兽用疫苗保护剂与佐剂.ppt

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1、关于兽用疫苗保护剂和佐剂第一张，PPT共五十七页，创作于2022年6月冻干保护剂（稳定剂）冻干保护剂（稳定剂）保护剂：保护剂：保护剂：保护剂：又称稳定剂又称稳定剂又称稳定剂又称稳定剂（stabilizer），是指一类能防止生物活性，是指一类能防止生物活性，是指一类能防止生物活性，是指一类能防止生物活性物质在冷冻真空干燥时受到破坏的物质。（指对疫苗生产、物质在冷冻真空干燥时受到破坏的物质。（指对疫苗生产、物质在冷冻真空干燥时受到破坏的物质。（指对疫苗生产、物质在冷冻真空干燥时受到破坏的物质。（指对疫苗生产、血清制备等）血清制备等）血清制备等）血清制备等）保护剂用途保护剂用途保护剂用途保护剂用途（

2、不同用途加不同保护剂不同用途加不同保护剂不同用途加不同保护剂不同用途加不同保护剂,主要针对活的微生物或细胞主要针对活的微生物或细胞主要针对活的微生物或细胞主要针对活的微生物或细胞）菌种或毒种保存：常用甘油作保护剂菌种或毒种保存：常用甘油作保护剂菌种或毒种保存：常用甘油作保护剂菌种或毒种保存：常用甘油作保护剂 细胞株保存：常用细胞株保存：常用细胞株保存：常用细胞株保存：常用二甲基亚砜二甲基亚砜二甲基亚砜二甲基亚砜(DMSO)DMSO)DMSO:DMSO:二甲基亚砜，一种细胞的保护剂二甲基亚砜，一种细胞的保护剂二甲基亚砜，一种细胞的保护剂二甲基亚砜，一种细胞的保护剂 疫苗冷冻真空干燥制备时：加脱脂

3、乳（或二甲基亚疫苗冷冻真空干燥制备时：加脱脂乳（或二甲基亚疫苗冷冻真空干燥制备时：加脱脂乳（或二甲基亚疫苗冷冻真空干燥制备时：加脱脂乳（或二甲基亚砜）和蔗糖等（不同国家有不同配方）砜）和蔗糖等（不同国家有不同配方）砜）和蔗糖等（不同国家有不同配方）砜）和蔗糖等（不同国家有不同配方）干扰素类生物活性物质的保存：加葡聚糖干扰素类生物活性物质的保存：加葡聚糖干扰素类生物活性物质的保存：加葡聚糖干扰素类生物活性物质的保存：加葡聚糖第二张，PPT共五十七页，创作于2022年6月 保护剂（protector）的分类）的分类分类：分类：（根据其作用机理）根据其作用机理）渗透剂：如二甲基亚砜（渗透剂：如二甲基

4、亚砜（DMSO）、甘油和蔗糖等）、甘油和蔗糖等非渗透剂：如聚乙烯吡咯啶酮非渗透剂：如聚乙烯吡咯啶酮(PVP)和蛋白质等和蛋白质等（根据其分子量大小）（根据其分子量大小）高分子物质、低分子物质。高分子物质、低分子物质。（按其化学性质）（按其化学性质）复合物、糖类、盐类、醇类、酸类和聚合物复合物、糖类、盐类、醇类、酸类和聚合物 第三张，PPT共五十七页，创作于2022年6月复合物复合物脱脂乳、明胶、蛋白质、蛋白胨、糊精、血清、甲基纤维素等脱脂乳、明胶、蛋白质、蛋白胨、糊精、血清、甲基纤维素等糖类糖类蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖等蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖等盐类盐类乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠

5、、氯化钾、醋酸铵、硫代硫酸钠等乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠、氯化钾、醋酸铵、硫代硫酸钠等醇类醇类山梨醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇等山梨醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇等酸类酸类柠檬酸、酒石酸、氨基酸等柠檬酸、酒石酸、氨基酸等聚合物聚合物葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等等一些常用的冷冻干燥保护剂一些常用的冷冻干燥保护剂分类保护剂第四张，PPT共五十七页，创作于2022年6月疫苗冻干保护剂组成疫苗冻干保护剂组成1.营养液：营养液：可修复因冻干而受损的细胞，使冻干制品含有一定量水分；可修复因冻干而受损的细胞，使冻干制品含有一定量水分；可促进高分子物质形成骨架，

