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1、关于蛋白质分离纯化和表征第1页，讲稿共74张，创作于星期三蛋白质可解离基团可以用滴定法滴定注意：注意：1 1、某些天然蛋白质中有一部分可解离基团由于埋在分、某些天然蛋白质中有一部分可解离基团由于埋在分 子内部或参与氢键形成而不能被滴定。子内部或参与氢键形成而不能被滴定。2 2、如果蛋白质变性后可解离基团全部可被滴定。、如果蛋白质变性后可解离基团全部可被滴定。第2页，讲稿共74张，创作于星期三什么叫等电点？对某一种蛋白质来说，在某一pH值，它所带的正电荷与负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这一pH值称为蛋白质的等电点。第3页，讲稿共74张，创作于星期三 蛋白质的蛋白质的等电点等电点和它所含的和它所
2、含的酸性氨基酸酸性氨基酸和和碱性氨基碱性氨基酸酸的数量比例有关的数量比例有关。第4页，讲稿共74张，创作于星期三 二、蛋白质的大小与形状二、蛋白质的大小与形状(蛋白质分子量测定蛋白质分子量测定)(一一)根据化学组成测定分子量：根据化学组成测定分子量：用用化化学学分分析析方方法法测测出出蛋蛋白白质质中中某某一一微微量量元元素素的的含含量量，并并假假设设蛋蛋白白质质分分子子中中只只含含有有一一个个被被测测的的元元素素原原子子，则则可可以以由由此此计计算算出出蛋蛋白白质质的最低分子量。的最低分子量。例如例如:肌红蛋白含铁肌红蛋白含铁0.335%0.335%，其最低分子量可按下式算出，其最低分子量可按
3、下式算出：最低分子量最低分子量 =铁的原子数铁的原子数 55.8 55.8 铁的百分含量铁的百分含量 X 100=0.335 X 100=16700X 100=0.335 X 100=16700 有有时时蛋蛋白白质质分分子子中中某某一一氨氨基基酸酸的的含含量量特特别别少少，也也可可以以用用这这一一氨氨基基酸酸含量的分析结果，计算蛋白质的最低分子量。含量的分析结果，计算蛋白质的最低分子量。第5页，讲稿共74张，创作于星期三(二二)利用渗透压测定分子量：利用渗透压测定分子量：当用一种半透膜将蛋白质当用一种半透膜将蛋白质溶液与纯水隔开时，只有水分溶液与纯水隔开时，只有水分子能自由地通过半透膜进入蛋子
4、能自由地通过半透膜进入蛋白质溶液白质溶液,而蛋白质分子却不能而蛋白质分子却不能透过它进入纯水中。透过它进入纯水中。这种溶剂这种溶剂分子向溶液单方向的扩散现象分子向溶液单方向的扩散现象称为渗透。称为渗透。由于渗透的结果，由于渗透的结果，溶液内的体积增加，液面升高，溶液内的体积增加，液面升高，直至达到一定的静水压力时维直至达到一定的静水压力时维持平衡。这时的静水压力就是持平衡。这时的静水压力就是溶液在平衡浓度时的渗透压。溶液在平衡浓度时的渗透压。第6页，讲稿共74张，创作于星期三 利利用用渗渗透透压压的的测测定定来来计计算算蛋蛋白白质质分分子子量量时时，是是通通过过测测定定几几个个不同浓度的渗透压
5、，用范霍夫公式不同浓度的渗透压，用范霍夫公式(略略)求出蛋白质分子量。求出蛋白质分子量。渗透压法测定蛋白质分子量的优缺点渗透压法测定蛋白质分子量的优缺点 优点：优点：所用的实验装置简单。所用的实验装置简单。缺点：缺点：要求被测蛋白质纯度要高，如果蛋白质样品中含有其他杂质要求被测蛋白质纯度要高，如果蛋白质样品中含有其他杂质蛋白，那么由渗透压测得的结果实际上代表几种蛋白质的平均分蛋白，那么由渗透压测得的结果实际上代表几种蛋白质的平均分子量。子量。第7页，讲稿共74张，创作于星期三 (三三)蛋白质的扩散和扩散系数蛋白质的扩散和扩散系数 1 1、什么叫扩散？、什么叫扩散？如如小小心心地地把把纯纯水水放
6、放在在蛋蛋白白质质溶溶液液的的上上面面，则则蛋蛋白白质质分分子子将将从从下下面面的的高高浓浓度度区区向向上上面面的的低低浓浓度度区区迁迁移移，直直至至达达到到平平衡衡为为止止。由由于于浓浓度度差差引引起起的的这这种种溶溶质质分分子子的的迁迁移移称称为为扩扩散散。扩扩散散是是高浓度向低浓度方向进行的。高浓度向低浓度方向进行的。第8页，讲稿共74张，创作于星期三 2 2、扩散系数、扩散系数 它在数值上等于当浓度为一个单位时，在一秒钟它在数值上等于当浓度为一个单位时，在一秒钟内通过内通过1 1厘米厘米2 2面积而扩散的溶质量面积而扩散的溶质量 3 3、影响扩散系数的因素、影响扩散系数的因素 1)1)
