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1、华中科技大学博士学位论文热休克蛋白70在苯并（a）芘所致DNA损伤修复中的作用和交互作用蛋白分析姓名：段燕英申请学位级别：博士专业：劳动卫生与环境卫生学指导教师：邬堂春20080519华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 I热休克蛋白70在苯并（a）芘所致DNA损伤修复中的作用 和交互作用蛋白分析 热休克蛋白70在苯并（a）芘所致DNA损伤修复中的作用 和交互作用蛋白分析 博士研究生：段燕英博士研究生：段燕英 导导 师：邬堂春师：邬堂春 教授教授 摘摘 要要 真核生物和原核生物在物理、化学和生物应激因素(如高温、多环芳烃、病毒感染等)的作
2、用下，机体会迅速启动高度程序化的热休克反应(heat shock response，HSR)，诱导合成一组高度保守的热休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)。HSPs 是生物界(包括从细菌到人类)经过长期进化仍保留下来的、对体内外不良因素起保护作用的一类蛋白质。根据 HSPs 在 SDS-PAGE 上的结果，按其分子量大小将 HSPs 分为如下几个家族：大分子 HSPs(100 KD)，HSP90(81-99 KD)，HSP70(65-80 KD)，HSP60(55-64 KD)，HSP40(35-54 KD),小分子 HSPs(34 KD)，其中最为主要和重要的是 HS
3、P70 家族的 Hsp70。许多研究提示了其可能的作用和功能如下：1)Hsp70 保护细胞或生物免遭各种应激因素的损害，赋予它们从各种应激中恢复的能力；其中，表现最为明显的是热耐受能力的形成，即当细胞或生物接触亚致死温度后，表现对致死温度的存活率明显增加，并且对其他性质的致死性应激的抵抗能力也可能增强；2)Hsp70 对细胞内重要遗传物质 DNA可能具有重要保护作用,且在生物生长、发育和分化过程中也起着重要作用；3)Hsp70 与体内许多重要生物活性物质(如类固醇、肿瘤坏死因子等)有着密切的联系，参与体内许多调节过程；4)更重要的是，Hsp70 作为分子伴侣，促进蛋白质的合成、折叠、装配和运输
4、，还参与变性蛋白质的清除，这种重要功能可能与热耐受、毒物耐受有关。苯并(a)芘(BaP)是一类来源于有机物不完全燃烧、有致癌性的多环芳烃，可以和 DNA 结合形成加合物，这样的损伤经由核苷酸切除修复途径修复。此外，在 BaP 代谢过程中产生的反应活性氧(ROS)也能对生物大分子造成损害。ROS 对华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 IIDNA 造成的损伤经由碱基切除修复途径修复。本实验在人群和细胞水平的研究结果显示 Hsp70 的表达水平和残留的 BaP 导致的 DNA 损伤负相关，提示 Hsp70可能在对 BaP 所致 DNA 损伤的
5、修复方面发挥了一定作用。Hsp70 正常时主要分布在细胞浆，而有害因素应激时转移入核，且分布于染色体周围，这个重要现象也提示了 Hsp70 在 DNA 保护中的可能作用与意义。DNA 修复在肿瘤形成和治疗方面是一个重要的研究方向，而既往的大多数研究从不同的 DNA 修复途径分别研究它们的重要作用与机制。而多数情况下，环境有害物质对 DNA 造成的损伤需要多种修复途径共同进行修复，需要同时考虑多种蛋白质在 DNA 修复中的作用。Hsp70 是重要的分子伴侣，参与蛋白质的合成、折叠、装配、运输和变性蛋白质的清除等，无疑它也可能与 DNA 修复相关蛋白有关。本研究通过构建高表达和低表达 Hsp70
6、两种细胞模型，用 BaP 处理细胞，利用彗星实验、宿主细胞再活化实验来观察 Hsp70 表达水平不同细胞中修复能力的差异，同时用免疫共沉淀和高效液相色谱-电喷雾-串联质谱检测在 DNA 修复过程中和 Hsp70 结合存在的各种蛋白，从中筛选出可能的 Hsp70 作用底物。并对筛选出来的 Hsp70 交互作用蛋白利用免疫共沉淀、激光共聚焦和放射性自显影进行进一步的确证，为阐述 Hsp70 在 BaP 染毒修复过程中的作用机制提供科学依据。本研究共分四部分。第一部分第一部分 高和低表达高和低表达 Hsp70 细胞模型的建立细胞模型的建立 对于 Hsp70 高表达细胞模型的建立，我们通过转染 16H
7、BE 细胞pcDNA3.1/pcDNA3.1-hsp70 重组质粒，并用 G418 筛选稳定的 Hsp70 高表达细胞株(16HBE/hsp70)。用转染空载体质粒 pcDNA3.1 的 16HBE 细胞作为转染对照(16HBE/pcDNA)。对于 Hsp70 低表达细胞模型的建立我们采用了槲皮素抑制 Hsp70 表达和RNA 干扰技术两种方法，通过对 Hsp70 的表达水平的验证对进行两种方法的效果进行比较。槲皮素(QCT)是一种广泛存在的生物黄酮类物质，可以抑制某些肿瘤细胞华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 IIIHsp70 的合成
8、，使 Hsp70 表达降低。我们首先采用不同浓度槲皮素(50、100、150、200M)处理 16HBE 细胞 6h，监测细胞存活率的同时用 Western-blot 技术检测槲皮素处理后，16HBE 细胞中 Hsp70 蛋白的表达。结果发现，随着槲皮素浓度的增加，16HBE 细胞的 Hsp70 的表达呈下降趋势。50M 槲皮素处理时，Hsp70 表达即观察到显著下降(P 0.05)。槲皮素浓度为 100M 时，对 Hsp70 的表达抑制了 53%，稍高于沉默组，但是由于槲皮素对 Hsp70 的抑制是非特异性的，因而采用 RNA 干扰技术进行后续的相关研究。华 中 科 技 大 学 博 士 学
