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1、关于血红蛋白的提取与分离第1页，讲稿共32张，创作于星期三 本课题学习目标本课题学习目标 体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。子的基本原理。1 1 1 1、主要概念：、主要概念：、主要概念：、主要概念：凝胶色谱法凝胶色谱法 电泳法电泳法 缓冲溶液缓冲溶液 它们在它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。血红蛋白的提取中分别起到什么作用。2.2.2.2.主要原理：主要原理：主要原理：主要原理：凝胶色谱法分离蛋白质的原理凝胶色谱法分离蛋白质的原理 电泳法分离电
2、泳法分离样品的原理样品的原理 缓冲溶液的组成和作用机理缓冲溶液的组成和作用机理3 3 3 3、课题重点：、课题重点：、课题重点：、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法凝胶色谱法的原理和方法 4 4 4 4、课题难点：、课题难点：、课题难点：、课题难点：样品的预处理样品的预处理 色谱柱填料的处理和色色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。谱柱的装填。第2页，讲稿共32张，创作于星期三 2003200320032003年年年年4 4 4 4月月月月14141414日宣布人类基因组序列图完成，这标日宣布人类基因组序列图完成，这标日宣布人类基因组序列图完成，这标日宣布人类基因组序列图完成，这标志着进入了后基因组和
3、蛋白质组时代志着进入了后基因组和蛋白质组时代志着进入了后基因组和蛋白质组时代志着进入了后基因组和蛋白质组时代人类基因组：人类基因组：人类基因组：人类基因组：指指指指DNADNADNADNA分子所携带的全部遗传信息分子所携带的全部遗传信息分子所携带的全部遗传信息分子所携带的全部遗传信息 蛋白质组：蛋白质组：蛋白质组：蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对蛋白质功能的研究对蛋白质功能的研究对蛋白质功能的研究对蛋白质功能的研究第3页，讲稿共32张，创作于星期三血血液液血浆血浆
4、水水 分分固体物质：固体物质：血浆蛋白、血浆蛋白、血浆蛋白、血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等血细血细 胞胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞（最多）（最多）（最多）（最多）血红蛋白血红蛋白（90909090）两个两个肽链肽链两个两个一肽链一肽链四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团2.2.提问：提问：提问：提问：血液有哪些成分？血液有哪些成分？血液有哪些成分？血液有哪些成分？1.1.1.1.提问：提问：提问：提问：用鸡的红细胞提取用鸡的红细胞提取用鸡的红细胞提取用鸡的红细胞提取DNADNADNADNA，用人的红细胞提取，用人的红细胞
5、提取，用人的红细胞提取，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？血红蛋白的原因是什么？血红蛋白的原因是什么？血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNADNADNADNA，便于进行，便于进行，便于进行，便于进行DNADNADNADNA的的的的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。丰富，便于提取血红蛋白。丰富，便于提取血红蛋白。丰富，便
6、于提取血红蛋白。血红蛋白血红蛋白血红蛋白血红蛋白第4页，讲稿共32张，创作于星期三血红蛋白血红蛋白两个两个肽链肽链两个两个一肽链一肽链四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团每个肽链环绕一个每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，亚铁血红素基团，此基团可携带此基团可携带一分子氧或一分子二一分子氧或一分子二氧化碳，氧化碳，血红蛋白因含有血红蛋白因含有血红素血红素而而呈呈红色。红色。血红蛋白的特点：血红蛋白的特点：血红蛋白的特点：血红蛋白的特点：第5页，讲稿共32张，创作于星期三1.1.分离生物大分子的基本思路：分离生物大分子的基本思路：选用一定的选用一定的物理或化学物理或化学的方法分离具有不同物理或的方法分离具
7、有不同物理或化学性质的化学性质的生物大分子生物大分子。2.2.蛋白质分离和提取的原理：蛋白质分离和提取的原理：根据蛋白质根据蛋白质各种特性各种特性的差异，如的差异，如分子的形状和大小、分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力的亲和力等等，可以用来分离等等，可以用来分离不同种类不同种类的蛋白质。的蛋白质。一、血红蛋白的提取和分离一、血红蛋白的提取和分离3.3.高温灭菌和酒精灭菌的结果：高温灭菌和酒精灭菌的结果：使微生物的使微生物的蛋白质发生蛋白质发生变性变性、蛋白质的蛋白质的空间结构空间结构被破坏。被破坏。第6
