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1、第五章微生物工程下游加工工程本讲稿第一页，共六十四页n重要性重要性（1）获得商业产品的关键环节）获得商业产品的关键环节（2）拥有市场竞争力的重要保障）拥有市场竞争力的重要保障微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程一、重要性和特点一、重要性和特点本讲稿第二页，共六十四页n特点特点（1）分离系统复杂，杂质多）分离系统复杂，杂质多（2）代谢产物浓度低，稳定性差）代谢产物浓度低，稳定性差（3）代价高，回收率低）代价高，回收率低微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程一、重要性和特点一、重要性和特点本讲稿第三页，共六十四页n物理学过程物理学过程 利用利用物性差异物性差异对包含多种成分的混合物进
2、行分离、提纯。对包含多种成分的混合物进行分离、提纯。（1）平衡分离过程（相的组成差别）：平衡分离过程（相的组成差别）：蒸气压、溶解度；蒸发（蒸馏、蒸气压、溶解度；蒸发（蒸馏、干燥）、结晶、吸附、萃取。干燥）、结晶、吸附、萃取。（2）拟平衡分离过程（分离场）：拟平衡分离过程（分离场）：密度、电荷；离心分离、电泳。密度、电荷；离心分离、电泳。（3）非平衡操作（速度差）：非平衡操作（速度差）：分子（粒子）大小、扩散（渗透）系数；分子（粒子）大小、扩散（渗透）系数；超滤，膜透析。超滤，膜透析。微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程二、二、基本原理基本原理本讲稿第四页，共六十四页n化学过程化学过程
3、 利用利用化学作用化学作用达到分离、提纯的目的，适于高度选择性的精密分离。达到分离、提纯的目的，适于高度选择性的精密分离。（1）分子间作用力：分子间作用力：范德华力、氢键、疏水性相互作用力；萃取、范德华力、氢键、疏水性相互作用力；萃取、吸附层析、疏水层析。吸附层析、疏水层析。（2）分子识别：分子识别：酶和底物的专一性结合；亲和层析。酶和底物的专一性结合；亲和层析。微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程二、基本原理二、基本原理本讲稿第五页，共六十四页n生物过程生物过程 利用利用生物高分子的特异性相互作用生物高分子的特异性相互作用达到分离、提纯的目的，具有达到分离、提纯的目的，具有高度选择性
4、。高度选择性。（1）锁钥关系：锁钥关系：以蛋白质为代表的生物高分子，能分辨特定的物以蛋白质为代表的生物高分子，能分辨特定的物质，再与其可逆性结合；染料亲和层析。质，再与其可逆性结合；染料亲和层析。（2）亲和色谱：亲和色谱：利用某些生物物质之间特异的亲和力进行选择性分离利用某些生物物质之间特异的亲和力进行选择性分离的一种色谱分离技术；吸附、洗涤、洗脱、再平衡化。的一种色谱分离技术；吸附、洗涤、洗脱、再平衡化。微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程二、基本原理二、基本原理本讲稿第六页，共六十四页成品加工成品加工发酵液的预处理和过滤发酵液的预处理和过滤提取（初步纯化）提取（初步纯化）精制（高度
5、纯化）精制（高度纯化）加热、调加热、调pH、絮凝、絮凝沉降、离心分离、过滤、错流过滤沉降、离心分离、过滤、错流过滤沉降、吸附、萃取、超滤沉降、吸附、萃取、超滤层析、电泳、离子交换层析、电泳、离子交换浓缩、结晶、干燥浓缩、结晶、干燥三、一般程序和单元操作三、一般程序和单元操作微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程本讲稿第七页，共六十四页四、常见分离和提纯方法四、常见分离和提纯方法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程（一）发酵液的预处理和过滤（一）发酵液的预处理和过滤1、发酵液的预处理、发酵液的预处理目的：目的：改变发酵液的物理性质，加快沉降速度；使产物转入改变发酵液的物理性质，加快
6、沉降速度；使产物转入以后处理的液相中；除去部分杂质。以后处理的液相中；除去部分杂质。处理技术：处理技术：絮凝、凝聚；稀释、加热。絮凝、凝聚；稀释、加热。本讲稿第八页，共六十四页四、常见分离和提纯方法四、常见分离和提纯方法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程（一）发酵液的预处理和过滤（一）发酵液的预处理和过滤1、发酵液的预处理、发酵液的预处理 （1）高价无机离子）高价无机离子(Ca2+、Mg2+、Fe3+)的去除方法的去除方法Ca2+:草酸（回收）草酸（回收）四环类抗生素的提取四环类抗生素的提取Mg2+:Na5P3O10+Mg2+=MgNa3P3O10+2Na+环丝氨酸的提取环丝氨酸的提
