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1、关于色谱分析概论第1页，讲稿共62张，创作于星期三 色谱法是一种重要的分离分析方色谱法是一种重要的分离分析方法，它是根据组分在两相中作用能法，它是根据组分在两相中作用能力不同而达到分离目的。力不同而达到分离目的。第2页，讲稿共62张，创作于星期三1.1 色谱法发展简史茨维特的实验茨维特的实验茨维特（茨维特（M.S.Tswett)：俄国植物学家，主要从事植物色素的研究工作俄国植物学家，主要从事植物色素的研究工作 1903年年3月月21日：华沙自然科学会议生物学会议上宣读论日：华沙自然科学会议生物学会议上宣读论文：文：“On a new category of absorption phenome
2、na and their application to biochemical analysis”第3页，讲稿共62张，创作于星期三 “一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用”。在在1906 年发表的文章中，首次提出了色谱的年发表的文章中，首次提出了色谱的概念。概念。第4页，讲稿共62张，创作于星期三茨维特的实验-分离植物色素第5页，讲稿共62张，创作于星期三t s第6页，讲稿共62张，创作于星期三 v在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）称为内静止不动的一相（固体或液体）称为固定相固定相 ；v自
3、上而下运动的一相（一般是气体或自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为液体）称为流动相流动相 ；v装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为称为色谱柱色谱柱 。第7页，讲稿共62张，创作于星期三v色谱法是一种色谱法是一种分离分离方法。方法。它它的的特特点点是是：有有两两相相，一一是是固固定定相相，一一是是流流动动相相，两两相相作相向运动。作相向运动。v 将色谱法用于分析中，则称为色谱分析。将色谱法用于分析中，则称为色谱分析。色谱分析是一种分离、分析法。色谱分析是一种分离、分析法。第8页，讲稿共62张，创作于星期三 v1941年：英国人马丁与辛格首次突出液-液
4、色谱法（经典液相色谱发）；v1952年：英国人马丁与辛格建立气液色谱法（脂肪酸混合物的分离），发展了气相色谱；1956 Van Deemter提出速率理论；v1957年美国Golay首先应用小口径毛细管进行色谱分离；v1959年Porath和Flodin空间排阻色谱法（固定相：多孔凝胶)1967 Kirkland等研制高效液相色谱仪；v1970以后逐渐发展了高效液相色谱；第9页，讲稿共62张，创作于星期三 v1975年H.Small 研究组建立了离子色谱法；v1979年气相色谱应用的飞跃：弹性石英毛细管色谱柱的商品化；v20世纪50年代：毛细管电泳技术的建立和发展。其迅速发展在20世纪80年代
5、毛细管区带电泳的建立，之后发展了胶束电动色谱、毛细管凝胶色谱、毛细管电色谱（主要应用于：蛋白质分离、糖分析、DNA测试、手性分离、单细胞分析）v我国色谱研究工作起步于1954年，有中科院大连化物所进行早期的理论和技术研究（卢佩章、张玉奎）第10页，讲稿共62张，创作于星期三色谱分析法的重要贡献v诺贝尔化学奖：1948年，瑞典Tiselins，电泳和吸附分析；1952年，英国马丁(Martin)和辛格(Synge)，分配色谱。v应用的科学领域：化学、化工、轻工、石油、环保、医药、农业等几乎所有学科领域。为信息科学、生命科学、材料科学、环境科学等新兴学科的发展作出了重要贡献。第11页，讲稿共62张
6、，创作于星期三1.2 色谱法的分类色谱法的分类按流动相分按流动相分气相色谱（GC）液相色谱（LC）超临界流体色谱（SFC）按机理分按机理分吸附色谱分配色谱离子交换色谱排阻色谱第12页，讲稿共62张，创作于星期三按固定相在支持按固定相在支持 体中的形状分体中的形状分柱色谱平板色谱纸色谱薄层色谱按分离效率分按分离效率分经典液相色谱高效液相色谱第13页，讲稿共62张，创作于星期三毛细管电色谱法毛细管电色谱法（CEC）色色谱谱法法GSC液相色谱法液相色谱法 （LC）柱色谱法柱色谱法平面色谱法平面色谱法毛细管电泳法毛细管电泳法 （CE）LLCLSCSECIECBPC纸色谱法纸色谱法薄层色谱法薄层色谱法（
7、TLC）LLCLLCLSC气相色谱法气相色谱法（GC）柱色谱法柱色谱法GLC超临界流体色谱法超临界流体色谱法 （SFC）第14页，讲稿共62张，创作于星期三1.3 色谱法的特点与局限性v1.特点v1）选择性好v2）效率高、速度快v3）灵敏度高、样品用量少v4）应用范围广v2.局限性v1）定性能力相对弱；v2）定量时必须有标准品；v3）有些物质如异构体、固体物质的分析能力较差。第15页，讲稿共62张，创作于星期三1.4 色谱图和相关术语色谱过程实现色谱操作的基本条件是必须具备相对运动的两相，固定相(stationary phase)和流动相(mobile phase)。色谱过程是组分的分子在流动