9、位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 IV第二部分第二部分 Hsp70 在在 B(a)P、BPDE 所致所致 DNA 损伤修复中的作用损伤修复中的作用 为比较 B(a)P 染毒后，不同 Hsp70 表达水平的 16HBE 细胞 DNA 修复能力的差异，本部分首先用彗星试验检测 16M BaP 染毒 16HBE 细胞 2h，恢复不同时间(0，2，4，8，24h)，Hsp70 表达水平不同的细胞对 DNA 损伤的修复差异。所 设 八 组 细 胞 Control、16HBE/HK、16HBE/RNAi、16HBE/hsp70、16HBE/pcDNA、DMSO、S9、NC(norm
10、al cultured)在处理后存活率均大于 80%，并且在 DMSO、S9 和 NC 组中，存活率大于 90%，均符合毒理学要求。彗星实验结果表明随着恢复时间的延长，各组细胞 OTMs 均下降，说明残留 DNA 损伤的减少。在恢复前 2h 内，降低迅速，提示这个时间段为修复最活跃阶段。在 2h到 8h，速度减慢。24h 后，OTMs 基本达到正常水平（NC，normal cultured，显示正常培养时的 OTMs），提示修复过程基本完成。高表达 Hsp70 组在修复最活跃的前 2h 相对于对照组，OTMs 值降低更迅速，说明高表达 Hsp70 组修复进行得更快。并且在恢复的各个时间点，高表
11、达 Hsp70 组残留的 OTMs 值均小于对照组，且差异有极显著性（P0.01）。而在低表达 Hsp70 组中，在修复最活跃的前 2h 内 OTMs 的降低速度和对照组相比明显减慢（P0.01）。由此可见，在修复最活跃的前 2h 的结果提示，Hsp70 参与了 BaP 造成的 DNA 损伤的修复过程，它可以促进细胞对这种损伤的修复。这可能与作为分子伴侣的 Hsp70 可以帮助变性受损的蛋白质复性或降解有关，高表达的 Hsp70 增强了分子伴侣作用，保持了蛋白质的稳态，减轻了细胞的损伤。BPDE 是 BaP 的代谢终产物，可以与 DNA 的亲核位点，即鸟嘌呤的外环胺基端共价结合形成 BPDE-
12、DNA 加合物，导致特异性突变。这样的加合物损伤可以通过核苷酸切除修复（NER）途径修复，如果没有得到及时有效的修复就会导致肿瘤的形成。Hsp70 是 HSPs 家族中的重要成员,多项研究显示在 DNA 毒性应激因素作用下，Hsp70 的表达水平和残留的 DNA 损伤负相关。有研究发现这种伴侣蛋白在碱基切除机制修复(BER)和错配修复(MMR)中都发挥了一定的作用，但在 NER 方面，真核生物方面尚缺乏相关研究。故本部分拟在这方面作一华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 V些探讨，研究 Hsp70 是否参与了对 BPDE 所致加合物损伤的
13、核苷酸切除修复。宿主细胞再活化实验(HCR)是通过瞬时转染被不同浓度 BPDE（10、20、30、40M）损伤的萤火虫荧光素酶报告基因的 pCMVluc 质粒，40h 后检测宿主细胞对损伤质粒 DNA 的修复情况，根据宿主细胞表达荧光物质的含量来评估宿主细胞的 DNA 整体修复能力。高表达 Hsp70 组相对对照组，荧光素酶的表达明显提高，说明对加合物损伤的修复能力的增强，且在 10M 时，P0.01，在 20M 时，P0.05。低表达 Hsp70 组相对对照组，荧光素酶的表达显著降低，提示其修复能力的减弱，且在 10M 时，P0.05。第三部分第三部分 BaP 作用下作用下 Hsp70 交互
14、作用蛋白的鉴定交互作用蛋白的鉴定 本研究第二部分的研究结果显示，Hsp70 表达不同的 16HBE 细胞在对 BaP、BPDE 所致 DNA 损伤的修复中，表现不同的修复能力。这样的结果提示 Hsp70可能在这一过程中发挥了作用。Hsp70 作为一种分子伴侣，可以帮助蛋白质维持正确的构象、对变性蛋白进行修复或者降解，因此，我们猜想可能存在一些蛋白底物，Hsp70 通过和这些蛋白底物作用而在 DNA 修复过程中发挥一定的作用。在本部分中，16M B(a)P 染毒 16HBE 细胞 2h 恢复 4h 后，运用免疫共沉淀把在修复过程中和 Hsp70 有交互作用的所有蛋白沉淀下来，并对其进行高效液相色
15、谱电喷雾串联质谱分析（HPLC ESI MS/MS）。样本中总共有 730 种蛋白被检测，我们对其中含量较高的 84 种蛋白进行了分析，根据 swiss-prot database 蛋白质数据库(http:/www.expasy.org)提供了蛋白质的各种说明，包括蛋白名称、起源、功能、交互作用、结果等，把这 84 种蛋白分成了 13 个功能组，分别是细胞结构和移动（14%）、蛋白质代谢和修饰（12%）、DNA 稳定性（6%）、细胞内和细胞间信号（7%）、细胞分化和增殖（74%）、蛋白交互作用（6%）、凋亡（5%）、核酸代谢（5%）、生理功能的执行（6%），细胞损伤保护（2%）、能量代谢（1%
16、），未知部分和其他部分（27%）。从结果可见，在修复过程中，Hsp70 不仅和参与生理功能的蛋白质有交互作用，而且和维持 DNA 稳定、抵抗细胞损伤的蛋白质之间也有交互作用，Hsp70 可能是通过复杂的功能网络参与 BaP 所致损伤的修复，这为进一步阐述 Hsp70 在修复过程中所发挥的多重功能提供了线索。华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 VI第四部分第四部分 BaP 作用下作用下 Hsp70 和和 CKII 的交互作用的交互作用 及及 Hsp70 对对 CKII 活性的影响活性的影响 多种研究结果提示 Hsp70 和 DNA 修复关
17、系密切。Bases 首先发现 Hsp70 能促进人白血病细胞对射线照射的修复，参与了氧化性损伤的碱基切除修复过程。而后有研究者报道 Hsp70 通过促进碱基切除修复过程中关键酶的活性，如 APE和 poly 而促进修复。原核生物中的 Hsp70，即 DnaK 也参与了核苷酸切除修复过程。在前一部分的结果中的酪蛋白激酶 II（CKII），它是恢复阶段和 Hsp70 相互作用的重要蛋白。CKII 本身是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，可以通过磷酸化XRCC1、XRCC4 和 APE 而促进氧化性损伤的修复，此外，CKII 也和核苷酸切除修复途径的重要修复酶 XPB 有关。由于 Hsp70 和 CKII 在
