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1、第二章种子扩大培养本讲稿第一页，共二十页 菌种扩大培养的目的 为发酵罐的投料提供足够数量的代谢旺盛的种子发酵罐的投料提供足够数量的代谢旺盛的种子。因为发酵时间的长短和接种量的大小有关，接种量大，发酵时间则短。将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中，就有利于缩短发酵时间，提高发酵罐的利用率，并且也有利于减少染菌的机会。对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长繁殖速度快慢及生产的规模决定种子扩大培养的级数。本讲稿第二页，共二十页 二二.种子扩大培养种子扩大培养(制备制备)阶段阶段 实验室种子的制备：实验室种子的制备：生产车间种子制备生产车间种子制备:A 实验室种子的制备：实验室种子的制备：e.g 产
2、黄青霉菌产黄青霉菌(P.chrysogonum)原始菌种 斜面试管 获得孢子 250ml 茄子瓶（大米或小米）25 28 ，414天 成熟（在真空下抽去水分，使水分含量在10%以下，于4 冰箱保存）。本讲稿第三页，共二十页对于不产孢子的赤霉素生产菌（Gibberelline fujikuroi），也可用大米固体培养基在大米固体培养基在茄子瓶中培养菌丝体，用作种子罐种子。产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌（Sgriseus ），产卡那霉素的卡那链霉菌（Skanamyceticu），可以用摇瓶液体培养法摇瓶液体培养法，孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇床上培养，获得菌丝体，作
3、为种子。不产孢子的细菌，如生产谷氨酸的棒状杆菌（Corynebacterium）、短杆菌（Brevibacterium），生产上一般采用斜面斜面营养细胞进行扩培，再转入液体摇瓶培养，获得细胞悬液再接种。本讲稿第四页，共二十页 e.g.Glutamic acid-producer：（谷氨酸生产菌）：（谷氨酸生产菌）原始菌种（出发菌种）固体试管斜面（32 C，1824小时）三角瓶培养（摇床）(flask culture)种子罐培养 e.g.yeast：原始菌种（出发菌种）10ml 麦汁试管 250ml 三角瓶培养 （27 C 28 C，3天）（25C，2天）510 L卡氏罐（15 C 20 C，3
4、5天）本讲稿第五页，共二十页B：生产车间种子制备：生产车间种子制备：种子罐的作用：使有限数量的孢子(菌体)发芽、生长、并繁殖成大量的菌丝体(菌体)，满足发酵罐的需要（菌体生长和产物形成）。实验室种子进入种子罐有孢子进罐法和摇瓶孢子进罐法和摇瓶菌种菌种进罐法。种子罐级数的确定：种子罐级数是指制备种子逐级扩培的次数。种子罐级数的确定：种子罐级数是指制备种子逐级扩培的次数。依据：菌种生长特性，孢子发芽及菌体繁殖的速度以及所用的发酵罐的容积。种子罐(seeding tank)的级数产物的品种生产规模工艺条件本讲稿第六页，共二十页种子罐级数越少越好，原因：简化生产工艺和控制减少接种带来的染菌机会需考虑：
5、尽量延长发酵罐生产产物的时间，缩短由于种子发芽、生产而占用的非生产时间，以提高发酵罐的生产率产物mlh。e.g.Glutamate fermentation 一级种子扩培 实验室种子 种子罐 发酵罐 e.g.penicillin fermentation 二级种子扩培 实验室种子 一级种子罐 二级种子罐 发酵罐 e.g.Streptomycin fermentation 三级种子扩培实验室种子 一级种子罐 二级种子罐 三级种子罐 发酵罐 (Streptomyces griseus)灰色链霉菌本讲稿第七页，共二十页 种龄与接种量：种龄与接种量：种龄种龄(seed age)指种子罐培养种子从开始至