8、相和固定相间多次“分配”的过程。第16页，讲稿共62张，创作于星期三v 第17页，讲稿共62张，创作于星期三 v v1.色谱图（色谱流出曲线）是由检测器输出的电信号强度对时间作图所绘制的曲线，又称为色谱流出曲线。第18页，讲稿共62张，创作于星期三 峰峰高基线峰宽半峰宽峰面积标准偏差第19页，讲稿共62张，创作于星期三2.2.基线基线 在实验操作条件下，在实验操作条件下，色谱柱后没有样色谱柱后没有样品组分流出时的流出曲线称为基线品组分流出时的流出曲线称为基线，稳，稳定的基线应该是一条水平直线。定的基线应该是一条水平直线。3.3.峰高峰高 色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，色谱峰顶点与基线之间的垂
9、直距离，以（以（h h）表示。表示。第20页，讲稿共62张，创作于星期三 v色谱流出曲线和色谱峰色谱流出曲线和色谱峰v基线（基线（a）v峰高（峰高（h）信信号号进样空气峰ha色谱流出曲线色谱流出曲线色谱峰色谱峰第21页，讲稿共62张，创作于星期三（四）保留值（四）保留值 1.1.死时间死时间t tM M 不不被被固固定定相相吸吸附附或或溶溶解解的的物物质质进进入入色色谱谱柱柱时时，从从进进样样到到出出现现峰峰极极大大值值所所需需的的时时间间称称为为死死时时间间，它它正正比比于于色色谱谱柱柱的的空空隙体积，如下图隙体积，如下图。信号进样tM第22页，讲稿共62张，创作于星期三 因为这种物质不被固
10、定相吸附或溶解，故因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相流动速度相近。其流动速度将与流动相流动速度相近。测定测定流动相平均线速流动相平均线速 时，可用柱长时，可用柱长L L与与t tM M的比值的比值计算，即计算，即 =L/tM第23页，讲稿共62张，创作于星期三2.保留时间保留时间tR 试样从进样到柱后出现峰极大点时所试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过的时间，称为保留时间，如下图。经过的时间，称为保留时间，如下图。信信号号进样进样tR第24页，讲稿共62张，创作于星期三3.3.调整保留时间调整保留时间t tR R 某组分的保留时间扣除死时间后，称某组分的保留时间扣除死时间
11、后，称为该组分的为该组分的调整保留时间调整保留时间，即即 tR=tR tM 由由于于组组分分在在色色谱谱柱柱中中的的保保留留时时间间t tR R包包含含了了组组分分随随流流动动相相通通过过柱柱子子所所需需的的时时间间和和组组分分在在固固定定相相中中滞滞留留所所须须的的时时间间，所所以以t tR R实实际际上是组分在固定相中保留的总时间。上是组分在固定相中保留的总时间。第25页，讲稿共62张，创作于星期三 保保留留时时间间是是色色谱谱法法定定性性的的基基本本依依据据，但但同同一一组组分分的的保保留留时时间间常常受受到到流流动动相相流流速速的的影影响响，因因此此色色谱谱工工作作者者有有时用保留体积
12、来表示保留值。时用保留体积来表示保留值。第26页，讲稿共62张，创作于星期三4.4.死体积死体积V V0 0 指色谱柱在填充后，柱管内固定相指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两项很小可忽略不计时，和。当后两项很小可忽略不计时，死体死体积可由死时间与色谱柱出口的载气流速积可由死时间与色谱柱出口的载气流速F Fcoco（cmcm3 3minmin-1-1）计算计算。第27页，讲稿共62张，创作于星期三 V0 =tMFco 式中式中 Fco为扣除饱和水蒸气压并经
13、为扣除饱和水蒸气压并经温度校正的流速。温度校正的流速。仅适用于气相色谱仅适用于气相色谱，不适用于液相色谱不适用于液相色谱。第28页，讲稿共62张，创作于星期三5.5.保留体积保留体积V VR R 指从进样开始到被测组分在指从进样开始到被测组分在柱后出柱后出现浓度极大点现浓度极大点时所通过的流动相的体积。时所通过的流动相的体积。保留时间与保留体积关系：保留时间与保留体积关系：VR=tR Fco 第29页，讲稿共62张，创作于星期三6.6.调整保留体积调整保留体积V VR R 某组分的保留体积扣除死体积后，称为某组分的保留体积扣除死体积后，称为该组分的调整保留体积。该组分的调整保留体积。VR =V