7、取Fe3+:3K4Fe(CN)6+4Fe3+=Fe4Fe(CN)63+12K+本讲稿第九页，共六十四页四、常见分离和提纯方法四、常见分离和提纯方法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程（一）发酵液的预处理和过滤（一）发酵液的预处理和过滤1、发酵液的预处理、发酵液的预处理（2）可溶性杂蛋白质的去除方法）可溶性杂蛋白质的去除方法a.调节调节pH（等电点）与阴粒子物质（三氯醋酸盐、水杨酸盐、过氯酸盐等）（等电点）与阴粒子物质（三氯醋酸盐、水杨酸盐、过氯酸盐等）、阳离子（、阳离子（Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Pb2+）形成沉淀）形成沉淀b.加入脱水剂（碱金属中性盐），使蛋白质沉淀加入脱
8、水剂（碱金属中性盐），使蛋白质沉淀c.加热加热 链霉素提炼（链霉素提炼（30）和柠檬酸发酵液（和柠檬酸发酵液（80）的预处理的预处理d.加入有机溶剂或表面活性剂使蛋白质变性凝固加入有机溶剂或表面活性剂使蛋白质变性凝固e.使用絮凝剂（无机、有机），例如使用絮凝剂（无机、有机），例如-半乳糖苷半乳糖苷酶酶的的纯纯化化f.吸附，例如四吸附，例如四环类环类抗生素的提取，可用抗生素的提取，可用亚铁氰亚铁氰化化锌钾锌钾吸附蛋白吸附蛋白质质本讲稿第十页，共六十四页四、常见分离和提纯方法四、常见分离和提纯方法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程（一）发酵液的预处理和过滤（一）发酵液的预处理和过滤1、发
9、酵液的预处理、发酵液的预处理（3）色素物质的去除）色素物质的去除 色素物质化学性质的多样性增加了脱色的难度。色素物质化学性质的多样性增加了脱色的难度。常用方法：活性炭吸附法、离子交换剂、离子交换纤维。常用方法：活性炭吸附法、离子交换剂、离子交换纤维。本讲稿第十一页，共六十四页四、常见分离和提纯方法四、常见分离和提纯方法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程（一）发酵液的预处理和过滤（一）发酵液的预处理和过滤2、发酵液的过滤、发酵液的过滤（1）发酵液的过滤特性）发酵液的过滤特性滤饼的比阻值滤饼的比阻值rB（过滤速度）（过滤速度）rB=r(P)mr不可压缩滤饼的比阻（对一定料液其值为常数）；
10、不可压缩滤饼的比阻（对一定料液其值为常数）；m压缩性指数，一般为压缩性指数，一般为0.5-0.8；不可压缩滤饼为；不可压缩滤饼为0；P压力差压力差对于发酵液滤饼，过滤速度不但会随滤饼厚度的增加而下降，还会因滤饼比阻力的对于发酵液滤饼，过滤速度不但会随滤饼厚度的增加而下降，还会因滤饼比阻力的突然升高而额外下降。这是由于有机物质的胶体粒子借静电吸引而结合的水分子所突然升高而额外下降。这是由于有机物质的胶体粒子借静电吸引而结合的水分子所致。致。本讲稿第十二页，共六十四页四、常见分离和提纯方法四、常见分离和提纯方法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程（一）发酵液的预处理和过滤（一）发酵液的预处
11、理和过滤2、发酵液的过滤、发酵液的过滤（2）影响发酵液过滤速度的因素）影响发酵液过滤速度的因素 a.a.菌体细胞体积菌体细胞体积 真菌菌丝体较粗大，质量比阻小，发酵液不需经特殊处真菌菌丝体较粗大，质量比阻小，发酵液不需经特殊处理就很容易过滤；理就很容易过滤；放线菌菌丝细而分支，交织成网格状，质量比阻力大，较放线菌菌丝细而分支，交织成网格状，质量比阻力大，较难过滤，发酵液需经预处理，凝固蛋白质等胶体物质，提高过难过滤，发酵液需经预处理，凝固蛋白质等胶体物质，提高过滤速度；滤速度；细菌菌体更小，发酵液如不经絮凝等预处理，很难用常规过滤设细菌菌体更小，发酵液如不经絮凝等预处理，很难用常规过滤设备进行
12、过滤操作。备进行过滤操作。b.b.培养基组成培养基组成黄豆饼粉、花生饼粉等会增加过滤难度黄豆饼粉、花生饼粉等会增加过滤难度c.c.放罐时机放罐时机 发酵后期要少加消泡剂和少进行补料，防止消泡剂和未用完发酵后期要少加消泡剂和少进行补料，防止消泡剂和未用完的培养基增加过滤难度；的培养基增加过滤难度；菌体自溶前放罐可防止因菌体自溶释放出的代谢产物增加发菌体自溶前放罐可防止因菌体自溶释放出的代谢产物增加发酵液黏度酵液黏度本讲稿第十三页，共六十四页四、常见分离和提纯方法四、常见分离和提纯方法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程（一）发酵液的预处理和过滤（一）发酵液的预处理和过滤2、发酵液的过滤、
13、发酵液的过滤（3）提高过滤性能的方法）提高过滤性能的方法 a.a.加助滤剂加助滤剂 助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，能使滤饼疏松，从助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，能使滤饼疏松，从而增加滤速；而增加滤速；常用硅藻土、珍珠岩等；常用硅藻土、珍珠岩等；加入方法有两种：加入方法有两种：a)a)预先在滤布上铺上一层预先在滤布上铺上一层1-2mm1-2mm厚的厚的助滤剂；助滤剂；b)b)直接把助滤剂加入发酵液中。直接把助滤剂加入发酵液中。b.b.添加填充凝固剂添加填充凝固剂如如CaSOCaSO4 4、AlPOAlPO4 4等本身就是助滤剂，且能使胶状物和悬浮物等本身就是助滤剂，且能使胶状物和悬浮物凝固凝