6、使冻干制品呈多孔的海绵状，可促进高分子物质形成骨架，使冻干制品呈多孔的海绵状，增加溶解度增加溶解度2.赋形剂：赋形剂：防止低分子物质的碳化和氧化，保护活性物质不受加热影响防止低分子物质的碳化和氧化，保护活性物质不受加热影响使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，增加溶解度使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，增加溶解度3.抗氧化剂：抗氧化剂：抑制冻干制品中的酶作用，增加生物活性物质在冻干后贮存抑制冻干制品中的酶作用，增加生物活性物质在冻干后贮存期间的稳定性，如维生素期间的稳定性，如维生素C、维生素、维生素E和硫代硫酸钠等。和硫代硫酸钠等。第五张，PPT共五十七页，创作于2022年6月 防止活性物

7、质失去结构水及阻止结构水形成结晶而导致生防止活性物质失去结构水及阻止结构水形成结晶而导致生 物活性物质的损伤；物活性物质的损伤；降低细胞内外的渗透压差、防止细胞内结构水结晶，以保降低细胞内外的渗透压差、防止细胞内结构水结晶，以保 持细胞的活力；持细胞的活力；保护或提供细胞复苏所需的营养物质，有利于生活力的复保护或提供细胞复苏所需的营养物质，有利于生活力的复 苏和迅速修复自身。苏和迅速修复自身。冻干保护剂作用机制冻干保护剂作用机制第六张，PPT共五十七页，创作于2022年6月 二、影响保护剂效能的因素二、影响保护剂效能的因素二、影响保护剂效能的因素二、影响保护剂效能的因素 1 1、保护剂种类、保

8、护剂种类、保护剂种类、保护剂种类:根据微生物种类或者用途来添加不同种根据微生物种类或者用途来添加不同种根据微生物种类或者用途来添加不同种根据微生物种类或者用途来添加不同种 类类类类保护剂。保护剂。保护剂。保护剂。、保护剂浓度：严格按照配方执行。、保护剂浓度：严格按照配方执行。、保护剂浓度：严格按照配方执行。、保护剂浓度：严格按照配方执行。、保护剂配制方法：糖类不能用、保护剂配制方法：糖类不能用、保护剂配制方法：糖类不能用、保护剂配制方法：糖类不能用121121高压灭菌处理。高压灭菌处理。高压灭菌处理。高压灭菌处理。、保护剂酸碱度（、保护剂酸碱度（、保护剂酸碱度（、保护剂酸碱度（PHPH值）：主

9、要对值）：主要对值）：主要对值）：主要对MM的影响。的影响。的影响。的影响。第七张，PPT共五十七页，创作于2022年6月三、常用的冻干保护剂（稳定剂）三、常用的冻干保护剂（稳定剂）三、常用的冻干保护剂（稳定剂）三、常用的冻干保护剂（稳定剂）明确不同种类微生物需要添加不同保护剂明确不同种类微生物需要添加不同保护剂明确不同种类微生物需要添加不同保护剂明确不同种类微生物需要添加不同保护剂（一）细菌的保护剂（一）细菌的保护剂（一）细菌的保护剂（一）细菌的保护剂 需氧或兼氧厌氧菌：蔗糖脱脂乳或蔗糖、需氧或兼氧厌氧菌：蔗糖脱脂乳或蔗糖、需氧或兼氧厌氧菌：蔗糖脱脂乳或蔗糖、需氧或兼氧厌氧菌：蔗糖脱脂乳或蔗