8、页，讲稿共32张，创作于星期三（一）（一）凝胶色谱法（凝胶色谱法（分配色谱法分配色谱法）2.凝胶：大多数凝胶是由大多数凝胶是由多糖类化合物多糖类化合物（如（如葡聚糖或葡聚糖或琼脂糖琼脂糖）构成的）构成的多孔多孔小球体，小球体，内部有许多贯穿的内部有许多贯穿的通道通道。根据被分离物质的蛋白质根据被分离物质的蛋白质相对分子质量相对分子质量的大的大 小，小，利用具有利用具有网状结构网状结构的凝胶的的凝胶的分子筛分子筛作用，来进行作用，来进行分离。分离。1.概念：3.凝胶色谱法的原理分子筛效应：当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进
9、入凝胶内部的通道，路程较长，移量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢动速度较慢;而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。依据的特性是：依据的特性是：依据的特性是：依据的特性是：蛋白质分子量的大小。蛋白质分子量的大小。蛋白质分子量的大小。蛋白质分子量的大小。第7页，讲稿共32张，创作于星期三4.4.凝胶色谱法分离蛋白质分离蛋白质的原理和具体过程具体过
10、程第8页，讲稿共32张，创作于星期三 （二）缓冲溶液（二）缓冲溶液 1.1.概念概念:在一定的范围内，凡是能够抵制在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强外加少量强酸或强碱酸或强碱的影响使原来溶液的影响使原来溶液PHPH值基本保持值基本保持不变的混不变的混合溶液。合溶液。能够抵制能够抵制外界的酸和碱外界的酸和碱对溶液对溶液PHPH值值的影响，的影响，维持维持PHPH基本不变。基本不变。2.2.作用作用:3.3.缓冲溶液的配制缓冲溶液的配制:通常由通常由1 12 2 种缓冲剂种缓冲剂溶解于水溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的中配制而成。调节缓冲剂的使用比例使用比例就可以制得在就可以制得在不同不同PH
11、PH范范围内围内使用的缓冲液。使用的缓冲液。4.4.4.4.提问：在本课题中使用的缓冲液是提问：在本课题中使用的缓冲液是提问：在本课题中使用的缓冲液是提问：在本课题中使用的缓冲液是:_:_:_:_,其目的是其目的是其目的是其目的是:利用缓冲液模拟细胞内的利用缓冲液模拟细胞内的PHPH环境，保证环境，保证 血红蛋白的正常结构和功能，便于观察血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色红色红色红色)和科和科 学研究学研究(活性活性活性活性)磷酸缓冲液磷酸缓冲液第9页，讲稿共32张，创作于星期三 缓冲溶液的组成及分类缓冲溶液的组成及分类弱酸及其对应的盐：弱酸及其对应的盐：弱碱及其对应的盐：弱碱及其对应的
12、盐：多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐:H H H H2 2 2 2COCOCOCO3 3 3 3NaHCONaHCONaHCONaHCO3 3 3 3；CHCHCHCH3 3 3 3COOHCHCOOHCHCOOHCHCOOHCH3 3 3 3COONaCOONaCOONaCOONaNHNHNHNH3 3 3 3HHHH2 2 2 2ONHONHONHONH4 4 4 4CL;NHCL;NHCL;NHCL;NH4 4 4 4OHNHOHNHOHNHOHNH4 4 4 4CLCLCLCLNaHCONaHCONaHCONaHCO3 3 3 3NaNaNaNa2 2
13、2 2COCOCOCO3 3 3 3 ；NaHNaHNaHNaH2 2 2 2POPOPOPO4 4 4 4NaNaNaNa2 2 2 2HPOHPOHPOHPO4 4 4 4 缓冲溶液由足够浓度的共轭酸碱对组成。其中，能对缓冲溶液由足够浓度的共轭酸碱对组成。其中，能对抗外来强碱的称为抗外来强碱的称为共轭酸共轭酸；能对抗外来；能对抗外来强酸的称为强酸的称为共轭碱共轭碱。这一共轭酸碱通常称为。这一共轭酸碱通常称为缓冲对、缓缓冲对、缓冲剂或缓冲系冲剂或缓冲系。常见的缓冲对主要有如下常见的缓冲对主要有如下三种类型：三种类型：第10页，讲稿共32张，创作于星期三 （三）（三）电泳：电泳：1.1.概念：
14、概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.2.原理：原理：许多重要的生物大分子，如多肽、许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的核酸等都具有可解离的基团，在一定的PHPH下，这些下，这些基团会带上正电或负电。基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的
15、迁移速度，从而实现样品中各种分子的产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离分离。3.3.类型类型:琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。第11页，讲稿共32张，创作于星期三 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其在电场的作用下，这些带电分子会向着与其在电场的作用下，这些带电分子会向着与其在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动所带电荷相反的电极移动所带电荷相反的电极移动所带电荷相反的电极移动琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图第12页，讲稿共32张，创作于星期三 聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰
16、胺凝胶电泳 1 1、在测定蛋白质分子量时常用、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠（SDSSDS）聚丙稀酰胺凝胶电泳。聚丙稀酰胺凝胶电泳。聚丙稀酰胺凝胶是由聚丙稀酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂单体丙烯酰胺和交联剂N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺在甲叉双丙烯酰胺在引发剂引发剂和和催化剂催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。胶。第13页，讲稿共32张，创作于星期三 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率迁移率取决取决于它所带于它所带净电荷净电荷的多少以及的多少以及分子的大小分子的大小等因素。等因素。（SDSSD
17、SSDSSDS的作用）的作用）的作用）的作用）为了消除为了消除净电荷对迁移率的影响，净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入可以在凝胶中加入SDSSDS。2.2.原理：原理：聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳 SDSSDSSDSSDS能使蛋白质发生完全变性能使蛋白质发生完全变性能使蛋白质发生完全变性能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的。由几条肽链组成的蛋白蛋白质复合体质复合体在在SDSSDS的作用下会的作用下会解聚成单条肽链解聚成单条肽链解聚成单条肽链解聚成单条肽链，因此测定的结，因此测定的结果只是果只是单条肽链的分子量单条肽链的分子量单条肽链的分子量单条肽链的分子量。SDSSDS能与各种
18、蛋白质形成能与各种蛋白质形成蛋白蛋白蛋白蛋白质质质质SDSSDSSDSSDS复合物复合物复合物复合物，SDSSDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子分子原有电荷量原有电荷量原有电荷量原有电荷量。因而掩盖了。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差不同种蛋白质间的电荷差不同种蛋白质间的电荷差不同种蛋白质间的电荷差别别别别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。3.SDS3.SDS作用机理作用机理:第14页，讲稿共32张，创作于星期三用用SDSSDS测定蛋白质分子量的方法测定蛋白质分子量的方法 使用使用SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝
19、胶电泳测定蛋白质测定蛋白质的分子量时，可选用一组的分子量时，可选用一组已知分子量的标准已知分子量的标准蛋白蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的蛋白的电泳区带位置电泳区带位置，用，用电泳迁移率和分子电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线量的对数作标准曲线，可以测定，可以测定未知蛋白质未知蛋白质的的分子量。分子量。市场上有高分子量、次高分子量及市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。低分子量的标准蛋白试剂出售。第15页，讲稿共32张，创作于星期三 二、实验操作二、实验操作样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定1.1.1.1.样品
20、处理：样品处理：样品处理：样品处理：（一）蛋白质提取和分离步骤（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程（二）操作过程 本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分离血红蛋白。动物的血液来分离血红蛋白。(1)(1)(1)(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤红细胞的洗涤红细胞的洗涤:洗涤目的洗涤目的洗涤目的洗涤目的:去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少。分离纯化，洗涤次数不可过少。洗涤操作：洗涤操作：洗涤操作：洗涤操作：1 1、采集血样。、采集血样。2 2、低速短时间离心、低速短时间离心（速度（速度越高和时间越长，
21、会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）不到分离的效果）3 3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。4 4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.90.9的氯化钠溶液的氯化钠溶液洗涤。洗涤。5 5、低速离心、低速离心（低速短时间）（低速短时间）6 6、重复、重复4 4、5 5步骤三次，步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。第16页，讲稿共32张，创作于星期三(2)(2)(2)(2)血红蛋白的释放：血红蛋白的释放：血红蛋白的释放：血