7、与蛋白质的分子大小和形状有关，与蛋白质的分子大小和形状有关，扩散系数扩散系数随分子量的增加而降低。随分子量的增加而降低。2)2)与溶剂的粘度有关，与溶剂的粘度有关，扩散系数扩散系数随溶剂的粘度随溶剂的粘度增加而降低。增加而降低。扩扩散散系系数数一一般般不不单单独独用用来来决决定定分分子子量量，但但与与沉沉降系数结合可精确测量蛋白质分子量。降系数结合可精确测量蛋白质分子量。第9页，讲稿共74张，创作于星期三(四四)沉降分析法测定分子量沉降分析法测定分子量(超速离心超速离心机的使用机的使用)在在强强大大的的离离心心力力作作用用时时，蛋蛋白白质质分分子子就就会会沉沉降降。沉沉降降的速度的速度：1)1
8、)与蛋白与蛋白质质的分子大小和密度有关的分子大小和密度有关；2)2)也与也与蛋白质蛋白质分子形状、溶液的密度分子形状、溶液的密度 和粘度有关。和粘度有关。超速离心法的二个用途超速离心法的二个用途 1 1、测测定蛋白定蛋白质质的分子量的分子量；2 2、分离纯化蛋白质。、分离纯化蛋白质。第10页，讲稿共74张，创作于星期三超速离心基本原理超速离心基本原理 1 1、离心力、离心力(Fc)(Fc)离心作用是根据在一定角度速度下作圆周运动的任何物体都受到一个向外的离心力进行的。离心力的大小等于离心加速度2X与颗粒质量m的乘积，即：FCm2X 其中是旋转角速度，以弧度秒为单位；X是颗粒离开旋转中心的距离，
9、以cm为单位：m是质量，以克为单位。第11页，讲稿共74张，创作于星期三 2 2、相对离心力、相对离心力(RCF)(RCF)由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力随之变化，因此常用“相对离心力”或“数字g”表示离心力，只要RCF值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。相对离心力（RCFRCF）和每分钟的转数（rpm）之间相互转换的计算方法。RCF=1.119*10RCF=1.119*10-5-5*r*(rpm*r*(rpm）2 2 式中r为离心转子的半径距离，rpm为转子每分钟的转数。第12页，讲稿共74张，创作于星期三第13页，讲稿共74张，创作于星期三
10、离心分离方法离心分离方法1 1、差速离心法：、差速离心法：(分级超速离心法分级超速离心法)不同的粒子在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。2、速率区速率区带带离心法离心法：在离心前于离心管内先装入密度梯度介质(如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等)，待分离的样品铺在梯度液的顶部、离心管底部或梯度层中间，同梯度液一起离心。3 3、等密度离心法等密度离心法：(密度密度梯度离心法梯度离心法)是在离心前预先配制介质的密度梯度，待分离的样品铺在梯度液顶上或和梯度液先混合，离心开始后，当梯度液由于离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度，
11、与此同时原来分布均匀的粒子也发生重新分布。常用的梯度液是CsCl。第14页，讲稿共74张，创作于星期三分析性超速离心结构及用途分析性超速离心结构及用途 用途：用途：1测定生物大分子的相对分子量测定生物大分子的相对分子量 2、生物大分子的纯度估计生物大分子的纯度估计 3 3、分析生物大分子中的构象变化、分析生物大分子中的构象变化 第15页，讲稿共74张，创作于星期三超速离心机工作原理第16页，讲稿共74张，创作于星期三密度梯度离心法超速离心操作方法第17页，讲稿共74张，创作于星期三不同的离心转子第18页，讲稿共74张，创作于星期三(五五)凝胶过滤法测定分子量凝胶过滤法测定分子量(凝胶层析、分子
12、排阻层析、分子筛层析、凝胶渗透层析凝胶层析、分子排阻层析、分子筛层析、凝胶渗透层析)原原 理理 分子形状为线形的或与凝胶能发生吸附作用的蛋白质，分子形状为线形的或与凝胶能发生吸附作用的蛋白质，则不能用此方法测定分子量。则不能用此方法测定分子量。第19页，讲稿共74张，创作于星期三凝胶过滤的介质（填料）凝胶过滤的介质（填料）1 1、葡聚糖凝胶：、葡聚糖凝胶：(Sephadex)(Sephadex)Pharmacia公司公司(瑞典瑞典)Sephadex G-25 G-75 G-100 1000-5000 300080000 4000150000 2 2、聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酰胺凝胶:(Bio-g
13、el):(Bio-gel)Bio-Rad公司公司(美国美国)Bio-gel P-4 P-10 P-150 500-4000 5000-17000 50000-150000 3 3、琼脂糖、琼脂糖凝胶：凝胶：(Sepharose)(Sepharose)pharmacia公司公司(瑞典瑞典)Sepharose 2B 4B 6B 7-4000万 6-2000万 1-400万 凝胶珠是多孔的网状结构，凝胶的交联度或孔度决定了凝胶的分级范围。第20页，讲稿共74张，创作于星期三举 例 实验中只要测得几种标准蛋白质的Ve，并以它们的分子量对数(logM)对Ve作图得一直线，用待测样品的Ve即可从图中确定它