14、固c.c.酶解法酶解法当发酵液中有不溶性多糖时，会使发酵液的黏度增大而影响过滤速度；当发酵液中有不溶性多糖时，会使发酵液的黏度增大而影响过滤速度；可用酶将其转化成可溶性单糖，提高滤速。可用酶将其转化成可溶性单糖，提高滤速。本讲稿第十四页，共六十四页四、常见分离和提纯方法四、常见分离和提纯方法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程（二）微生物细胞的破碎和分离（二）微生物细胞的破碎和分离1、微生物细胞壁的组成及其破碎阻力、微生物细胞壁的组成及其破碎阻力细菌：肽聚糖、脂蛋白、脂多糖、磷壁酸细菌：肽聚糖、脂蛋白、脂多糖、磷壁酸细胞破碎的主要阻力：肽聚糖的网状结构（致密程度和强度）细胞破碎的主要阻
15、力：肽聚糖的网状结构（致密程度和强度）酵母菌：葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质酵母菌：葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质细胞破碎的主要阻力：壁结构交联的紧密程度及其厚度细胞破碎的主要阻力：壁结构交联的紧密程度及其厚度霉菌：几丁质、葡聚糖、脂类、蛋白质霉菌：几丁质、葡聚糖、脂类、蛋白质细胞破碎的主要阻力：细胞壁的强度和聚合物的网状结构细胞破碎的主要阻力：细胞壁的强度和聚合物的网状结构本讲稿第十五页，共六十四页四、常见分离和提纯方法四、常见分离和提纯方法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程（二）微生物细胞的破碎和分离（二）微生物细胞的破碎和分离2、微生物细胞破碎的方法、微生物细胞破碎的方法（1 1）高压匀浆
16、法（大规模破碎细胞常用方法）高压匀浆法（大规模破碎细胞常用方法）利用高压使细胞悬液通过针型阀，由于突然减压和高速利用高压使细胞悬液通过针型阀，由于突然减压和高速冲击撞击环，造成细胞破碎。冲击撞击环，造成细胞破碎。影响破碎的主要因素是压力、温度和循环次数影响破碎的主要因素是压力、温度和循环次数高速匀浆器排出阀结构示意图见高速匀浆器排出阀结构示意图见P541.P541.本讲稿第十六页，共六十四页四、常见分离和提纯方法四、常见分离和提纯方法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程（二）微生物细胞的破碎和分离（二）微生物细胞的破碎和分离2、微生物细胞破碎的方法、微生物细胞破碎的方法（2 2）高速球
17、磨法）高速球磨法高速球磨机高速球磨机 1-物料进口物料进口 2-物料出口物料出口 3、4-冷却水进、出口冷却水进、出口 5、6-夹套冷却水进、出口夹套冷却水进、出口由于圆盘的高速旋转，细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石由于圆盘的高速旋转，细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，使细胞得以破碎。英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，使细胞得以破碎。本讲稿第十七页，共六十四页四、常见分离和提纯方法四、常见分离和提纯方法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程（二）微生物细胞的破碎和分离（二）微生物细胞的破碎和分离2、微生物细胞破碎的方法、微生物细胞破碎的方法（3 3）超声波法）超声
18、波法 常用超声波频率常用超声波频率15-25kHz15-25kHz；细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，由于这种空穴泡又受细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，由于这种空穴泡又受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生极为强烈的冲击波压力，到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生极为强烈的冲击波压力，由此引起的黏滞性旋涡在介质中的细胞上造成了剪切应力，促由此引起的黏滞性旋涡在介质中的细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，造成细胞破碎；使细胞内液体发生流动，造成细胞破碎；超声波振荡易引起温度的剧烈上升，操作是需冷却；超声波振荡易引起温度的剧烈上升，操作是需冷却；通常杆菌比球菌易破，阴性菌比阳性菌易破通常杆