18、 DNA 修复方面都参与了 NER 和 BER，在 BER 过程中有共同底物的 APE，而我们上部分的结果发现两者在修复过程中是复合存在的。故在本部分中，运用免疫共沉淀和激光共聚焦技术对两者的交互作用进行深入研究，并用放射性自显影技术检测 Hsp70 是否对 CKII 的活性有影响。Hsp70 和 CKII 免疫共沉淀结果显示，在兔抗人 Hsp70 抗体沉淀下来的复合物中，有 CKII 的存在。逆向免疫共沉淀即在羊抗人 CKII 抗体沉淀下来的复合物中也检测到了 Hsp70 的存在。在 16HBE 细胞 BaP 染毒和不染毒时，我们得到了相同的结果。考虑到 DNA 修复是发生在细胞核内的，我们
19、进一步用激光共聚焦技术来检测这两种蛋白质的位置关系，结果发现 Hsp70 和 CKII 在不染毒时主要分布在细胞浆，两者大部分重合。在 BaP 染毒后这两种蛋白均有一部分进入了细胞核，并且在某些位置明显重合。而测定不同 Hsp70 表达水平的细胞中的CKII 活性结果显示高表达 Hsp70 细胞 CKII 活性比对照组增高（P0.05）而低表达 Hsp70 细胞中 CKII 活性则降低。综上所述，本研究的结果如下：(1)确定了 100M 的槲皮素为抑制 16HBE 细胞 Hsp70 表达的最佳剂量，采用含 hsp70 基因的 cDNA 重组质粒进行细胞转染并经筛选建立了稳定的 Hsp70高表达
20、细胞株。华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 VII(2)Hsp70 可以增强 BaP、BPDE 所致 DNA 损伤的修复。(3)在 B(a)P 染毒恢复阶段，Hsp70 与维持 DNA 稳定、细胞结构和移动等多种功能的蛋白质结合存在。(4)Hsp70 和修复密切相关的蛋白 CKII 在未染毒时在胞浆结合，染毒后均进入胞核并结合存在，并且高表达的 Hsp70 可以增强 CKII 的活性。本研究的创新之处在于：(1)同时使用了高表达和低表达 Hsp70 的细胞模型，为探讨 Hsp70 的功能提供有力的依据，可以从正反两个方面同时验证 Hsp
21、70 的功能；(2)考虑到了 Hsp70 作为分子伴侣的性质，从对其底物的研究入手以阐述它在 DNA 修复中的具体作用。本课题有待深入研究的方面有：(1)Hsp70 和 CKII 的相互关系尚需进一步研究，特别是 Hsp70 参与 DNA 修复的具体机制还有待深入的阐述；(2)DNA 整体修复能力的测定如何应用于人群现场流行病学调查，如何应用于职业性有害因素对机体 DNA 损伤修复的评价，还需要进一步的探讨。关键词：关键词：热休克蛋白 70，DNA 修复，BaP，彗星实验，宿主细胞再活化实验，免疫共沉淀，激光共聚焦，高效液相色谱-电喷雾-串联质谱分析。华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论
22、 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 VIIIT Th he e r ro ol le e o of f HHs sp p7 70 0 i in n t th he e r re ep pa ai ir r o of f B Ba aP P-i in nd du uc ce ed d d da amma ag ge es s a an nd d i it ts s i in nt te er ra ac ct ti in ng g p pr ro ot te ei in ns s Candidate for Ph.D.:Yanying Duan Supervisor:Profes
23、sor Tangchun Wu ABSTRACT Heat shock proteins(Hsps)are highly conserved proteins which are triggered in all organisms exposed to environmental stressors such as elevated temperature,nicotinamide,carbon monoxide,heavy metals,ionization,ischemia and hypoxia.Based upon their apparent molecular weight,HS
24、Ps are divided into many groups such as high-molecular-mass HSPs(100 kD),HSP90(81 to 99 kD),HSP70(65 to 80 kD),HSP60(55 to 64 kD),HSP40(35 to 54 kD),and small HSPs(34 kD).The HSP70 family have been extensively studied which are found to function as molecular chaperones,assisting nascent polypeptides
25、 proper configuration and facilitating the misfolding peptides degradation.Their overexpressions greatly change the tolerance and sensitivity of organism to physical,chemical and biological harmful stimuli.Hsp70 was mainly in cytoplasm under physiological condition but moved to nucleus when organism