6、结束的培养时间。指种子罐培养种子从开始至结束的培养时间。在种子罐中，培养时间延长菌体量增加基质消耗及代谢产物积累菌体量不再增加老化过老：生产能力下降，菌体自溶。过嫩：前期生长缓慢，发酵周期延长，产物形成时间推迟，甚至造成异常发酵。适宜时间：以菌体处于生命力极为旺盛的对数生长期（以菌体处于生命力极为旺盛的对数生长期（exponential phase），且培养液中菌体量还未达到最高峰时，较为适宜。），且培养液中菌体量还未达到最高峰时，较为适宜。嗜碱性芽孢杆菌（Bacillus alkalophilus)生产碱性蛋白酶（alkaline proteinase/protease），培养小时接种，酶活
7、最高。本讲稿第八页，共二十页 接种量接种量(seed volume)指移入的种子的体积和接种后培养液的体积比指移入的种子的体积和接种后培养液的体积比。Antibiotic：7%7.5%Glu：1%接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中的繁殖速度。采用较大接种量可以缩短发酵罐中菌体繁殖到达高峰的时间，使产物形成提前。原因：1、种子多，种子液中含有大量的胞外水解酶，有利于对基 质的利用、生产菌迅速占据了整个培养环境，减少染菌机会。但过多，易使菌体（菌丝体）生长过快，培养液粘度增加，溶氧降低，产物合成受影响。e.g.嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶 接种1%，酶活最高；1.5%4%影响不大；大于4%，酶产
8、量明显下降。本讲稿第九页，共二十页 制霉菌素生产中，1%比10%效果好，0.1%与1%效果相当。发酵生产的趋势：采取大接种量及丰富培养基。发酵生产的趋势：采取大接种量及丰富培养基。如谷氨酸：大接种量20%，高生物素，高青霉素的强制发酵工艺。有的采用双种法增大接种量：有的采用双种法增大接种量：两只种子罐 一只发酵罐 如卡那霉素：双种比单种的发酵单位（fermentation titer unit）提高8%，到达产量 高 峰的 时间提前。倒种法：倒种法：将培养适宜的发酵液倒出适量给另一个发酵罐作为种子。如 链霉素：倒种法比单种法的发酵单位提高12%。本讲稿第十页，共二十页 三三.影响种子质量的因素
9、影响种子质量的因素 1.原材料质量：原材料质量：如四环素、土霉素生产中配制孢子培养基的麸皮（wheat bran）、霉菌用的大（小）米、琼脂的牌号的不同、蛋白胨加工原料不同等均影响种子的质量。原料质量的波动，起主要作用的是其中的无机盐含量的不同，如微量元素Mg+、Ca+、Ba+能刺激孢子的形成。P含量的多少也影响种子的质量。氨基酸发酵中，淀粉水解糖制备后，加入其他的营养物（麸皮水解液、豆饼水解液、玉米浆），也对种子质量多少有些影响。一般情况：培养基糖分要少，氮源要多，无机盐所占的比例要大。一般情况：培养基糖分要少，氮源要多，无机盐所占的比例要大。种子罐和发酵罐培养基成分趋于一致也有好处，种子很
10、快适应，但各成种子罐和发酵罐培养基成分趋于一致也有好处，种子很快适应，但各成分的数量根据目的各自确定。分的数量根据目的各自确定。总之，各成分选择得当，才能发挥菌种的特征，提高产量。本讲稿第十一页，共二十页2.培养条件：培养条件：温度、温度、pH值、湿度、培养时间和冷藏时间等都影响种子质量。值、湿度、培养时间和冷藏时间等都影响种子质量。制备斜面孢子培养基的湿度湿度对孢子的数量影响很大。如土霉素生产菌种龟裂霉菌的孢子，在北方干燥地区孢子斜面长的快，在含少量水分的试管斜面培养基中下部孢子长的好，而上部孢子稀少；气温高，湿度大的地区，斜面孢子长的慢，试管下部冷凝水多而不利于孢子形成。一般相对湿度一般相
11、对湿度4045%时孢子数量最多，孢子颜色均匀，质量较好时孢子数量最多，孢子颜色均匀，质量较好。培养时间和冷藏时间对种子和孢子形成都有影响。培养时间和冷藏时间对种子和孢子形成都有影响。如土霉素菌种孢子斜面培养四天左右，即于4冰箱保存，发现冷藏78天菌体自溶，而培养五天以后冷藏，20天未发现自溶。链霉素生产菌，斜面孢子在6 冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低8%。本讲稿第十二页，共二十页 四.种子质量的控制措施 必须保证生产菌种的稳定性 提供种子培养的适宜环境条件，保证无杂菌侵入 1.菌种稳定性的检查：少量菌种-无菌生理盐水-递增稀释-平板划线培养。挑出形态整齐，孢子丰满的菌落进行摇瓶试验，测