19、菌比球菌易破，阴性菌比阳性菌易破本讲稿第十八页，共六十四页四、常见分离和提纯方法四、常见分离和提纯方法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程（二）微生物细胞的破碎和分离（二）微生物细胞的破碎和分离2、微生物细胞破碎的方法、微生物细胞破碎的方法（4 4）酶解法）酶解法 专一性强，条件温和；但费用较高专一性强，条件温和；但费用较高 酶解法的另一方式是利用微生物的自溶作用酶解法的另一方式是利用微生物的自溶作用 即溶胞的酶是微生物自身产生的；大多数微生物都能产生即溶胞的酶是微生物自身产生的；大多数微生物都能产生一种可以水解自身细胞壁上聚合结构的酶；当改变一定的环一种可以水解自身细胞壁上聚合结构的
20、酶；当改变一定的环境条件时，可诱发这种酶的过量产生或激发其他自溶酶产生，境条件时，可诱发这种酶的过量产生或激发其他自溶酶产生，而发生自溶现象。而发生自溶现象。本讲稿第十九页，共六十四页四、常见分离和提纯方法四、常见分离和提纯方法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程（二）微生物细胞的破碎和分离（二）微生物细胞的破碎和分离2、微生物细胞破碎的方法、微生物细胞破碎的方法（5 5）渗透压冲击法）渗透压冲击法 将细胞先放入高渗透压的介质中，如高浓度的甘油或蔗糖液，将细胞先放入高渗透压的介质中，如高浓度的甘油或蔗糖液，在达到平衡后，介质突然被稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，在达到平衡后，介质突然被
21、稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，水就会迅速进入细胞内，致使细胞膨胀，引起细胞壁的破裂；水就会迅速进入细胞内，致使细胞膨胀，引起细胞壁的破裂；此法适用于细胞壁较脆弱的，或者细胞壁预先用酶处理的，或细此法适用于细胞壁较脆弱的，或者细胞壁预先用酶处理的，或细胞壁合成受到抑制的微生物；胞壁合成受到抑制的微生物；本讲稿第二十页，共六十四页四、常见分离和提纯方法四、常见分离和提纯方法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程（二）微生物细胞的破碎和分离（二）微生物细胞的破碎和分离2、微生物细胞破碎的方法、微生物细胞破碎的方法（6 6）反复冻结）反复冻结-融化法融化法 将细胞反复在低温下突然冷冻后在室温下
22、融化，引起细将细胞反复在低温下突然冷冻后在室温下融化，引起细胞破裂；低温冷冻一方面能使细胞膜的疏水键结构断裂，胞破裂；低温冷冻一方面能使细胞膜的疏水键结构断裂，从而增加细胞的亲水性能；另一方面胞内水结晶使细胞内从而增加细胞的亲水性能；另一方面胞内水结晶使细胞内外溶液浓度发生变化，引起细胞突然膨胀而破裂。外溶液浓度发生变化，引起细胞突然膨胀而破裂。该法适用于细胞壁较脆弱的细胞该法适用于细胞壁较脆弱的细胞本讲稿第二十一页，共六十四页四、常见分离和提纯方法四、常见分离和提纯方法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程（二）微生物细胞的破碎和分离（二）微生物细胞的破碎和分离3、细胞破碎率的测定、细
23、胞破碎率的测定（1 1）直接测定法）直接测定法观察计数（必要时配合染色技术）观察计数（必要时配合染色技术）（2 2）测定释放的蛋白或酶活力）测定释放的蛋白或酶活力（3 3）测定导电率）测定导电率 当细胞内含物释放到水相时，会引起导电率的变化；随破碎率当细胞内含物释放到水相时，会引起导电率的变化；随破碎率的增加而增加，有线性关系；的增加而增加，有线性关系；因导电率的读数取决于微生物的种类、处理条件、细胞浓度等，因导电率的读数取决于微生物的种类、处理条件、细胞浓度等，应先用其他方法标准化应先用其他方法标准化本讲稿第二十二页，共六十四页四、常见分离和提纯方法四、常见分离和提纯方法微生物工程下游加工工
24、程微生物工程下游加工工程（三）沉淀法（三）沉淀法（Precipitation）本讲稿第二十三页，共六十四页四、常见分离和提纯方法四、常见分离和提纯方法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程（三）沉淀法（三）沉淀法（Precipitation）沉淀是通过改变条件或加入某种试剂，使溶液中的溶质沉淀是通过改变条件或加入某种试剂，使溶液中的溶质由液相转变为固相析出的过程。由液相转变为固相析出的过程。方法简单、成本低、使用广泛，一般作为初步分离的手段。方法简单、成本低、使用广泛，一般作为初步分离的手段。本讲稿第二十四页，共六十四页四、常见分离和提纯方法四、常见分离和提纯方法微生物工程下游加工工程微