26、 was under stress,besides,two previous research in our lab found that Hsp70 level was inversely correlated to residual DNA damage,which both hint that Hsp70 may be involved in DNA repair.However,many related research was base on a relation between Hsp70 and DNA repair and that whether Hsp70 plays a
27、role in the DNA repair remains unknowed.Considering the molecular chaperone essence of Hsp70,there may be some protein substrates,through which Hsp70 modulate the DNA repair process.In this study,we investigated the possible roles of Hsp70 in DNA repair in 16HBE 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博
28、士 学 位 论 文 IXcells by either knocking-down or overexpressing Hsp70 expression level under BaP treatment.The repair of BaP-induced damage,assessed by residual DNA damage,was measured by comet assay and the repair of DNA adducts was assessed by host cell reactivation assay.Later,immunoprecipitation(IP)
29、and high performance liquid chromatography electrospray ionisation tandem mass spectrometry(HPLC ESI MS/MS)were further applied to detect the Hsp70-interacting proteins,among which casein kinase II(CKII),a Ser/Thr protein kinase,was an important protein involved in DNA repair.IP assay,confocal micro
30、scopy analysis and autoradiography were further performed to characterize the interaction between Hsp70 and CKII.Part Establishment of 16HBE cell models with over-expressed and knocked-down Hsp70 levels 16HBE cells were transfected with recombinant plasmid pcDNA3.1/hsp70.And the positive clones appe
31、ared after a selection for 2 weeks by 800 g/ml G418(neomycin).Positive clones were expanded and analyzed with the expression of Hsp70.The control group was transfected with pcDNA3.1 plasmids containing the neomycin resistance gene but not hsp70 cDNA.We developed stably transfected 16HBE cell lines w
32、ith overexpressed Hsp70(16HBE/hsp70)or with neomycin resistance gene but not hsp70 cDNA(16HBE/pcDNA).To inhibit the expression of Hsp70,16HBE cells were treated with different concentrations of quercetin(QCT)(50,100,150,200M)for 6h,then water bathing for 1h at 42C.The leves of Hsp70 in different dos
33、e groups were assessed by western blot.Compared with the control group,there was a significant decrease of Hsp70 in 50M group(P 0.01)and in the following dose groups(P 0.01).As for cell survival rate,it was above 90%when the concentration of QCT was less than 150M and it decreased to 87%when the con