22、红蛋白的释放：加蒸馏水到加蒸馏水到原血液体积原血液体积，再加，再加4040体体积的积的甲苯甲苯 ，置于，置于磁力搅拌器磁力搅拌器上充分搅拌上充分搅拌1010分钟（分钟（加速加速细胞破裂细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。细胞破裂释放出血红蛋白。(3)(3)(3)(3)分离血红蛋白溶液：分离血红蛋白溶液：分离血红蛋白溶液：分离血红蛋白溶液：过程：过程：过程：过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，将搅拌好混合液转移到离心管内，以以2000r/min2000r/min的速度离心的速度离心10 min10 min。试管中试管中试管中试管中溶液层次：溶液层次：溶液层次：溶液层次：第第1 1层（最上层）：甲
23、苯层（层（最上层）：甲苯层（无无色透明色透明）；第）；第2 2层（中上层）：脂溶性物质沉层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（淀层（白色薄层固体白色薄层固体）；第）；第3 3层（中下层）：层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（血红蛋白的水溶液层（红色透明液体红色透明液体）；）；第第4 4层（最下层）：杂质沉淀层（层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色暗红色）。）。分离：分离：分离：分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色红色透明液体透明液体。二、实验操作二、实验操作第17页，讲稿共32张，创作于星期三甲苯层甲苯层
24、甲苯层甲苯层（无色透明无色透明无色透明无色透明）白色薄层固体白色薄层固体白色薄层固体白色薄层固体红色透明液体红色透明液体红色透明液体红色透明液体杂质沉淀层杂质沉淀层杂质沉淀层杂质沉淀层（暗红色暗红色暗红色暗红色）试管中溶液层次试管中溶液层次第18页，讲稿共32张，创作于星期三(4)(4)(4)(4)透析：透析：透析：透析：过程：过程：过程：过程：取取1ml1ml的的血红蛋白溶液装入透血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放析袋中，将透析袋放入盛有入盛有300ml300ml的物质的物质的量浓度为的量浓度为20mmol/l20mmol/l的的磷酸缓冲磷酸缓冲液液中（中（pHpH为为7.07.0），），
25、透析透析1212小时。小时。透透透透析目的：析目的：析目的：析目的：除去样品除去样品中分子量较小的杂中分子量较小的杂质。质。二、实验操作二、实验操作第19页，讲稿共32张，创作于星期三2.2.凝胶色谱操作凝胶色谱操作:（1 1 1 1）凝胶色谱柱的制作：）凝胶色谱柱的制作：）凝胶色谱柱的制作：）凝胶色谱柱的制作：取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米的玻璃管，厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。两端需用砂纸磨平。底底塞的制作：塞的制作：打孔打孔挖出凹穴挖出凹穴安装移液管头部安装移液管头部覆盖尼龙网，再用覆盖尼龙网，再用100100目尼龙纱包好，插到玻璃管的目尼龙纱包好，插到玻璃管的一
26、一端端。注意事项注意事项注意事项注意事项：底塞中插入的玻璃管的底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。体残留，蛋白质分离不彻底。顶塞的制作：顶塞的制作：打孔打孔安装玻璃管安装玻璃管。组装：组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体将上述三者按相应位置组装成一个整体。安装其他附属安装其他附属结构。结构。第20页，讲稿共32张，创作于星期三 （2 2）凝胶色谱柱的装填）凝胶色谱柱的装填 凝胶的选择：凝胶的选择：凝胶的选择：凝胶的选择：A A、材料：、材料：交联葡聚糖凝胶（交联
27、葡聚糖凝胶（G-75G-75）。）。B B、代表意义：、代表意义：“G”G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围离范围。7575表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.57.5克。克。凝胶的前处理：凝胶的前处理：凝胶的前处理：凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：配置凝胶悬浮液：计算并称取一计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。凝胶悬浮液。凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：A A、固定：、固定：