10、糖、1.51.5明胶；明胶；明胶；明胶；厌氧性细菌：含厌氧性细菌：含厌氧性细菌：含厌氧性细菌：含1.51.5谷氨酸钠的乳糖或谷氨酸钠的乳糖或谷氨酸钠的乳糖或谷氨酸钠的乳糖或1010脱脱脱脱脂乳或脂乳或脂乳或脂乳或7.57.5葡糖血清。葡糖血清。葡糖血清。葡糖血清。注：脱脂乳：注：脱脂乳：注：脱脂乳：注：脱脂乳：2020脱脂奶粉溶于水配制而成。脱脂奶粉溶于水配制而成。脱脂奶粉溶于水配制而成。脱脂奶粉溶于水配制而成。（二）病毒的保护剂（二）病毒的保护剂 5%5%蔗糖蔗糖蔗糖蔗糖 脱脂乳；脱脂乳；脱脂乳；脱脂乳；马立克马立克马立克马立克814814活细胞疫苗活细胞疫苗活细胞疫苗活细胞疫苗:保存液氮保

11、存液氮保存液氮保存液氮.稳定剂为稳定剂为稳定剂为稳定剂为10%10%二二二二甲基亚砜和甲基亚砜和甲基亚砜和甲基亚砜和50%50%犊牛血清的犊牛血清的犊牛血清的犊牛血清的199199液。液。液。液。注意注意注意注意:微生物保护剂缓冲液的组成比例，不同厂家有微生物保护剂缓冲液的组成比例，不同厂家有微生物保护剂缓冲液的组成比例，不同厂家有微生物保护剂缓冲液的组成比例，不同厂家有不同的配方。不同的配方。不同的配方。不同的配方。第八张，PPT共五十七页，创作于2022年6月15%蔗糖（乳糖）脱脂乳保护剂蔗糖（乳糖）脱脂乳保护剂蔗蔗糖糖（或或乳乳糖糖）5g，加加脱脱脂脂乳乳至至100ml，充充分分溶溶解解

12、后后，110116高高压压灭灭菌菌3040min。2明胶蔗糖保护剂明胶蔗糖保护剂明胶明胶2%3%（g/m1）、蔗蔗糖糖5%（g/m1）、硫硫脲脲 1%2%（g/m1）。先先将将12%18%明明胶胶液液、30%蔗蔗糖糖液液和和6%12%硫硫脲脲液液加加热热溶溶解解，116高高压压灭灭菌菌3040min；3 3SPGA保护剂保护剂兽医生物制品常用的保护剂兽医生物制品常用的保护剂蔗糖蔗糖76.62g、磷酸二氢钾、磷酸二氢钾0.52g、磷酸氢二钾、磷酸氢二钾1.64g、谷氨酸钠、谷氨酸钠0.83g、牛血清白蛋白、牛血清白蛋白10g、加去离子水至、加去离子水至1000ml，混合溶解，过滤除菌。，混合溶解

13、，过滤除菌。第九张，PPT共五十七页，创作于2022年6月免疫佐剂免疫佐剂一、佐剂概念与作用机理一、佐剂概念与作用机理1.佐剂（新概念）佐剂（新概念）：凡是可以增强抗原特异性免疫应答的物质称：凡是可以增强抗原特异性免疫应答的物质称为佐剂。为佐剂。佐剂（旧概念）佐剂（旧概念）：当一种物质先于抗原或与抗原混合或同时注射于当一种物质先于抗原或与抗原混合或同时注射于动物体内，动物体内，能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答答,发挥其辅佐作用的物质发挥其辅佐作用的物质.以前作为佐剂使用时没有免疫原性，但现在有所改变，如以前作为佐剂使用时没有免疫

14、原性，但现在有所改变，如IL-2是佐剂和是佐剂和IL-8一类细胞因子佐剂却不一样一类细胞因子佐剂却不一样,具有免疫调节和免疫增具有免疫调节和免疫增强作用强作用,单独使用时却具有免疫原性。单独使用时却具有免疫原性。注意注意:佐剂和免疫增强剂的关系佐剂和免疫增强剂的关系?有时佐剂也是免疫增强剂有时佐剂也是免疫增强剂.第十张，PPT共五十七页，创作于2022年6月作用特点：作用特点：明显增强抗原性微弱的物质诱导机体产生明显增强抗原性微弱的物质诱导机体产生 特异性免疫应答。特异性免疫应答。用最少的抗原和最少的接种次数，产生足用最少的抗原和最少的接种次数，产生足 够的免疫应答。够的免疫应答。第十一张，P