12、定其生产能力。2.无菌检查：显微镜观察、种子液进行无菌检验、生化分析。种子液平板划线、斜面培养用肉眼观察是否有异常菌落、异常现象及镜检是否有杂菌。本讲稿第十三页，共二十页五五.种子质量的判断种子质量的判断：考察种子在发酵罐中所表现出来的生产能力。考察种子在发酵罐中所表现出来的生产能力。感官判断：看颜色、闻气味 理化指标测定：1、pH值 2、培养基灭菌后的糖、氨基氮 3、菌体形态、浓度 4、产物量 5、残糖浓度 6、酶活力（如土霉素生产，淀粉酶的活力与发酵单位有一定的关系）。本讲稿第十四页，共二十页六六.工业微生物培养的类型工业微生物培养的类型 静置培养法：静置培养法：即将培养基盛于发酵容器中，
13、在接种后，不通 空气进行培养发酵，也称为嫌气性培养(anaerobic culturing)通气培养法通气培养法：生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长 的环境必须供给空气，以维持一定的溶解氧水平 ，使菌体迅速生长和发酵，也称为好气性 培养 (aerobic culturing)。本讲稿第十五页，共二十页 1 表面培养法（表面培养法（surface culturing)：好氧静置培养法。针对容器内培养基物形态又分为液态表面培养和固体表面培养。相对于容器内培养基体积而言，表面积越大，越易促进氧气由气液界面向培养基内传递。这种方法菌的生长速度与培养基的深度有关，单位体积的表面积越大，生长速度越
14、快。2 固体培养（发酵）法固体培养（发酵）法(solid culturing)：固体培养又分为浅盘(shallow pan)固体培养和深层固体培养，统称曲法培养。它起源于我国酿造生产特有的传统制曲技术。其最大特点是固体曲的酶活力高。本讲稿第十六页，共二十页 3 液体深层培养（发酵）法：液体深层培养（发酵）法：(liquid submerged culturing)液体深层发酵法从罐底部通气，进入的空气由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶解。这种由罐的底部通气搅拌的培养方法，相对于由气液界面靠自然扩散使氧溶解的表面培养法来讲，称为深层培养法。液体曲(liquid koji)、柠檬酸、谷氨酸、肌苷
15、酸(inosinic acid)及其他发酵产品先后采用此法进行生产。特点：容易按照生产菌种对于代谢的营养要求以及不同生理时期特点：容易按照生产菌种对于代谢的营养要求以及不同生理时期的通气、搅拌、温度、培养基中氢离子浓度等条件，选择最佳培养条的通气、搅拌、温度、培养基中氢离子浓度等条件，选择最佳培养条件。件。本讲稿第十七页，共二十页外循环带升式发酵罐 内循环带升式发酵罐本讲稿第十八页，共二十页 小型机械搅拌发酵罐小型机械搅拌发酵罐1三角皮带转轴；2轴承支架；3联轴节；4轴封；5窥镜；6取样口；7冷却水出口；8夹套；9螺旋片；10温度计接口；11轴；12搅拌器；13底轴承；14放料口；15冷水进口
16、；16通风管；17热电偶接口；18挡板；19接压力表；20手孔；21电动机；22排气口；23取样口；24进料口；25压力表接口；26窥镜；27手孔；28补料口本讲稿第十九页，共二十页深层培养的几个主要控制点深层培养的几个主要控制点A 灭菌灭菌(sterilization)：发酵工业要求纯培养。纯培养。因此在种子培养前必须对培养基进行加热灭菌。B 温度控制：温度控制：培养基灭菌后，冷却至培养温度进行培养，由于随着微生物的生长和繁殖，会有热量产生、搅拌产热等，所以为维持温度恒定。C 通气通气(aeration)、搅拌、搅拌(agitation)：空气进入发酵罐前先经过空气过滤器除去杂菌，制成无菌空气，而后由罐底部进入，再通过搅拌将空气分散成微小气泡。搅拌的目的：增加溶解氧；使基质混合均匀；促进热传递。（培养液中的微生物均匀地分散在种子罐内，并使加入的酸和碱均匀分散等）。本讲稿第二十页，共二十页