28、将色谱柱装将色谱柱装置固定在支架上。置固定在支架上。B B、装填：、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：注意：1 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。空隙。2 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。第21页，讲稿共32张，创作于星期三 洗涤平衡：洗涤平衡：洗涤平衡：洗涤平衡：装填完毕后，装
29、填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm50cm高的操作压下，用高的操作压下，用300ml300ml的的20mmol/l20mmol/l的的磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pHpH为为7.07.0）充分洗涤平衡充分洗涤平衡1212小时小时。注注注注意：意：意：意：1 1、液面不要低于凝胶表面，、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。分子物质的分离效果。2 2、不能、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象现象。（2 2）凝胶色谱柱的装填）凝胶色谱
30、柱的装填50cm50cm高高高高第22页，讲稿共32张，创作于星期三（3 3）样品加入与洗脱）样品加入与洗脱 调节缓冲液面：调节缓冲液面：调节缓冲液面：调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。平齐，关闭出口。滴加透析样品：滴加透析样品：滴加透析样品：滴加透析样品：吸管吸吸管吸1ml1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：样品渗入凝
31、胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。洗脱：洗脱：洗脱：洗脱：小心加入小心加入pH=7.0 pH=7.0 的的20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。收集：收集：收集：收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每，每5ml5ml收集一试管，连续收集。收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红
32、色区带均匀一（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）致的移动，说明色谱柱制作成功）注意：注意：注意：注意：正确的加样操作：正确的加样操作：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。、贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。第23页，讲稿共32张，创作于星期三（3 3）样品加入与洗脱）样品加入与洗脱注意：注意：注意：注意：正确的加样操作是：正确的加样操作是：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。、贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。第24页，
33、讲稿共32张，创作于星期三思考下面的问题：思考下面的问题：让血红蛋白处在稳定的让血红蛋白处在稳定的pHpH范围内，维持结构和功能。范围内，维持结构和功能。1 1 1 1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？么？么？么？2 2 2 2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行、与其他真核细胞相
34、比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？蛋白质得分离有什么意义？蛋白质得分离有什么意义？蛋白质得分离有什么意义？血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。大大简化了实验操作。3 3 3 3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？血红蛋白提取和分离的程序可分为四
35、大步，包括：血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、样品处理、粗分离、样品处理、粗分离、样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定纯化和纯度鉴定纯化和纯度鉴定纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到收集到血红蛋白溶液血红蛋白溶液，即，即:样品的处理；再经过透析去除分子量较小样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法通过凝胶色谱法通过凝胶色谱法通过凝胶色谱法将相对分子质量较大将相对分子质量较大的的杂质蛋白除去杂质蛋白除去，即，即:样品的纯化；最后