15、PT共五十七页，创作于2022年6月免疫佐剂作用机理免疫佐剂作用机理 改变正常免疫机能，吸引大量巨噬细胞以吞噬抗原；改变正常免疫机能，吸引大量巨噬细胞以吞噬抗原；改变抗原的构型，使抗原物质降解，并加强其免疫原性；改变抗原的构型，使抗原物质降解，并加强其免疫原性；延长抗原在组织内的贮存时间，使抗原缓慢降解和缓释，延长抗原在组织内的贮存时间，使抗原缓慢降解和缓释，并发挥免疫系统的细胞间协同作用（巨噬细胞与并发挥免疫系统的细胞间协同作用（巨噬细胞与T细胞，细胞，T细胞与细胞与B细胞）。细胞）。作用方式作用方式第十二张，PPT共五十七页，创作于2022年6月抗原递呈（抗原递呈（antigenprese

16、ntation）抗原寻的（抗原寻的（antigentargeting）免疫调节（免疫调节（immunemodulation）作用机理作用机理第十三张，PPT共五十七页，创作于2022年6月抗抗原原递递呈呈：指指抗抗原原分分子子递递呈呈给给T细细胞胞的的方方法法。佐佐剂剂与与疫疫苗苗联联合合使使用用，有有助助于于抗抗原原性性物质在胞内被加工，被物质在胞内被加工，被MHC分子特异性的结合、保护、运输并递呈给效应细胞。分子特异性的结合、保护、运输并递呈给效应细胞。第十四张，PPT共五十七页，创作于2022年6月抗原寻的（抗原寻的（antigentargeting）指指抗抗原原传传递递给给免免疫疫系系

17、统统中中适适当当效效应应细细胞胞的的效效率率。包包括括吸吸引引巨巨噬噬细细胞胞到到达达组组织织部部位位、活活化化吞吞噬噬细细胞胞、促促进进抗抗原原与与细细胞胞受受体体的的结合等有重要作用。结合等有重要作用。第十五张，PPT共五十七页，创作于2022年6月免免疫疫调调节节（immunemodulation）是是指指任任何何可可以以修修饰饰的的免免疫疫效效应应细细胞胞对对抗抗原原或或表表位位进进行行加加工工的的机机制制。通通过过这这种种机机制制，可可以以改改变变特特异异性性免免疫疫应应答答的的本本质质或或强强度度。T细细胞胞有有Th1和和Th2两两个个亚亚类类。同同一一抗抗原原和和不不同同佐佐剂剂

18、一一起起使使用用能能够够引引起起不不同同的的免免疫疫反反应应。因因此此，通过筛选特定的佐剂，可以达到诱导正确的免疫应答的目的。通过筛选特定的佐剂，可以达到诱导正确的免疫应答的目的。第十六张，PPT共五十七页，创作于2022年6月1.1.按佐剂物理性质按佐剂物理性质 颗粒型佐剂颗粒型佐剂 非颗粒型佐剂非颗粒型佐剂2.2.按佐剂的生物学性质（即按佐剂的生物学性质（即Ballanti分类法）分类法）微生物及其组分微生物及其组分 非微生物物质非微生物物质3.3.按佐剂在体内存留的时间按佐剂在体内存留的时间 贮存型佐剂（贮存型佐剂（depottypeadjuvant）非贮存型（非贮存型（non-depo

19、ttypeadjuvant）佐剂的分类佐剂的分类第十七张，PPT共五十七页，创作于2022年6月（一）颗粒性佐剂（一）颗粒性佐剂1盐类佐剂盐类佐剂氢氧化铝胶、明矾、磷酸铝等。氢氧化铝胶、明矾、磷酸铝等。2油水乳剂佐剂油水乳剂佐剂弗氏完全佐剂（弗氏完全佐剂（Freundscompleteadjuvant,FCA）、弗）、弗氏不完全佐剂（氏不完全佐剂（FIA）和矿物油白油佐剂。）和矿物油白油佐剂。3免疫刺激复合物佐剂（免疫刺激复合物佐剂（ISCOM）4蜂胶佐剂（蜂胶佐剂（propolis）5脂质体佐剂（脂质体佐剂（liposomes）。）。6其他：其他：MF59佐剂、微囊化佐剂（佐剂、微囊化佐剂（