14、R V0 =tR Fco 第30页，讲稿共62张，创作于星期三7.7.相对保留值相对保留值r r2,12,1 某组分某组分2 2的调整保留值与组分的调整保留值与组分1 1的调整的调整保留值之比，称为相对保留值。保留值之比，称为相对保留值。r2,1=tR2 /tR1=VR2 /VR1 由于相对保留值只与柱温及固定相性质由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它在色谱法中，特别相流速无关，因此，它在色谱法中，特别是在气相色谱法中，广泛是在气相色谱法中，广泛用作定性的依据用作定性的依据。第31页，讲稿共62张，创作于
15、星期三 在定性分析中，通常固定一个色谱峰在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（作为标准（s s），），然后再求其它峰（然后再求其它峰（i i）对对这个峰的相对保留值，此时可用符号这个峰的相对保留值，此时可用符号 表表示，即示，即 =tR (i)/tR (s)式中式中t tR R (i)(i)为后出峰的调整保留时间，为后出峰的调整保留时间，所以所以 总是大于总是大于1 1的。相对保留值往往可作的。相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标，又称选择因为衡量固定相选择性的指标，又称选择因子。子。第32页，讲稿共62张，创作于星期三(五五)区域宽度区域宽度 色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重色谱
16、峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，用于衡量柱效率及反映色谱操要参数之一，用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。表示色谱峰区域宽度作条件的动力学因素。表示色谱峰区域宽度通常有通常有三种方法三种方法。第33页，讲稿共62张，创作于星期三1.1.标准偏差标准偏差-即即0.6070.607倍峰高处色谱峰宽倍峰高处色谱峰宽的一半。的一半。2.2.半半峰峰宽宽Y Y1/21/2-即即峰峰高高一一半半处处对对应应的的峰峰宽宽。它与标准偏差的关系为它与标准偏差的关系为 Y Y1/21/2=2.354=2.354 3.3.峰峰底底宽宽度度Y Y-即即色色谱谱峰峰两两侧侧拐拐点点上上的的切切线线在
17、在基基线线上上截截距距间间的的距距离离。它它与与标标准准偏偏差差 的关系是的关系是 Y=4 Y=4 第34页，讲稿共62张，创作于星期三第35页，讲稿共62张，创作于星期三从色谱流出曲线中，可得许多重要信息：从色谱流出曲线中，可得许多重要信息：(i)i)根根据据色色谱谱峰峰的的个个数数，可可以以判判断断样样品品中中所所含含 组分的最少个数；组分的最少个数；(ii)ii)根根据据色色谱谱峰峰的的保保留留值值，可可以以进进行行定定性性分分析；析；(iii)iii)根根据据色色谱谱峰峰的的面面积积或或峰峰高高，可可以以进进行行定定量分析；量分析；(iv)iv)色色谱谱峰峰的的保保留留值值及及其其区区
18、域域宽宽度度，是是评评价价色谱柱分离效能的依据；色谱柱分离效能的依据；(v)v)色色谱谱峰峰两两峰峰间间的的距距离离，是是评评价价固固定定相相（或或流动相）选择是否合适的依据。流动相）选择是否合适的依据。第36页，讲稿共62张，创作于星期三 色谱分析的色谱分析的目的目的是将样品中是将样品中各组分彼此分离各组分彼此分离，组分，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。程的热力学性质有关。但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很
19、宽，但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此，程的动力学性质有关。因此，要从热力学和动力学两方要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。面来研究色谱行为。第37页，讲稿共62张，创作于星期三n 关于保留值p死时间死时间(tM):):无保留组分出峰时间无保留组分出峰时间p保留时间保留时间(tR):):p调整保留时间调整保留时间(tR):):p死体积死体积(VM):):p保留体积保留体积(VR
20、):):p调整保留体积调整保留体积(VR):):第38页，讲稿共62张，创作于星期三1.5 色谱现代发展及相关联用技术v1.理论方面v 色谱理论的本质是研究色谱热力学、色谱动力学以及热力学与动力学有机结合来寻求色谱分离的最佳化途径。v 平衡理论、塔板理论、纵向扩散理论、速率理论；v 块状液膜模型、分子顶替模型、各种保留值预测理论，等等。第39页，讲稿共62张，创作于星期三2.新型固定相和检测器的研究v（1）固定相v 手性固定相手性化合物的分离分析v固定相载体的研究：粒径均匀、高强度的高分子多孔微球制备技术v一般仪器所用填料35m；v超高液相色谱仪中所用填料1.7 m；v整体柱技术（棒柱）：v