36、经样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳进行进行纯度鉴定。纯度鉴定。第25页，讲稿共32张，创作于星期三（三）（三）SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳2.2.2.2.试剂的配制：试剂的配制：试剂的配制：试剂的配制：鉴定血红蛋白纯度。鉴定血红蛋白纯度。1.1.1.1.目的：目的：目的：目的：丙烯酰胺和丙烯酰胺和丙烯酰胺和丙烯酰胺和N,N-N,N-N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺:用去离子水配制用去离子水配制29%29%（29 29 g/100 mLg/100 mL，下同）的丙烯酰胺和，下同）
37、的丙烯酰胺和1%1%的的N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺的贮存液。甲叉双丙烯酰胺的贮存液。十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDSSDSSDS）:用去离子水配成用去离子水配成10%10%的贮存液，于室温保存。的贮存液，于室温保存。用于制备分离胶和浓缩胶的用于制备分离胶和浓缩胶的用于制备分离胶和浓缩胶的用于制备分离胶和浓缩胶的TrisTrisTrisTris缓冲液。缓冲液。缓冲液。缓冲液。TEMED TEMED TEMED TEMED：作用通过催化作用通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。
38、用去离子水用去离子水用去离子水用去离子水配制配制配制配制10%10%10%10%过硫酸铵：过硫酸铵：过硫酸铵：过硫酸铵：作用是提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合作用是提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。TrisTrisTrisTris甘氨酸电泳缓甘氨酸电泳缓甘氨酸电泳缓甘氨酸电泳缓冲液：冲液：冲液：冲液：25 mmol/L Tris25 mmol/L Tris，250 mmol/L 250 mmol/L 甘氨酸甘氨酸 (pH 8.3)(pH 8.3)，0.1%0.1%的的SDSSDS。样品处理液：样品处理液：样品处理液：样品处理
39、液：50 mmol/L TrisHCl(pH 6.8)50 mmol/L TrisHCl(pH 6.8)，100 mmol/L DTT100 mmol/L DTT(巯基苏糖醇巯基苏糖醇)或用或用5%5%的巯基乙醇，的巯基乙醇，2%2%的的SDSSDS，0.1%0.1%的溴酚蓝，的溴酚蓝，10%10%的甘的甘油。油。染色液：染色液：染色液：染色液：0.1%0.1%的考马斯亮蓝的考马斯亮蓝R250R250，40%40%的甲醇，的甲醇，10%10%的冰醋的冰醋酸。酸。脱色液：脱色液：脱色液：脱色液：10%10%的甲醇和的甲醇和10%10%的冰醋酸。的冰醋酸。第26页，讲稿共32张，创作于星期三 1
40、1、由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具、由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。操作必须在通风橱内或通风处进行。2 2、TEMEDTEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。3 3、在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤完、在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套。成。操作时要戴好一次性手套。注意事项：注意事项：（三）（三）SDSSDS聚丙烯酰
41、胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳第27页，讲稿共32张，创作于星期三 SDS-SDS-SDS-SDS-聚丙烯酰胺分离胶制备：聚丙烯酰胺分离胶制备：聚丙烯酰胺分离胶制备：聚丙烯酰胺分离胶制备：用去离子水用去离子水用去离子水用去离子水4.6 mL4.6 mL4.6 mL4.6 mL，30%30%30%30%的丙烯酰胺的丙烯酰胺的丙烯酰胺的丙烯酰胺2.7 mL2.7 mL2.7 mL2.7 mL，1.5mol1.5mol1.5mol1.5mol、pH 8.8pH 8.8pH 8.8pH 8.8的的的的TrisTrisTrisTris缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液2.5 mL2.5 mL2.5 mL2.5 mL
42、，10%10%10%10%的的的的SDS 0.1 mLSDS 0.1 mLSDS 0.1 mLSDS 0.1 mL，10%10%10%10%的过硫酸胺的过硫酸胺的过硫酸胺的过硫酸胺0.1 mL0.1 mL0.1 mL0.1 mL，TEMED 0.006mLTEMED 0.006mLTEMED 0.006mLTEMED 0.006mL，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间(
43、梳子的齿长再加梳子的齿长再加梳子的齿长再加梳子的齿长再加0.5 cm)0.5 cm)0.5 cm)0.5 cm)，再在，再在，再在，再在胶液面上小心注入一层水（约高胶液面上小心注入一层水（约高胶液面上小心注入一层水（约高胶液面上小心注入一层水（约高23 mm23 mm23 mm23 mm），以阻止氧气进入凝胶溶液。），以阻止氧气进入凝胶溶液。），以阻止氧气进入凝胶溶液。），以阻止氧气进入凝胶溶液。分离胶聚合完全后（约分离胶聚合完全后（约分离胶聚合完全后（约分离胶聚合完全后（约30 min30 min30 min30 min），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残），倾出