14、的分子量。第21页，讲稿共74张，创作于星期三(六六)SDS)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶板状电泳板状电泳第22页，讲稿共74张，创作于星期三聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶盘状盘状电泳电泳第23页，讲稿共74张，创作于星期三SDSSDS应用原理应用原理 蛋蛋白白质质颗颗粒粒在在PAGEPAGE电电泳泳时时，它它的的迁迁移移率率取取决决于于它它所所带带的的净净电电荷荷以以及及分分子子大大小小和和形形状状等等因因素素。如如果果在在聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶系系统统中中加加入入SDSSDS和和少少量量的的巯巯基基乙乙醇醇，则则蛋蛋白白质质分分子子的的电
15、电泳泳迁迁移移率率主主要要取取决决于于它的分子量，而与原来所带的电荷和分子形状无关。它的分子量，而与原来所带的电荷和分子形状无关。第一，由于第一，由于SDS是阴离子，使多肽链复盖上负电荷，该电荷量是阴离子，使多肽链复盖上负电荷，该电荷量远超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原远超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，结果，所有的有的电荷差别，结果，所有的SDS-蛋白质复合物电泳时都以同样蛋白质复合物电泳时都以同样的电荷蛋白质比向正极移动。的电荷蛋白质比向正极移动。第二，改变了蛋白质单体分子的构象，第二，改变了蛋白质单体分子的构象，SDS-蛋白质复
16、合物在水蛋白质复合物在水溶液中的形状被认为是近似雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质溶液中的形状被认为是近似雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的的SDS复合物的直径都是一样的约为复合物的直径都是一样的约为1.8nm，而长轴长度则随蛋，而长轴长度则随蛋白质的分子量而成正比例地变化。白质的分子量而成正比例地变化。第24页，讲稿共74张，创作于星期三举举 例例载脂蛋白载脂蛋白A-IV的分离纯化的分离纯化第25页，讲稿共74张，创作于星期三 分分 子子 量量 计计 算算第26页，讲稿共74张，创作于星期三第27页，讲稿共74张，创作于星期三用聚丙烯酰胺凝胶法分离纯化蛋白质用聚丙烯酰胺凝胶法分离纯化蛋白质第28页
17、，讲稿共74张，创作于星期三(七七)蛋白质分子的形状分析蛋白质分子的形状分析 1 1、X-X-射线晶体结构分析：射线晶体结构分析：此法测定蛋白质分子的形形状状或构构象象最精确，但只能给出晶晶体体状状态态的蛋白质立体结构信息。而不能给出在溶液中溶液中的蛋白质形状或构象。2 2、摩擦比分析蛋白质形状：、摩擦比分析蛋白质形状：蛋白质分子在溶液中溶液中的摩擦系数可通过实验测得，通过摩擦系数计算摩擦比。摩擦比越大，反映蛋白质分子的不对称性越高，可衡量蛋白质分子形状偏离真正球体的程度。第29页，讲稿共74张，创作于星期三三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀(一一)蛋白质的胶
18、体性质蛋白质的胶体性质 三种溶液的区分：三种溶液的区分：(以分散相质点的直径来衡量以分散相质点的直径来衡量)1 1、真溶液：分散相质点小于、真溶液：分散相质点小于1nm1nm。2 2、悬浊液：分散相质点大于、悬浊液：分散相质点大于100nm100nm。3 3、胶体溶液：分散相质点介于、胶体溶液：分散相质点介于1-100nm1-100nm。蛋白质溶液属于蛋白质溶液属于胶体系统胶体系统。第30页，讲稿共74张，创作于星期三蛋白质在胶体系统中保持稳定所具备的三个条件1、分散相的质点大小1-100nm，这样大小的质点在动力学上是稳定的，介质分子对这种质点碰撞的合力不等于零，使它能在介质中作不断的布朗运