34、centration of QCT was 150M.According to both cell survival rate and Hsp70 levels caused by different concentrations of QCT,华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 X100M QCT,which can inhibit Hsp70 level to 47%,were chosen to inhibit Hsp70 expression of 16HBE cells in QCT treatment model.RNA i
35、nterference(RNAi)is the technique employing double-stranded RNA to target the destruction of homologous messenger RNAs.RNAi utilizes short double-stranded RNA to selectively inhibit gene expression of complementary RNA nucleotide sequences after transcription,but prior to translation.It has gained w
36、ide usage in genetics,having the potential for many practical applications.Because of the great progress made during the development,RNAi was estimated the top 10 scientific advancement in 2001.We could transfect plasmid coding small hairpin RNA(shRNA)or small interference RNA(siRNA)to specifically
37、knock down certein gene,in this study,we selected the former to knock down the expression of Hsp70.Forty-eight hour after transfection,we appraised the expression levels of Hsp70 with western blot.The result showed that Hsp70 expression was decreased by approximately 50%.And we determined to apply R
38、NAi to knock down Hsp70 level in the following study.Later we applied immunocytochemistry and western blot to assess the Hsp70 expression in five groups,16HBE/hsp70,16HBE/pcDNA,16HBE/RNAi,16HBE/HK and 16HBE.The signals in 16HBE/hsp70 group was obviously enhanced,while in 16HBE/RNAi group,relative we
39、ak signal was observed.There were almost similar signals among 16HBE,16HBE/HK and 16HBE/pcDNA groups.We next validated the results of immunocytochemistry signals by western blot.Results demonstrated that 16HBE/RNAi group intensity was notably reduced while intensity was greatly enhanced in 16HBE/hsp
40、70 group.The quantified results showed that compared with the 16HBE group,the Hsp70 expressions in 16HBE/RNAi group was decreased by approximately 50%and in 16HBE/hsp70 groups,it was nearly 200%both with statistical significance(P0.01).华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 XIPart Roles of H
41、sp70 plays in the DNA repair of BaP-and BPDE-induced damages To evaluate the effect of Hsp70 on DNA repair,we exposed cells with knocked-down,normal and over-expressed Hsp70 to benzo a pyrene(BaP)and incubated cells for 0,2,4,8 and 24h.The repair kinetics of the different groups,measured as a reduct
42、ion of OTMs with time,was determined by alkaline comet assay.Survival rate was above 80%in all groups and was above 90%in DMSO,S9 and NC group determined by trypan blue exclusion experiment and an electronic counter,which accorded with the requirement of toxicology.The result of comet assay showed t