44、覆盖水层，再用滤纸吸净残），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。留水。留水。留水。配制配制配制配制SDSSDSSDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液用去离子水聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液用去离子水聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液用去离子水聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液用去离子水2.7 mL2.7 mL2.7 mL2.7 mL，30%30%30%30%的丙烯酰胺的丙烯酰胺的丙烯酰胺的丙烯酰胺0.67 mL0.67 mL0.67 mL0.67 mL，1.0 mol1.0 mol1.0 mol1.0 mol、pH 6.8pH 6.8pH 6.8pH 6.8的的的的TrisTrisTrisTris缓冲液缓冲
45、液缓冲液缓冲液0.5 mL0.5 mL0.5 mL0.5 mL，10%10%10%10%的的的的SDS0.041 mLSDS0.041 mLSDS0.041 mLSDS0.041 mL，10%10%10%10%的过硫酸胺的过硫酸胺的过硫酸胺的过硫酸胺0.04 mL0.04 mL0.04 mL0.04 mL，TEMED 0.004 mLTEMED 0.004 mLTEMED 0.004 mLTEMED 0.004 mL，混合均匀，直，混合均匀，直，混合均匀，直，混合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。接灌
46、注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。整个操整个操整个操整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。（1 1 1 1）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板）
47、根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板（2 2 2 2）SDSSDSSDSSDS聚丙烯酰胺凝胶制备：聚丙烯酰胺凝胶制备：聚丙烯酰胺凝胶制备：聚丙烯酰胺凝胶制备：3 3、电泳方法步骤、电泳方法步骤第28页，讲稿共32张，创作于星期三（3 3 3 3）样品处理：）样品处理：）样品处理：）样品处理：在电泳样品中按在电泳样品中按1111体积比加入样品处理液，在体积比加入样品处理液，在100 100 温温度下加热度下加热3 min3 min，以使蛋白质变性。，以使蛋白质变性。（4 4 4 4）浓缩胶聚合完全后（）浓缩胶聚合完全后（）浓缩胶聚合
48、完全后（）浓缩胶聚合完全后（30 min30 min30 min30 min），），），），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入TrisTrisTrisTris甘氨酸电泳缓冲甘氨酸电泳缓冲甘氨酸电泳缓冲甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。（5 5 5 5）加样：）加样：）加样：）加
49、样：按顺序加样，加按顺序加样，加样量通常为样量通常为1025 L1025 L。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后碎后(即进行凝胶色谱分离之前即进行凝胶色谱分离之前)的样品和凝胶色谱分离之后的样品的样品和凝胶色谱分离之后的样品（6 6 6 6）电泳：）电泳：）电泳：）电泳：将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8 V/cm8 V/cm。当染料前沿进入。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到分离胶后，把电压提高到15 V/cm15 V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方
50、约上方约1 cm1 cm处，关闭电源。处，关闭电源。（7 7 7 7）剥胶：）剥胶：）剥胶：）剥胶：从电泳装置上卸下玻璃板，用刮从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角，以刀撬开玻璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角，以标注凝胶的方位。标注凝胶的方位。（8 8 8 8）染色：）染色：）染色：）染色：将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染色染色1-2 h1-2 h。（9 9 9 9）脱色：）脱色：）脱色：）脱色：染色完毕，倾出染色液染色完毕，倾出染色液,换脱色液脱色换脱色液脱色3-10 h3-10 h，其间需