19、动；2、分散相的质点带有同种电荷，互相排斥，不易聚集成大颗粒而沉淀；3、分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层，例如与水形成水化层，质点有了水化层，相互间不易靠拢而聚集。第31页，讲稿共74张，创作于星期三(二二)、蛋白质的沉淀、蛋白质的沉淀 蛋蛋白白质质在在溶溶液液中中的的稳稳定定性性是是有有条条件件的的、相相对对的的。如如果果条条件件发发生生改改变变，破破坏坏了了蛋蛋白白质质溶溶液液的的稳稳定定性性，蛋蛋白白质质就就会会从从溶溶液液中中沉沉淀淀出出来。来。引起蛋白质沉淀的原因引起蛋白质沉淀的原因 1 1、加入脱水剂以除去它的水化层。、加入脱水剂以除去它的水化层。2 2、改变溶液的、改变溶液的pH
20、pH达到蛋白质的等电点使质点失去携带达到蛋白质的等电点使质点失去携带 相同净电荷。相同净电荷。3 3、加入电解质破坏双电层，蛋白质分子就会凝集成大、加入电解质破坏双电层，蛋白质分子就会凝集成大 的质点而沉淀。的质点而沉淀。第32页，讲稿共74张，创作于星期三 沉淀蛋白质的几种方法1 1、盐析法：、盐析法：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐(硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等)，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。盐析沉淀一般不引起蛋白质变性。2 2、有机溶剂沉淀法：、有机溶剂沉淀法：向蛋白质溶液中加入一定量的极性有机溶剂(甲醇，乙醇或丙酮等)，因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使
21、蛋白质颗粒容易凝集而沉淀。3 3、重金属盐沉淀法：、重金属盐沉淀法：当溶液pH大于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，容易与重金属离子(Hg2+、Pb2+、Cu2+，Ag+等)结成不溶性盐而沉淀。第33页，讲稿共74张，创作于星期三4 4、生物碱试剂和某些酸类沉淀法、生物碱试剂和某些酸类沉淀法：生生物物碱碱试试剂剂是是指指能能引引起起生生物物碱碱沉沉淀淀的的一一类类试试剂剂，如如鞣鞣酸酸(单宁酸单宁酸)，苦味酸，苦味酸(2(2，4 4，66三硝基酚三硝基酚)，钨酸和碘化钾等。，钨酸和碘化钾等。某某些些酸酸类类指指的的是是三三氯氯醋醋酸酸，磺磺基基水水扬扬酸酸和和硝硝酸酸等等。当当溶溶液液pHpH小小
22、于于等等电电点点时时，蛋蛋白白质质颗颗粒粒带带正正电电荷荷，容容易易与与生生物物碱碱试试剂剂和和酸类的酸根负离子发生反应生成不溶性盐而沉淀。酸类的酸根负离子发生反应生成不溶性盐而沉淀。5 5、加热变性沉淀法：、加热变性沉淀法：几几乎乎所所有有的的蛋蛋白白质质都都因因加加热热变变性性而而凝凝固固。少少量量盐盐类类能能促促进进蛋蛋白白质质加加热热凝凝固固。当当蛋蛋白白质质处处于于等等电电点点时时，加加热热凝凝固固最最完完全全和和最最迅迅速速。加加热热变变性性可可能能是是由由于于热热变变性性使使蛋蛋白白质质天天然然结结构构解解体体，疏疏水水基基外外露露，因因而而破破坏了水化层而致。坏了水化层而致。第
23、34页，讲稿共74张，创作于星期三四、蛋白质分离提纯的一般原则四、蛋白质分离提纯的一般原则 蛋白质提纯的总目标蛋白质提纯的总目标1 1、增加纯度或比活性、增加纯度或比活性(生物活性生物活性)。2 2、设法除去变性的和不要的蛋白质。、设法除去变性的和不要的蛋白质。3 3、希望所得蛋白质的产量达到最高值、希望所得蛋白质的产量达到最高值(得率得率)。第35页，讲稿共74张，创作于星期三分离纯化蛋白质的一般程序可分三步分离纯化蛋白质的一般程序可分三步1 1、前处理：、前处理：破破碎碎组组织织和和细细胞胞，提提取取组组织织或或细细胞胞内内的的蛋蛋白白质质，并并保保持持天然状态，不丢失生物活性。天然状态，
24、不丢失生物活性。破破 碎碎 组组 织织 和和 细细 胞胞动物组织和细胞：动物组织和细胞：用电动捣碎机、匀浆器或超声波破碎；用电动捣碎机、匀浆器或超声波破碎；植物组织和细胞植物组织和细胞：由于细胞壁由纤维素、半纤维素和果胶等：由于细胞壁由纤维素、半纤维素和果胶等 组成，用石英砂和适当的提取液一起研磨组成，用石英砂和适当的提取液一起研磨 的方法破碎或用纤维素酶处理；的方法破碎或用纤维素酶处理；细菌细胞的破碎：细菌细胞的破碎：细菌细胞壁由共价键连接而成的称为肽聚细菌细胞壁由共价键连接而成的称为肽聚 糖的囊状分子组成，非常坚韧。常用超声糖的囊状分子组成，非常坚韧。常用超声 波振荡、与砂研磨、高压挤压或