43、hat the OTMs in all groups decreased with the repair time,indicating that the residual DNA damage decreased.The formation of DNA stand lesion induced by BaP appeared to be a rapid event.After BaP exposure,the extent of DNA migration in all groups was significantly increased(P 0.01),compared with the
44、 NC group,indicative of the initial excision repair or lasting strand lesion.The DNA migration decreased promptly within 2h,appeared to be somewhat slower afterward and nearly came to the level similar to the NC group at 24 h,suggestive the almost completion of the repair at this time point.In overe
45、xpressed Hsp70 group,i.e.the 16HBE/hsp70 group,the OTMs in the early 2h decreased faster than those in the control group with statistical difference(P 0.01),presenting an enhanced DNA repair capacity of 16HBE with a higher Hsp70 level.While in the knocked-down Hsp70 group,namely,the 16HBE/RNAi group
46、,the OTMs in the early 2h decreased slower than those in the control group with statistically significant difference(P 0.01),suggesting a reduced repair capacity of 16HBE with a lower Hsp70 level.BaP treatment induced very little late apoptosis which gived no false positive results in the comet assa
47、y.No statistical significances were found among control,HK,pcDNA3.1,S9 and DMSO groups at all the repair time points.Our resuts indicated that Hsp70 can promote the repair of damages induced by BaP,which to some extent,may result from the chaperone function of Hsp70.华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大
48、学 博 士 学 位 论 文 XIIThe ultimate metabolite of BaP,(t)-anti-BaP-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxide(BPDE)can also results in DNA lesion by forming covalent DNA adducts,which were repaired by nucleotide excision repair(NER)or resulted in cancer.Several studies showed that the expression of Hsp70 reversely rela
49、ted to the residual DNA damage.And other researchers reported that this chaperone was involved in base excision repair(BER)as well as mismatch repair(MMR).In NER,research related to Escherichia coli supported the involvement of DnaK(Hsp70)in NER,whereas in eukaryote,whether Hsp70 plays a role in DNA
50、 repair remains unknowed.In the following study,we plan to explore whether Hsp70 is involved in DNA adduct repair capacity.A host cell reactivation assay was conducted in which BPDE-damaged luciferase reporter plasmid was transiently transfected into cells for DNA repair and luciferase gene expressi