25、生物工程下游加工工程（三）沉淀法（三）沉淀法（Precipitation）盐析法盐析法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法等电点沉淀法非离子型聚合物沉淀法非离子型聚合物沉淀法聚电解质沉淀法聚电解质沉淀法金属离子沉淀法金属离子沉淀法本讲稿第二十五页，共六十四页（三）沉淀法（三）沉淀法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程1.盐析法（盐析法（salting out）（1）原理）原理 高浓度高浓度中性盐的加入能破坏蛋白、酶等的胶体性中性盐的加入能破坏蛋白、酶等的胶体性质，中和微粒上的电荷，促使蛋白质等沉淀。质，中和微粒上的电荷，促使蛋白质等沉淀。蛋白质的溶解度与盐浓度间的关系可用蛋白质的溶
26、解度与盐浓度间的关系可用CohnCohn方程式表示：方程式表示：logS=KsI S S 离子强度为离子强度为I I时的蛋白溶解度时的蛋白溶解度(g/L)(g/L)；溶溶质质特征常数，大小取决于不同蛋白特征常数，大小取决于不同蛋白质质的性的性 质质，也，也与温度和与温度和pH有关；有关；Ks Ks 盐析常数，与盐的种类有关；盐析常数，与盐的种类有关；I 离子强度。离子强度。盐析法分离蛋白质时，可分两类：盐析法分离蛋白质时，可分两类：1 1）在一定的）在一定的pHpH值和温度下，改变离子强度或盐浓度的沉淀方法值和温度下，改变离子强度或盐浓度的沉淀方法“K K”分级盐析法分级盐析法2 2）在一定离
27、子强度下，改变溶液的）在一定离子强度下，改变溶液的pHpH值及温度的沉淀方法值及温度的沉淀方法“”分级盐析法分级盐析法本讲稿第二十六页，共六十四页（三）沉淀法（三）沉淀法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程1.盐析法（盐析法（salting out）（2 2）影响盐析的主要因素）影响盐析的主要因素蛋白质浓度蛋白质浓度 高浓度的蛋白溶液，可减少盐的用量；但共沉现象严重高浓度的蛋白溶液，可减少盐的用量；但共沉现象严重用低浓度蛋白溶液进行盐析，需用较多的盐，共沉作用较轻用低浓度蛋白溶液进行盐析，需用较多的盐，共沉作用较轻离子强度和种类离子强度和种类盐溶盐溶(salting in)(salti
28、ng in)：许多蛋白在低盐浓度下发生盐溶现象（比在纯许多蛋白在低盐浓度下发生盐溶现象（比在纯水中的溶解度大大增加）；水中的溶解度大大增加）；高盐浓度则盐析，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低；高盐浓度则盐析，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低；盐析剂种类很多，不同种类的盐对蛋白溶解度的影响是不同的；盐析剂种类很多，不同种类的盐对蛋白溶解度的影响是不同的；离子半径小且电荷高的离子对盐析作用的影响较强，离子半径较大离子半径小且电荷高的离子对盐析作用的影响较强，离子半径较大而电荷低的离子影响较弱；不同种类的盐对溶解度的影响，主要是而电荷低的离子影响较弱；不同种类的盐对溶解度的影响，主要是对对KsKs值
29、的影响，值的影响，KsKs值越大，该盐的盐析效果越好。值越大，该盐的盐析效果越好。温度温度 温度是影响溶质溶解度的重要因素，升高温度可以增加许温度是影响溶质溶解度的重要因素，升高温度可以增加许多无机盐和小分子有机化合物的溶解度；多无机盐和小分子有机化合物的溶解度；但在高盐浓度中，蛋白质等生物大分子物质的溶解度随温但在高盐浓度中，蛋白质等生物大分子物质的溶解度随温度的升高反而减小度的升高反而减小 这主要是因为蛋白质分子在水化时要吸热，失水时则放热；温这主要是因为蛋白质分子在水化时要吸热，失水时则放热；温度升高有利于蛋白质失水沉淀。度升高有利于蛋白质失水沉淀。pHpH 盐析盐析pHpH的选择要以不
30、降低产物的活性为原则；的选择要以不降低产物的活性为原则；由于蛋白质在等电点时最易沉淀，故可选择等电点的由于蛋白质在等电点时最易沉淀，故可选择等电点的pHpH作为作为盐析盐析pHpH本讲稿第二十七页，共六十四页（三）沉淀法（三）沉淀法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程2.有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法（1 1）原理）原理 有机溶剂（丙酮、乙醇、甲醇）能降低水溶液的介电常数。有机溶剂（丙酮、乙醇、甲醇）能降低水溶液的介电常数。当有机溶剂浓度增大时，水对蛋白等分子表面上荷电基团或亲水基团的当有机溶剂浓度增大时，水对蛋白等分子表面上荷电基团或亲水基团的水化程度降低，静电吸引力增大，带电溶质互相