20、micro-encapsulation)、硬脂酰酪氨酸佐剂和硬脂酰酪氨酸佐剂和菊粉菊粉等。等。第十八张，PPT共五十七页，创作于2022年6月（二）非颗粒性佐剂（二）非颗粒性佐剂1肽类佐剂（peptides）：胞壁酰二肽（MDP）及其衍生物、去胞壁酰多肽、脂肽和免疫调节多肽。2表面活性分子类佐剂：海藻糖合成衍生物（TDM）3核酸及其衍生物类佐剂：合成核苷酸聚合体、CpG4含硫复合物类佐剂：左旋咪唑5碳水化合物高分子类佐剂：香菇多糖、DEAE-葡聚糖6细胞因子类佐剂（cytokine）：IL-2、IL-4和-IFN等。7脂质分子类佐剂：脂多糖、VitA和VitE等脂溶性维生素8其他：霍乱毒素（C

21、T）、百日咳毒素（PT）和破伤风类毒素（TT）等；脂磷壁酸（LTA）；维生素B12等。第十九张，PPT共五十七页，创作于2022年6月合成方法:（1）用铝粉加烧碱合成法2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4Al2(SO4)318H2OA12(SO4)318H2O+6NaOH2Al(OH)3+2Na2SO4+18H2O（2）用明矾加碳酸钠合成法2KAl(SO4)2+3Na2CO3+3H2O2Al(OH)3+3Na2SO4+3CO2（3）用三氯化铝与氢氧化钠合成A1C13+3NaOHAl(OH)3+3NaCl氢氧化铝胶氢氧化铝胶(铝胶）铝胶）第二十张，PPT共五十七页，创作于2022年6月用铝

22、粉加烧碱合成法：用铝粉加烧碱合成法：2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4Al2(SO4)318H2OA12(SO4)318H2O+6NaOH2Al(OH)3+2Na2SO4+18H2O用铜纱筛滤过，用布袋脱水过夜，收存于容器内，可约得600kg铝胶。取氢氧化铝干粉5055kg，加入6万毫升沸水中，搅拌均匀;倒入硫酸100kg，爆沸至棕褐色，经3060min后，加温水，边加边搅拌约至总量为35万毫升；用前加水稀释至100万毫升，温度约为80，盛装在一个缸内另一缸盛80kg烧碱，加水至100万毫升，加温至75两液等量逐渐流入另一耐酸搪瓷缸内，蒸汽吹沸熟化10min，调节pH6.9土0.1，继

23、续熟化3min，稳定pH6.9土0.1静置沉淀，弃上清后加入约5倍量软化水，搅拌洗涤、弃上清，如此35次，检查至硫酸盐合格为止。第二十一张，PPT共五十七页，创作于2022年6月 氢氧化铝吸附力较强，所以要用软化水或去离子水洗涤。氢氧化铝胶为两性化合物，过酸或过碱都会失去胶态。故要 掌握好化合时的pH值。贮存铝胶应放在耐酸搪瓷缸或耐酸池中，严密封盖，贮放期 不超过3个月。铝胶室温保存，以免破坏胶态。注意事项注意事项第二十二张，PPT共五十七页，创作于2022年6月是指一类由油类物质和乳化剂按一定比例混合形成的佐剂。该类佐剂主要在抗原寻的过程中起作用，使抗原在注射部位保持稳定，为抗原在淋巴系统中

24、转运提供载体，增加单核细胞的形成和积聚。油乳剂疫苗的免疫效力高低，直接与乳化作用的好坏和乳剂成分的质量等有关。一种好的乳剂疫苗应是油包水（W/O）或水包油（O/W）型，粘度低，颗粒均匀，稳定性良好，呈乳白色。“乳剂”是将一种溶液或干粉分散成细小的微粒，混悬于另一不相溶的液体中所成的分散体系。被分散的物质称为分散相（内相），承受分散相的液体称连续相（外相），两相间的界面活性物质称为乳化剂。油乳佐剂油乳佐剂第二十三张，PPT共五十七页，创作于2022年6月乳化剂乳化剂1.天然乳化剂：阿拉伯胶、海藻酸钠、蛋黄以及炼乳2.人工合成乳化剂3.离子型阴离子类乳化剂：十二烷基磺酸钠和硬脂酸铝阳离子类乳化剂：