25、溶菌酶处波振荡、与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处 理等。理等。第36页，讲稿共74张，创作于星期三提取组织或细胞内的蛋白质提取组织或细胞内的蛋白质1)1)如如果果所所要要的的蛋蛋白白质质主主要要集集中中在在某某一一细细胞胞组组分分，如如细细胞胞核核、染染色色体体、核核糖糖体体或或可可溶溶性性的的细细胞胞浆浆等等，可可用用差速离心方法将它们分开。差速离心方法将它们分开。2)2)如如果果所所要要蛋蛋白白质质是是与与细细胞胞膜膜或或膜膜质质细细胞胞器器结结合合的的，则则必必须须利利用用超超声声波波或或去去污污剂剂使使膜膜结结构构解解聚聚，然然后后用用适当的介质提取。适当的介质提取。第37页，讲稿共74张
26、，创作于星期三 2 2、粗分级：、粗分级：一一般般采采用用分分级级盐盐析析、等等电电点点沉沉淀淀和和有有机机溶溶剂剂分分级级分分离离等等方方法法。这这些些方方法法的的特特点点是是简简便便、处处理理量量大大，既既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质溶液。能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质溶液。3 3、细细分分级级：进进一一步步提提纯纯，一一般般使使用用层层析析法法(包包括括凝凝胶胶过过滤滤，离离子子交交换换层层析析，吸吸附附层层析析以以及及亲亲和和层层析析等等)。必必要要时时还还可可选选择择电电泳泳法法(包包括括区区带带电电泳泳、等等电电聚聚焦焦等等)作作为为最最后后的的提提纯纯步步骤骤。第38页，讲稿共
27、74张，创作于星期三结晶蛋白质的制备结晶蛋白质的制备 一一定定纯纯度度的的蛋蛋白白质质才才能能形形成成结结晶晶，结结晶晶过过程程也也能能使使蛋蛋白白质质纯纯度度进进一一步步提提高高，重重结结晶晶可可除除去去少少量量夹夹杂杂的的蛋白质。一般结晶状蛋白质具有天然活性。蛋白质。一般结晶状蛋白质具有天然活性。蛋蛋白白质质纯纯度度愈愈高高，溶溶液液愈愈浓浓就就愈愈容容易易结结晶晶。结结晶晶的的最最佳佳条条件件是是使使溶溶液液略略处处于于过过饱饱和和状状态态，要要得得到到适适度度的的过过饱饱和和溶溶液液，可可借借控控制制温温度度、加加盐盐盐盐析析，加加有有机机溶溶剂剂或或调调节节pH等方法来达到。接入晶种
28、常能加速结晶过程。等方法来达到。接入晶种常能加速结晶过程。第39页，讲稿共74张，创作于星期三五、蛋白质的分离纯化方法五、蛋白质的分离纯化方法 (一一)根据分子大小不同的分离方法根据分子大小不同的分离方法 1 1、透析和超过滤、透析和超过滤 透析和超过滤就是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐，单糖、水等分开。常用的半透膜是玻璃纸、火棉纸和其他合成材料。第40页，讲稿共74张，创作于星期三 透析透析：是将待提纯的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里放在缓冲液中进行，使透析袋内无机盐等小分子物质降低到最小值。第41页，讲稿共74张，创作于星期三超过滤超过滤：是利用压力或
29、离心力，强行使水和其他小溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上。第42页，讲稿共74张，创作于星期三2 2密度梯度密度梯度(区带区带)离心：离心：前述，此略。前述，此略。3 3凝胶过滤：凝胶过滤：前述，此略。前述，此略。第43页，讲稿共74张，创作于星期三(二二)利用溶解度差别进行分离利用溶解度差别进行分离 影响蛋白质溶解度的影响蛋白质溶解度的外界因素外界因素 1)1)溶液的溶液的pHpH，2)2)离子强度，离子强度，3)3)介电常数，介电常数，4)4)温度。温度。影响蛋白质溶解度的影响蛋白质溶解度的内在因素内在因素 在在同同一一条条件件下下，不不同同蛋蛋白白质质具具有有不不同同的的溶溶解解度度
30、，这这是是因因为溶解度取决于它们本身的分子结构，如：为溶解度取决于它们本身的分子结构，如：1)1)分子中亲水基团与疏水基团的比例，分子中亲水基团与疏水基团的比例，2)2)亲水基团与疏水基团在蛋白质分子表面的排列和由此亲水基团与疏水基团在蛋白质分子表面的排列和由此 而产生的偶极距等。而产生的偶极距等。第44页，讲稿共74张，创作于星期三影响蛋白质溶解度的外界因素影响蛋白质溶解度的外界因素 1 1、pHpH与蛋白溶解度与蛋白溶解度 蛋白质是两性电解质，带电基团的电荷数量因蛋白质是两性电解质，带电基团的电荷数量因pHpH不同而变化不同而变化 1)1)当蛋白质处于等电点当蛋白质处于等电点pH时，蛋白质
