耐受性。,二：热灭活的乳酸菌,三、国外产品临床试验 1、人类临床试验,1992-1994年对肠易激综合征的六项症状指标（腹痛、腹胀、排便次数、粪便稀软、便中带粘液及排便不完全）以灭活的LB菌处理，达到50%的有效治愈率。对30例慢性腹泻进行治疗，29例有不同程度的改善，达96 .6%。特别是对I类慢性肝源性腹泻效果尤佳。（赵洪涛，1994）,对婴幼儿轮状病毒性肠炎的治疗效果显著。治疗组有效率达91.7%，补充电解质和水份组为63.3
11、%，差异显著(P0.01)。(孙先军，1996）。治疗使用抗生素后引起的小儿腹泻。治疗组治愈率达73%；对照组为20%。差异显著（P0.01),三：国外产品临床试验,2、动物临床试验,试验设计（法国）260只3周龄小猪分成4组，37天试验,三：国外产品临床试验,平均日增重/饲料报酬,22%,16%,三：国外产品临床试验,四、我们的研究,乳杆菌的分离纯化与鉴定1、从动物粪便中分离出多株乳酸菌；2、耐酸、耐胆盐试验；可耐受0.6%胆盐，pH值低至2.0。3、生长快、产酸量大。4、发酵产物对沙门菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抑制作用。（可能是类抗生素）,对肠道致病菌的抑制作用,大肠杆菌O78,鸡沙门
12、氏菌,发酵液及细胞,煮沸10min,煮沸30min,乳杆菌及其发酵液处理大肠杆菌,大肠杆菌O-78先培养24小时，之后与乳杆菌发酵液同培养24小时。大肠杆菌全部被灭活。,四：我们的研究,热灭活乳杆菌对竹丝肉鸡免疫性能的影响,在基础日粮中添加热灭活乳杆菌制剂，研究其对竹丝肉鸡免疫性能的影响。结果表明热灭活乳杆菌制剂能明显地促进竹丝肉鸡法氏囊的生长发育和机体的细胞免疫水平。在28日龄时，0.15添加组法氏囊指数比对照组高36.1%，差异显著(P0.05)；T淋巴细胞的转化率0.10与0.15添加组比对照组分别高47.3%、29.0%，差异均显著(P0.05)；E-玫瑰花环形成率0.10与0.15添加组分别比对照组高39.86%、24.28%，差异显著(P0.05)。50日龄时，E-玫瑰花环形成率0.10添加组比对照组高20.75%，差异显著(P0.05)。,四：我们的研究,谢谢！,