25、氯化苯甲烃铵、溴化十六烷三甲基非离子型：月桂酸聚甘油脂、山梨醇脂和单油酸脂、司本-80、吐温-80第二十四张，PPT共五十七页，创作于2022年6月白油佐剂白油佐剂国内外常用白油：Drakocel-6VR、Marcol-52和Lipolul-47号或10号白油质量标准:无色无味50运动粘度7m2s左右紫外吸收A250-3500.1，紫外消光系数12108；单环芳烃与双环芳烃含量低于0.5，无多环芳烃；小鼠腹腔注射0.5ml或家免皮下注射2.0ml白油，观察60d，表现正常。第二十五张，PPT共五十七页，创作于2022年6月乳剂配方与乳化方法乳剂配方与乳化方法（1）剂在水中法：将乳化剂直接溶于水

26、中，在激烈搅拌下将油加入，可直接生成O/W乳剂。若欲得W/O型，可继续加入油，直到发生变型。该法通常用匀浆器或胶体磨，高速搅拌而得到较好的乳剂。（2）剂在油中法：将乳化剂溶于油相，将油相直接加入水相中得O/W，如水相直接加入油相，得到W/O型，如欲得O/W，继续加入至变型。该法制成的乳剂，一般均匀颗粒直径在0.5m左右，比较稳定。第二十六张，PPT共五十七页，创作于2022年6月免疫实验动物用的佐剂配制免疫实验动物用的佐剂配制:(1)弗氏佐剂：矿物油75%85，乳化剂1525%，混合后经除菌过滤而成为FIA；如向其中加入0.5mgm1死结核杆菌即为FCA。使用时，将含抗原的水相，与上述任一佐剂

27、等量混合，用力振摇即可成为均匀的乳剂。(2)白油佐剂：9份油和1份司本-80混合后加2吐温-80和12%硬脂酸铝，经高压灭菌后备用，注射前将配好的油佐剂与抗原水相1：1混合，强力振摇，可配制成性状良好的乳剂疫苗。第二十七张，PPT共五十七页，创作于2022年6月大量生产乳剂疫苗大量生产乳剂疫苗:油相:94白油、6司本-80、1%2硬脂酸铝，灭菌即可；水相：抗原液加24%吐温-80 乳化：将油相与水相按3：12：1比例配制，先缓速混合，再 通过胶体磨充分乳化，可获得稳定的油包水乳剂苗。或者将粘稠的W/O乳剂疫苗，再加2吐温-80生理盐 水，通过搅拌或胶体磨乳化，可制成双相乳剂疫苗。第二十八张，P

28、PT共五十七页，创作于2022年6月油乳剂检验油乳剂检验（1）粘度测定：流出法、Saybolt粘度计法。吸管内口直径为1.2mm，室温下吸满lml乳剂，垂直放出0.4ml所需时间作为粘度单位。以2-6S为合格，不得多于10-15S。（2）乳剂稳定性测定：加速老化法：疫苗于37贮存10-30d不破乳。离心加速分层法：3000rpm离心15min不分层，相当于保存1年以上不破乳。第二十九张，PPT共五十七页，创作于2022年6月蜂胶佐剂（蜂胶佐剂（Propolis）是一种优良的天然药物是一种优良的天然药物 供免疫佐剂用的蜂胶外观应具备其固有的特征供免疫佐剂用的蜂胶外观应具备其固有的特征 具有广泛的