31、的净电荷为零，使相邻时，蛋白质的净电荷为零，使相邻 蛋白质分子之间没有静电斥力，趋于结聚而沉淀，因此当蛋白质分子之间没有静电斥力，趋于结聚而沉淀，因此当 蛋白质处于等电点蛋白质处于等电点pH时的溶解度最低。时的溶解度最低。2)2)在等电点以上或以下的在等电点以上或以下的pH时，蛋白质分子携带同种符号时，蛋白质分子携带同种符号 (或正或负或正或负)的净电荷而互相排斥，阻止了单个分子结聚成的净电荷而互相排斥，阻止了单个分子结聚成 沉淀物，因此溶解度较大。沉淀物，因此溶解度较大。第45页，讲稿共74张，创作于星期三2 2、蛋白质的盐溶和盐析：、蛋白质的盐溶和盐析：盐溶：盐溶：低浓度中性盐可以低浓度中
32、性盐可以增加蛋白质的溶解度，增加蛋白质的溶解度，这种现象称为这种现象称为盐溶盐溶。盐析：盐析：高浓度高浓度中性盐中性盐则使则使蛋蛋白白质质沉淀出来，沉淀出来，这这种种现现象称象称为为盐盐析析。第46页，讲稿共74张，创作于星期三盐溶和盐析盐溶和盐析原理1)1)盐溶原理：盐溶原理：盐盐溶溶是是由由于于蛋蛋白白质质分分子子吸吸附附某某种种盐盐类类离离子子后后，带带电电表表层层使使蛋蛋白白质质分分子子彼彼此此排排斥斥，而而蛋蛋白白质质分分子子与与水水分分子子间间的的相相互互作作用用却却加加强，因而溶解度提高。强，因而溶解度提高。2)2)盐盐析析原理：原理：盐盐析析是是由由于于大大量量中中性性盐盐的的
33、加加入入，使使水水的的活活度度降降低低，原原来来溶溶液液中中的的大大部部分分自自由由水水转转变变为为盐盐离离子子的的水水化化水水，从从而而降降低低蛋蛋白白质质极极性性基基团团与与水水分分子子间间的的相相互互作作用用，破破坏坏蛋蛋白白质质分分子子表表面面的的水水化化层层。第47页，讲稿共74张，创作于星期三盐析法分离、纯化并结晶牛胰脏中酶蛋白举例盐析法分离、纯化并结晶牛胰脏中酶蛋白举例第48页，讲稿共74张，创作于星期三 3 3有机溶剂分级法：有机溶剂分级法：与与水水互互溶溶的的有有机机溶溶剂剂(如如甲甲醇醇、乙乙醇醇和和丙丙酮酮等等)能能使使蛋蛋白白质质在在水水中中的的溶溶解解度度显显著著降降
34、低低，引引起起蛋蛋白白质质沉沉淀淀和和变变性性。为为了了减减少少蛋蛋白白质质变变性性，可可预预先先将将有有机机溶溶剂剂冷冷却却到到-4040至至-60-60，然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂。，然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂。蛋蛋白白质质在在有有机机溶溶剂剂中中的的溶溶解解度度随随温温度度、pHpH和和离离子子强强度度而而变变化化。在在一一定定温温度度，pHpH和和离离子子强强度度条条件件下下，控控制制有有机机溶剂浓度可以达到分离蛋白质目的。溶剂浓度可以达到分离蛋白质目的。第49页，讲稿共74张，创作于星期三原理：原理：1 1、有有机机溶溶剂剂改改变变介介质质的的介介电电常常数数。水水是是高
35、高介介电电常常数数物物质质(20(20时时，80)80)，有有机机溶溶剂剂是是低低介介电电常常数数物物质质(20(20时时，甲甲醇醇3333，乙乙醇醇2424，丙丙酮酮21.4)21.4)，有有机机溶溶剂剂的的加加入入使使水水溶溶液液的的介介电电常常数数降降低低。从从而而增增加加两两个个相相反反电电荷荷之之间间的的吸吸引引力力。使使蛋蛋白白质质分分子子表表面面可可解解离离基基团团的的离离子子化化程程度度减减弱弱，水水化化程程度度降降低低，因因此此促促进进了了蛋蛋白白质质分分子子的的聚聚集集和和沉沉淀。淀。2 2、有有机机溶溶剂剂引引起起蛋蛋白白质质沉沉淀淀可可能能与与盐盐析析相相似似，与与蛋蛋
36、白白质质争争夺水化水，致使蛋白质聚集产生沉淀。夺水化水，致使蛋白质聚集产生沉淀。第50页，讲稿共74张，创作于星期三举举 例例 调节酒精浓度和调节酒精浓度和PHPH值对值对血浆蛋白质血浆蛋白质的分级分离的分级分离 第51页，讲稿共74张，创作于星期三4 4温度对蛋白质溶解度的影响：温度对蛋白质溶解度的影响：1)1)在在0-400-40范范围围内内，大大部部分分球球状状蛋蛋白白质质的的溶溶解解度度随随温度升高而增加。温度升高而增加。2)2)在在40-5040-50以以上上，大大部部分分蛋蛋白白质质变变得得不不稳稳定定并并开开始始变性，一般在中性变性，一般在中性pHpH介质中即失去溶解力。介质中即
37、失去溶解力。3)3)多多数数蛋蛋白白质质在在低低温温下下比比较较稳稳定定，因因此此蛋蛋白白质质的的分分级级分分离操作一般都在离操作一般都在00或更低的温度下进行。或更低的温度下进行。第52页，讲稿共74张，创作于星期三(三三)根据电荷不同的分离方法根据电荷不同的分离方法 根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分离纯化蛋白质的方法有电泳电泳和离子交换层析离子交换层析两类。第53页，讲稿共74张，创作于星期三1、电泳：、电泳：定义：定义：在在电电场场作作用用下下，不不处处于于等等电电状状态态的的蛋蛋白白质质分分子子向向着着与与其其电性相反的电极移动，这种现象称电泳。电性相反的电极移动，这种现象称电泳。