31、吸引而聚集。水化程度降低，静电吸引力增大，带电溶质互相吸引而聚集。对于具有表面水层的生物分子（核酸、多糖、生物小分子），有机溶对于具有表面水层的生物分子（核酸、多糖、生物小分子），有机溶剂与水的作用，使这些分子表面水层厚度不断压缩，最后使这些分子脱剂与水的作用，使这些分子表面水层厚度不断压缩，最后使这些分子脱水而相互聚集析出。水而相互聚集析出。本讲稿第二十八页，共六十四页（三）沉淀法（三）沉淀法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程2.有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法（2 2）优缺点）优缺点优点：优点：分辨能力较高，一种溶质只在一个比较窄的有机溶剂范围分辨能力较高，一种溶质只在一个比较窄的有
32、机溶剂范围内沉淀；沉淀无需脱盐；有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，内沉淀；沉淀无需脱盐；有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，易进行固液分离；有机溶剂易挥发，不会在成品中残留。易进行固液分离；有机溶剂易挥发，不会在成品中残留。缺点：缺点：易引起蛋白变性；易燃、易爆易引起蛋白变性；易燃、易爆本讲稿第二十九页，共六十四页（三）沉淀法（三）沉淀法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程3.非离子型聚合物沉淀法非离子型聚合物沉淀法机制：机制：能降低生物大分子水化度，与大分子发生共沉作用；与生能降低生物大分子水化度，与大分子发生共沉作用；与生物大分子形成复合物；通过空间位置排斥，使液体中的微粒被迫物大分
33、子形成复合物；通过空间位置排斥，使液体中的微粒被迫聚集而沉淀。聚集而沉淀。聚合物：聚合物：聚乙二醇聚乙二醇(PEG)(PEG)，常用，常用PEG6000-20000PEG6000-20000，浓度为，浓度为20%20%优点：优点：沉淀效能高；操作条件温和，不易引起生物大分子变性；沉淀效能高；操作条件温和，不易引起生物大分子变性；沉淀后易除去；无毒、不可燃；广泛用于核酸、蛋白等的分离纯沉淀后易除去；无毒、不可燃；广泛用于核酸、蛋白等的分离纯化。化。本讲稿第三十页，共六十四页（三）沉淀法（三）沉淀法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程4.聚电解质沉淀法聚电解质沉淀法原理：原理：类似于絮凝剂
34、，兼有一定的盐析和水化作用类似于絮凝剂，兼有一定的盐析和水化作用聚电解质：聚电解质：离子型的多糖化合物，如酸性多糖羧甲基纤离子型的多糖化合物，如酸性多糖羧甲基纤维素、海藻酸盐、果胶酸盐、卡拉胶等；维素、海藻酸盐、果胶酸盐、卡拉胶等；阴离子聚合物：聚丙烯酸（阴离子聚合物：聚丙烯酸（pH=2.8pH=2.8）；）；阳离子聚合物：聚乙烯亚胺（阳离子聚合物：聚乙烯亚胺（pH=10.4pH=10.4）本讲稿第三十一页，共六十四页四、常见分离和提纯方法四、常见分离和提纯方法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程（四）溶剂萃取法（四）溶剂萃取法（solvent extraction）本讲稿第三十二页，
35、共六十四页（四）溶剂萃取法（四）溶剂萃取法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程1.1.溶剂萃取原理溶剂萃取原理分配定律分配定律 在溶剂萃取中，含有溶质的未被提取过的溶液称为在溶剂萃取中，含有溶质的未被提取过的溶液称为料液（料液（F）；用于进行萃取的溶剂称为用于进行萃取的溶剂称为萃取剂（萃取剂（S）；经萃取后含有溶质的萃取剂；经萃取后含有溶质的萃取剂称为称为萃取液（萃取液（L）；被萃取过失去溶质的料液称为；被萃取过失去溶质的料液称为萃余液（萃余液（R）。溶剂萃取法是以分配定律为基础的，即利用各种物质在不同溶剂溶剂萃取法是以分配定律为基础的，即利用各种物质在不同溶剂中具有不同的溶解度的原理
36、，达到将不同物质分离纯化的目的。中具有不同的溶解度的原理，达到将不同物质分离纯化的目的。分配定律（distribution lawdistribution law）在一定温度和压力下，溶质分配在两不相溶的溶剂中，达在一定温度和压力下，溶质分配在两不相溶的溶剂中，达到平衡时，溶质在两相的浓度之比为一常数。到平衡时，溶质在两相的浓度之比为一常数。K=CK=CL L/C/CR R=萃取液浓度萃取液浓度/萃余液浓度萃余液浓度K K为分配常数（分配系数、分配比），其大小反映出溶质在不为分配常数（分配系数、分配比），其大小反映出溶质在不同溶剂中溶解度的差异，及在此系统中的选择性同溶剂中溶解度的差异，及在此
37、系统中的选择性本讲稿第三十三页，共六十四页（四）溶剂萃取法（四）溶剂萃取法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程2.2.萃取有机溶剂的选择萃取有机溶剂的选择（1 1）选择萃取用的溶剂应考虑对产物有较大的溶解度和较好的）选择萃取用的溶剂应考虑对产物有较大的溶解度和较好的选择性。选择性。（2 2）溶剂与被萃取液的互溶度要小，黏度低，界面张力适中，对相的分）溶剂与被萃取液的互溶度要小，黏度低，界面张力适中，对相的分散和相的分离有利。散和相的分离有利。（3 3）溶剂的化学稳定性高，有利于回收和再生利用。）溶剂的化学稳定性高，有利于回收和再生利用。（4 4）价格低廉，安全）价格低廉，安全常用萃取剂