29、生物活性和药理作用（具有广泛的生物活性和药理作用（抗菌、抗病毒、抗肿瘤、消炎）抗菌、抗病毒、抗肿瘤、消炎）具有免疫增强作用：具有免疫增强作用：能保持抗原特性，增强巨噬细胞的吞噬能力，促进抗体的能保持抗原特性，增强巨噬细胞的吞噬能力，促进抗体的 产生，提高机体的特异性和非特异性免疫力。产生，提高机体的特异性和非特异性免疫力。第三十张，PPT共五十七页，创作于2022年6月（1）蜂胶的处理：蜂胶（4以下贮存）粉碎过筛按1：4（W/V）加95乙醇室温浸泡2448h冷却过滤或离心取上清透明栗色纯净蜂胶浸液4以下保存备用除去干渣计算出浸液中含蜂胶量。（2）蜂胶佐剂疫苗的制备：灭活菌液或病毒液，加入蜂胶乙

30、醇浸液，使每毫升菌液中含蜂胶10mg，边加边摇荡，成为乳浊状，即可。蜂胶佐剂疫苗制备方法：蜂胶佐剂疫苗制备方法：第三十一张，PPT共五十七页，创作于2022年6月细胞因子类免疫佐剂细胞因子类免疫佐剂（cytokine）细胞因子的概念细胞因子的概念是是机机体体的的各各种种细细胞胞在在其其生生命命周周期期中中所所释释放放的的具具有有不不同同生生物物学学效效应应的的物物质质，是是免免疫疫细细胞胞间间相相互互作作用用的的调调节节信信号号。该该类类物物质质相相互互诱诱生生，相相互互影影响响，构构成成一一个个巨巨大大的的细细胞胞因因子子网网络络（cytokinenetwork）系系统统，各各种种细细胞胞借

31、借助助自自己己所所释释放放的的细细胞胞因因子子完完成成各各自自的的功功能能，在在免免疫疫应应答中发挥作用。答中发挥作用。第三十二张，PPT共五十七页，创作于2022年6月细胞因子类免疫佐剂细胞因子类免疫佐剂（cytokine）细胞因子的分类（细胞因子的分类（根据生物活性）根据生物活性）1.经典的细胞因子：淋巴毒素（经典的细胞因子：淋巴毒素（LT）、肿瘤坏死因子（）、肿瘤坏死因子（TNF）干扰素（干扰素（INF）2.对体液免疫和细胞免疫具有调节作用的因子：对体液免疫和细胞免疫具有调节作用的因子：白细胞介素（白细胞介素（IL）和集落刺激因子（）和集落刺激因子（CSF）第三十三张，PPT共五十七页，

32、创作于2022年6月第三十四张，PPT共五十七页，创作于2022年6月第三十五张，PPT共五十七页，创作于2022年6月1多效性：多效性：免疫调节作用的多样性免疫调节作用的多样性作用方式的非特异性：不表现抗原特异性作用方式的非特异性：不表现抗原特异性2靶细胞的多样性：构成机体细胞靶细胞的多样性：构成机体细胞细胞调节网络细胞调节网络3多源性：多源性：4高效性：有免疫激素（高效性：有免疫激素（immunehormone）之称）之称5快速反应性：即对激发因素的迅速反应快速反应性：即对激发因素的迅速反应细胞因子的作用特点细胞因子的作用特点第三十六张，PPT共五十七页，创作于2022年6月多样性多样性P

33、leiotropism交叉性交叉性Redundancy协同性协同性Synergy对抗性对抗性Antagonism第三十七张，PPT共五十七页，创作于2022年6月1作为免疫佐剂，提高疫苗的免疫效果作为免疫佐剂，提高疫苗的免疫效果2作为免疫治疗剂，预防和治疗某些病原感染作为免疫治疗剂，预防和治疗某些病原感染3通过基因重组，构建新型基因工程疫苗通过基因重组，构建新型基因工程疫苗IL-2-AIV-HA重组痘病毒重组痘病毒细胞因子的应用细胞因子的应用第三十八张，PPT共五十七页，创作于2022年6月几种重要的细胞因子几种重要的细胞因子 白细胞介素白细胞介素-2（IL-2）白细胞介素白细胞介素-4（IL