21、将填料单体、引发剂、制孔剂混合后通过原位聚合或固化在柱管中形成的多孔结构的棒状整体式柱体。目的：提高柱效和重现性，实现快速分离分析。第40页，讲稿共62张，创作于星期三 v（2）检测器v 紫外检测器；荧光检测器；电化学检测器；示差折光检测器等。v 蒸发光散射检测器可用于不吸收紫外光的物质（糖类等）的检测；适合于测挥发性低于流动相得物质。v v 半导体荧光检测器具有高灵敏度，检测限可优于紫外分光光度法2个数量级。第41页，讲稿共62张，创作于星期三2.技术方面v1）超临界流体色谱（SFC）v 超临界流体：物质处于临界温度和临界压力以上，既不是液体，又不是气体，是一种单一相态的流体。但它兼有气体的
22、低粘度、液体的高密度以及介于气、液之间较高的扩散系数等特性。第42页，讲稿共62张，创作于星期三 第43页，讲稿共62张，创作于星期三 v2）多维色谱v 多维技术有GC-GC、LC-GC、LC-LC等多种组合。v3）毛细管电动色谱（CEC）v 可以看成是高效液相色谱和毛细管区带电泳相结合的产物。第44页，讲稿共62张，创作于星期三 v生物芯片vGC-MSMS(或 LC-MS-MS)vLC-GC-MSv3.仪器方面v 全微机化控制和数据处理的多功能色谱仪器已成为主流产品。v4.色谱专家系统第45页，讲稿共62张，创作于星期三v高效液相色谱第46页，讲稿共62张，创作于星期三气相色谱仪第47页，讲
23、稿共62张，创作于星期三 v1.6 中文工具书及国内外期刊v1.中文工具书v 分析化学手册，分析仪器手册v2.主要色谱期刊v色谱；分析化学第48页，讲稿共62张，创作于星期三 v Journal of Chromatography（荷兰）2.777（B）Journal of Chromatographic Science（美国）Chromatographia（德国）1.398 Journal of Liquid Chromatography&Related Techniques（美国）Journal of Separation Science第49页，讲稿共62张，创作于星期三 vBiomed
24、ical Chromatography（英国）1.639vAnalytical Chemistry （美国）5.2vElectrophoresis 3.7vJournal of Capillary Electrophoresisv Journal of Pharmaceutical&Biomedical Analysis 2.453v 等等第50页，讲稿共62张，创作于星期三 3.在互联网上查阅色谱文献第51页，讲稿共62张，创作于星期三第52页，讲稿共62张，创作于星期三第53页，讲稿共62张，创作于星期三第54页，讲稿共62张，创作于星期三v色谱法分离理论v(一)基本术语(二)塔板理论(三
25、)速率理论(四)分离度第55页，讲稿共62张，创作于星期三色谱相关术语v关于色谱峰关于色谱峰v关于保留值关于保留值v关于分配平衡关于分配平衡第56页，讲稿共62张，创作于星期三n 关于色谱峰峰峰高基线峰宽半峰宽峰面积标准偏差第57页，讲稿共62张，创作于星期三n 关于保留值p死时间死时间(tM):):无保留组分出峰时间无保留组分出峰时间p保留时间保留时间(tR):):p调整保留时间调整保留时间(tR):):p死体积死体积(VM):):p保留体积保留体积(VR):):p调整保留体积调整保留体积(VR):):第58页，讲稿共62张，创作于星期三v相对保留值相对保留值(ri,s):v保保留留指指数数
26、(I)：又又叫叫Kovats，它它规规定定正正构构烷烷烃烃的的保保留留指指数数是是其其碳碳数数的的100倍倍，其其它它物物质质的的保保留留指指数数在在实实际际色色谱谱条条件件下下测测定定。选选取取与与被被测测物物相相邻邻的的两两种种正正构构烷烷烃烃做做参参照照系系，其其中中一一种种碳碳数数为为Z，另另一一种种为为Z+1，被被测测物物的的保留指数由下式计算保留指数由下式计算：第59页，讲稿共62张，创作于星期三n 关于分配平衡p分配系数分配系数K(distribution coefficient)p分配比分配比k又称为容量因子、容量比、分配容量，是指在一定温度又称为容量因子、容量比、分配容量，是指在一定温度和压力下，平衡状态时组分在固定相中的量与在流动相中的量之和压力下，平衡状态时组分在固定相中的量与在流动相中的量之比值。比值。是衡量柱子对组分保留能力的重要参数是衡量柱子对组分保留能力的重要参数。第60页，讲稿共62张，创作于星期三p相比相比 色谱柱内固定相和流动相体积之比色谱柱内固定相和流动相体积之比 是柱型及结构的重要特征。是柱型及结构的重要特征。第61页，讲稿共62张，创作于星期三感感谢谢大大家家观观看看第62页，讲稿共62张，创作于星期三