38、：乙酸乙酯、乙酸丁酯、丁醇常用萃取剂：乙酸乙酯、乙酸丁酯、丁醇本讲稿第三十四页，共六十四页（四）溶剂萃取法（四）溶剂萃取法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程3.3.影响水相溶质溶解度（萃取效果）的因素影响水相溶质溶解度（萃取效果）的因素（1 1）离子强度）离子强度 有些物质在高离子强度下溶解度增加，如有些物质在高离子强度下溶解度增加，如DNA-DNA-蛋白；有蛋白；有些则在低离子强度下溶解度增加，如些则在低离子强度下溶解度增加，如RNA-RNA-蛋白；蛋白；绝大多数蛋白质和酶存在绝大多数蛋白质和酶存在“盐溶盐溶”和和“盐析盐析”现象；现象；盐析作用可以降低许多生化产物在水中的溶解度，
39、也能减少有盐析作用可以降低许多生化产物在水中的溶解度，也能减少有机溶剂在水中的溶解度。机溶剂在水中的溶解度。例如：在例如：在V VB12B12的提取中，加入中性盐硫酸铵，有利于的提取中，加入中性盐硫酸铵，有利于V VB12B12自水自水相转移到有机溶剂中；在提取青霉素时加入相转移到有机溶剂中；在提取青霉素时加入NaClNaCl，也有利于，也有利于青霉素从水相转移到有机溶剂中。青霉素从水相转移到有机溶剂中。本讲稿第三十五页，共六十四页（四）溶剂萃取法（四）溶剂萃取法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程3.3.影响水相溶质溶解度（萃取效果）的因素影响水相溶质溶解度（萃取效果）的因素（2 2
40、）pHpH 当酸性物质处于低当酸性物质处于低pHpH或碱性物质处于高或碱性物质处于高pHpH，都可以转溶于有，都可以转溶于有机溶剂，但氨基酸除外，一般不用有机溶剂提取（稀乙醇除外）。机溶剂，但氨基酸除外，一般不用有机溶剂提取（稀乙醇除外）。pH pH在萃取中影响分配系数。在萃取中影响分配系数。pHpH对选择性有影响。对选择性有影响。pHpH的选择应注意产物的稳定性。的选择应注意产物的稳定性。本讲稿第三十六页，共六十四页（四）溶剂萃取法（四）溶剂萃取法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程3.3.影响水相溶质溶解度（萃取效果）的因素影响水相溶质溶解度（萃取效果）的因素（3 3）温度）温度
41、温度可改变物质的溶解度，影响分配系数；温度可改变物质的溶解度，影响分配系数；一般生物物质对温度敏感，萃取多在室温或低温下进行（通常一般生物物质对温度敏感，萃取多在室温或低温下进行（通常0-0-1010）；）；但也有采用热提取法的（但也有采用热提取法的（50-70 50-70 ），多用于一些小分子生物），多用于一些小分子生物物质物质本讲稿第三十七页，共六十四页（四）溶剂萃取法（四）溶剂萃取法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程3.3.影响水相溶质溶解度（萃取效果）的因素影响水相溶质溶解度（萃取效果）的因素（4 4）带溶剂）带溶剂 带溶剂是一类能和所提取的生物物质形成复合物，而易溶于溶剂带
42、溶剂是一类能和所提取的生物物质形成复合物，而易溶于溶剂的物质，且此复合物在一定条件下易分解形成原来的生物物质。的物质，且此复合物在一定条件下易分解形成原来的生物物质。提取水溶性强、在常用的有机溶剂中溶解度小的物质时可采用提取水溶性强、在常用的有机溶剂中溶解度小的物质时可采用添加带溶剂；对于水溶性不强的物质，也可通过带溶剂提高收率和添加带溶剂；对于水溶性不强的物质，也可通过带溶剂提高收率和选择性。选择性。例如：链霉素是水溶性较强的碱，可与脂肪酸（如月桂酸）例如：链霉素是水溶性较强的碱，可与脂肪酸（如月桂酸）形成复合物，该复合物能溶于乙醇、醋酸丁酯等，而被萃取到形成复合物，该复合物能溶于乙醇、醋酸
43、丁酯等，而被萃取到有机相；在酸性条件下，又分解成链霉素而转溶于水相。有机相；在酸性条件下，又分解成链霉素而转溶于水相。本讲稿第三十八页，共六十四页（四）溶剂萃取法（四）溶剂萃取法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程4.4.乳化与去乳化乳化与去乳化 在萃取过程中，经常会出现一种液体分散到另一种本不相溶的液体中，在萃取过程中，经常会出现一种液体分散到另一种本不相溶的液体中，即即乳化现象乳化现象。乳化现象会造成有机溶剂相和水相分层困难，出现两种夹带现乳化现象会造成有机溶剂相和水相分层困难，出现两种夹带现象：象：一是发酵液提取废液中夹带有机溶剂微粒，导致产品损失；一是发酵液提取废液中夹带有机溶