38、用途：用途：电电泳泳技技术术可可用用于于氨氨基基酸酸、肽肽，蛋蛋白白质质、核核苷苷酸酸和和核核酸酸等等生物分子的分离和制备。生物分子的分离和制备。影响因素影响因素 带带电电颗颗粒粒在在电电场场中中的的泳泳动动速速度度主主要要决决定定于于它它所所带带的的净净电电荷荷量量以及以及颗粒的大小颗粒的大小和和形状形状。第54页，讲稿共74张，创作于星期三 区带电泳：区带电泳：是是由由于于在在支支持持物物上上电电泳泳时时各各组组分分因因迁迁移移速速度度不不同同分分布布成成区区带带而得名。而得名。按其支持介质的物理性状不同可以分成四类按其支持介质的物理性状不同可以分成四类 1)1)滤纸电泳和薄膜电泳：滤纸电
39、泳和薄膜电泳：醋酸纤维薄膜电泳和聚酰胺薄膜电泳等2)2)粉末电泳：粉末电泳：支持介质是淀粉，纤维素粉或硅胶粉等，粉 末与适当的溶剂调和，铺设成平板。3)3)细丝电泳：细丝电泳：如尼龙丝和其他人造丝电泳，这是一类微量电泳；4)4)凝胶电泳：凝胶电泳：常用的支持介质有聚丙烯酰胺和琼脂糖凝 胶，前者适于分离蛋白质和寡核苷酸，后者 适于分离核酸。第55页，讲稿共74张，创作于星期三 等电聚焦等电聚焦 等电聚焦时，蛋白质等电聚焦时，蛋白质混合物的分离是在含能形混合物的分离是在含能形成成pHpH梯度两性电解质梯度两性电解质(Ampholine)(Ampholine)的蔗糖介质中的蔗糖介质中进行的。在电场内
40、，每种进行的。在电场内，每种蛋白质成分将移向并蛋白质成分将移向并“聚聚焦焦”(停留停留)在等于其等电在等于其等电点的点的pHpH梯度处，形成一梯度处，形成一个很窄的区带个很窄的区带。第56页，讲稿共74张，创作于星期三 双向电泳双向电泳：蛋蛋白白质质、氨氨基基酸酸或或寡寡核核苷苷酸酸混混合合物物一一次次电电泳泳往往往往不不能能完完全全分分开开。在在这这种种情情况况下下可可将将第第一一次次电电泳泳分分开开的的斑斑点点通通过过支支持持介介质质间间的的接接触触吸吸印印转转移移到到第第二二个个支支持持介介质质上上，旋旋转转900，进行第二次电泳。这种方法被称为双向电泳，进行第二次电泳。这种方法被称为双
41、向电泳。蛋白质双向电泳第57页，讲稿共74张，创作于星期三Internal standard Shenyangxu TreatedFig.1 2-D protein map from gel 3(pH 3-10NL,24cm)第58页，讲稿共74张，创作于星期三 Internal standard Disease TreatedFig.2 Full image of liver mitochondria proteome第59页，讲稿共74张，创作于星期三Fig.3 3-D charts of spot1:Spot 8 2:Spot 16第60页，讲稿共74张，创作于星期三Tble 2 ble
42、 2 The identified protein spots by MALDI-TOF MS and mationSpot No.Protein nameProtein namePIPIMrMrcontrolcontroldiseasediseasetreatedtreateddisease disease/control/control treated treated/disease/disease 1 1肌氨酸脱氢酶肌氨酸脱氢酶(Sarcosine dehydrogenase)(Sarcosine dehydrogenase)6.156.151016791016797.787.780.4
43、30.4310.5010.500.310.319.819.810.160.161.351.35-1.06-1.062 2氨甲酰磷酸合成酶氨甲酰磷酸合成酶(Carbamo-(Carbamo-ylphosphate synthetase 1)ylphosphate synthetase 1)6.336.331644761644768.218.210.0.323210.6010.600.180.18111123230.360.361.291.291.061.064 4热热休克蛋白休克蛋白60(60 kDa heat shock 60(60 kDa heat shock proteinprotein）