44、剂微粒，导致产品损失；二是有机溶剂相中夹带发酵液微粒，会将杂质带入产品中。二是有机溶剂相中夹带发酵液微粒，会将杂质带入产品中。本讲稿第三十九页，共六十四页（四）溶剂萃取法（四）溶剂萃取法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程4.4.乳化与去乳化乳化与去乳化（1 1）乳浊液的成因及稳定条件）乳浊液的成因及稳定条件油（有机溶剂）、水不溶油（有机溶剂）、水不溶分层分层表面活性剂存在可发生乳化，这类表面活性剂称为乳化剂。表面活性剂存在可发生乳化，这类表面活性剂称为乳化剂。乳浊液有两种：乳浊液有两种：水包油型水包油型(O/W(O/W型型)油滴分散在水中油滴分散在水中 油包水型油包水型(W/O(W/
45、O型型)水滴分散在油中水滴分散在油中本讲稿第四十页，共六十四页（四）溶剂萃取法（四）溶剂萃取法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程4.4.乳化与去乳化乳化与去乳化（1 1）乳浊液的成因及稳定条件）乳浊液的成因及稳定条件 由于乳化剂的两性性质，能够将本不相溶的油与水连在一起，由于乳化剂的两性性质，能够将本不相溶的油与水连在一起，但其分子处在任何一相都是不稳定的，只有处在两相界面上时，但其分子处在任何一相都是不稳定的，只有处在两相界面上时，亲水基团对着水，疏水基团对向油，在相的界面上形成单分子层亲水基团对着水，疏水基团对向油，在相的界面上形成单分子层时，比较稳定。乳化剂能够降低表面张力，液
46、体容易分散成微滴时，比较稳定。乳化剂能够降低表面张力，液体容易分散成微滴而发生乳化。而发生乳化。本讲稿第四十一页，共六十四页（四）溶剂萃取法（四）溶剂萃取法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程4.4.乳化与去乳化乳化与去乳化（1 1）乳浊液的成因及稳定条件）乳浊液的成因及稳定条件 影响乳浊液稳定性的因素包括是否在界面上形成保护膜，液滴影响乳浊液稳定性的因素包括是否在界面上形成保护膜，液滴的带电性质以及介质的黏度。的带电性质以及介质的黏度。在发酵液中，蛋白对表面张力的影响最为显著，随着蛋白含量的在发酵液中，蛋白对表面张力的影响最为显著，随着蛋白含量的增多，表面张力明显下降，由此引起的乳浊
47、液是相当稳定的。增多，表面张力明显下降，由此引起的乳浊液是相当稳定的。本讲稿第四十二页，共六十四页（四）溶剂萃取法（四）溶剂萃取法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程4.4.乳化与去乳化乳化与去乳化（2 2）去乳化的方法）去乳化的方法a.a.离心分离法离心分离法b.b.提高温度提高温度c.c.稀释法稀释法d.d.电解质破乳法电解质破乳法 离子型乳化剂所形成的乳浊液的稳定性，是因其分散相带有电离子型乳化剂所形成的乳浊液的稳定性，是因其分散相带有电荷；荷；加入电解质，可中和其电性，促使聚沉；加入电解质，可中和其电性，促使聚沉；常用常用NaClNaCl、NaOHNaOH、HClHCl、AlA
48、l3+3+等等e.e.吸附法吸附法CaCOCaCO3 3可被水浸润，但不能被有机溶剂润湿；将乳浊液通过可被水浸润，但不能被有机溶剂润湿；将乳浊液通过CaCOCaCO3 3层时，乳浊液中的水分则被吸附。层时，乳浊液中的水分则被吸附。本讲稿第四十三页，共六十四页（四）溶剂萃取法（四）溶剂萃取法微生物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程4.4.乳化与去乳化乳化与去乳化（2 2）去乳化的方法）去乳化的方法f.f.顶替法顶替法h.h.转型法转型法加入表面活性更强但不能形成保护膜的物质，将原来的乳化剂从界加入表面活性更强但不能形成保护膜的物质，将原来的乳化剂从界面上顶替出来。面上顶替出来。常用顶替剂有戊
49、醇，其表面活性很强，但碳链很短，不能形常用顶替剂有戊醇，其表面活性很强，但碳链很短，不能形成保护膜成保护膜 如果在如果在O/WO/W型乳浊液中加入亲脂性的乳化剂，则乳浊液有型乳浊液中加入亲脂性的乳化剂，则乳浊液有从从O/WO/W转变为转变为W/OW/O型的趋向；但因在转变过程中，其他条件型的趋向；但因在转变过程中，其他条件还不允许形成还不允许形成W/OW/O型乳浊液，而使乳浊液遭到破坏。型乳浊液，而使乳浊液遭到破坏。在在W/OW/O型乳浊液加入亲水性乳化剂：表面活性剂十二烷基型乳浊液加入亲水性乳化剂：表面活性剂十二烷基磺酸钠磺酸钠本讲稿第四十四页，共六十四页（四）溶剂萃取法（四）溶剂萃取法微生
50、物工程下游加工工程微生物工程下游加工工程4.4.萃取方法（混合、分离、回收）萃取方法（混合、分离、回收）（1 1）单级萃取（）单级萃取（97.2%97.2%）（2 2）多级错流萃取（）多级错流萃取（98.79%98.79%）由几个萃取器串联组成，料液经第一级萃取后分离成两个相；由几个萃取器串联组成，料液经第一级萃取后分离成两个相；萃余相流入下一个萃取器，再加入新鲜萃取剂继续萃取；萃取萃余相流入下一个萃取器，再加入新鲜萃取剂继续萃取；萃取相则分别由各级排出，混合在一起，再进入回收器回收溶剂，相则分别由各级排出，混合在一起，再进入回收器回收溶剂，回收得到的溶剂仍作萃取剂循环使用回收得到的溶剂仍作萃