44、5.915.9160917609175.585.580.0.383811.4311.430.260.2613.0413.040.330.332.052.051.141.145 5热热休克蛋白休克蛋白70(70 kDa heat shock 70(70 kDa heat shock proteinprotein）5.975.9773814738147.237.230.0.35359.989.980.240.249.789.780.350.351.381.38-1.02-1.026 6醛脱氢酶醛脱氢酶(Mitochondrial(Mitochondrial aldehyde dehydrogena
45、sealdehyde dehydrogenase）6.696.6955566555667.417.410.0.191910.4410.440.390.3911.811.80.430.431.411.411.131.138 8硫辛酰胺脱氢酶硫辛酰胺脱氢酶(2-oxoi(2-oxoi sovalerate dehydrogenase)sovalerate dehydrogenase)7.687.68501335013311.8411.840.850.857.467.460.480.489.109.100.360.36-1.37-1.371.221.229 9鸟氨酸氨基转移酶鸟氨酸氨基转移酶(Orn
46、i thine(Orni thine aminotransferaseaminotransferase）6.536.53483024830210.8510.850.480.487.487.480.560.566.816.810.400.40-1.31-1.31-1.09-1.091010脂酰辅酶脂酰辅酶A A脱氢酶脱氢酶(Acyl-CoA(Acyl-CoA dehydrogenase)dehydrogenase)8.478.47447374473711.7011.700.450.459.379.370.340.347.217.210.460.46-1.20-1.20-1.23-1.231212
47、亚硫酸氧化酶亚硫酸氧化酶(Sulfite oxidase(Sulfite oxidase）5.795.7954320543208.248.240.0.212111.2011.200.620.6212.3212.320.650.651.361.361.101.101515ATPATP合成酶合成酶(ATP synthase(ATP synthase）9.229.2258790587907.987.980.0.51519.579.570.150.1511.5811.580.240.241.201.201.211.211616NADHNADH脱氢酶脱氢酶(NADH dehydrogenase(NADH
48、 dehydrogenase）7.577.5720845208458.528.520.0.363610.7410.740.340.347.847.840.680.681.261.26-1.27-1.27第61页，讲稿共74张，创作于星期三5 5、离子交换柱层析、离子交换柱层析 方方 法法 阳离子交换树脂含酸性基团如阳离子交换树脂含酸性基团如-SOSO3 3H(H(强酸型强酸型)或或-COOH(-COOH(弱酸型弱酸型)可解可解离出离出H H+离子，当溶液中含有其他阳离子，当溶液中含有其他阳离子时，如在酸性环境中的氨基酸离子时，如在酸性环境中的氨基酸阳离子，它们可以和阳离子，它们可以和H H+发
49、生交换而发生交换而“结合结合”在树脂上。在树脂上。同样阴离子交换树脂含有碱性同样阴离子交换树脂含有碱性基团如基团如-N(CH-N(CH3 3)3 3OH(OH(强碱型强碱型)或或-NHNH3 3OH(OH(弱碱型弱碱型)可解离出可解离出OHOH，能和，能和溶液里的阴离子，如和碱性环境中溶液里的阴离子，如和碱性环境中的氨基酸阴离子发生交换而结合在的氨基酸阴离子发生交换而结合在树脂上。树脂上。原原 理理第62页，讲稿共74张，创作于星期三 1 1、离子交换纤维素、离子交换纤维素(Cellulose)(Cellulose)和葡聚糖和葡聚糖(Sephadex)(Sephadex)阳离子交换剂 第63页
50、，讲稿共74张，创作于星期三 阴离子交换剂第64页，讲稿共74张，创作于星期三2 2、洗脱方法：、洗脱方法：1)1)改变缓冲液改变缓冲液pHpH，使大分子的电荷减少，从吸附状态变 为解吸状态。2)2)增加缓冲液离子强度增加缓冲液离子强度，使离子的竞争力加大，将大分 子从纤维素上替换下来。3 3、洗脱方式：、洗脱方式：1)1)阶段洗脱阶段洗脱，即用几个具有不同洗脱能力的缓冲液分步 洗脱。2)2)梯度洗脱梯度洗脱，即在梯度洗脱中缓冲液的洗脱能力是逐渐 连续性地增加的。第65页，讲稿共74张，创作于星期三5 5、梯度洗脱的类型：、梯度洗脱的类型：通常采用的梯度形式有线形，凸形，凹形和复合形四种，使用