34、-4）白细胞介素白细胞介素-12（IL-12）-干扰素（干扰素（IFN-）第三十九张，PPT共五十七页，创作于2022年6月 刺激物为抗原或促有丝分裂原（ConA）；T细胞分泌；无抗原特异性 糖蛋白，含133aa，分子量15-35kDa；7030min及pH值2-9范围内稳定IL-2第四十张，PPT共五十七页，创作于2022年6月刺激物：抗原或丝裂原；由Th细胞产生分子量1520kDa，有23个糖基化部位，140个氨基酸一种强有力的佐剂候选因子IL-4第四十一张，PPT共五十七页，创作于2022年6月 是目前发现的唯一主要由B细胞产生的细胞因子，与IL-2有协同作用，所以曾被称为细胞毒淋巴细胞

35、成熟因子（CLMF）和天然杀伤细胞刺激因子（NKSF）。糖蛋白，分子量75kDa，由40kDa（P40）和35kDa（P35）两个亚单位构成，两个亚单位完全由不同的基因所编码，只有结合为一个完整的分子时才能发挥生物学活性。IL-12活性高于IL-2和IFN，在极低浓度时就有显著活性，对灭活疫苗、肿瘤和寄生虫抗原具有有效的佐剂活性。IL-12诱导产生的Th1应答反应尤为引人注目，可望用于主要诱导细胞免疫应答的疫苗佐剂。IL-12第四十二张，PPT共五十七页，创作于2022年6月由致敏T细胞在活的或灭活的病毒等干扰素诱生剂和某些细胞因子作用下所产生；糖蛋白，分子量2025kDa，由144个氨基酸组

36、成。有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节和免疫佐剂等免疫生物学活性。目前IFN-与抗原杂合的融合分子的研究是个热点，期待其成为一个有效的佐剂。IFN-第四十三张，PPT共五十七页，创作于2022年6月目前，我国已开发研制成功猪白细胞干扰素目前，我国已开发研制成功猪白细胞干扰素（swineinterferon）。该制品系用鸡新城疫病毒）。该制品系用鸡新城疫病毒诱导健康猪白细胞，经培养、灭活病毒、除菌、诱导健康猪白细胞，经培养、灭活病毒、除菌、分装等工艺制成。用于防治猪流行性腹泻。分装等工艺制成。用于防治猪流行性腹泻。第四十四张，PPT共五十七页，创作于2022年6月CpGDNA，CpGONDCpGDNA：

37、指含有非甲基化指含有非甲基化CpG（胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸）基序（胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸）基序的脱氧核糖核酸的脱氧核糖核酸DNA。CpG基序（基序（motif）：指以非甲基化的：指以非甲基化的CpG为基元构成的回文序列，为基元构成的回文序列，其碱基排列大多为其碱基排列大多为5-PurPur-CG-PyrPyr-3，具有较强免疫活性，称，具有较强免疫活性，称为免疫刺激序列（为免疫刺激序列（ISS，immunostimulatoryDNAsequences）。）。CpGOND：含有非甲基化含有非甲基化CpGCpG基序的寡聚脱氧核苷酸基序的寡聚脱氧核苷酸 。第四十五张，PPT共五十七页，创作于2022年

38、6月细胞因子的分泌和细胞的分化细胞因子的分泌和细胞的分化CpGDNA的免疫刺激效应（作用机制）的免疫刺激效应（作用机制）温度温度能量能量酸化内体酸化内体小泡小泡DNA-PKTLR-9胞质内受体胞质内受体蛋白蛋白有有丝丝分分裂裂原原蛋蛋白白激激酶酶和和转转录录因因子子等等信信号号通通路路第四十六张，PPT共五十七页，创作于2022年6月引引起起B细细胞胞分分化化，分分泌泌IL-6、IL-10等等细细胞胞因因子子和和表表达达MHCII、B7-1、B7-2等表面分子，并阻止等表面分子，并阻止B细胞的凋亡。细胞的凋亡。直直接接激激活活单单核核细细胞胞、巨巨噬噬细细胞胞和和树树突突细细胞胞，分分泌泌IL

39、-12、INF-r等等Thl样样为主的细胞因子，并刺激为主的细胞因子，并刺激MHCII、B7-1、B7-2的表达。的表达。在在IL-12协协同同下下激激活活NK细细胞胞，杀杀伤伤活活性性增增强强，并并分分泌泌IFN-r，IFN-r反反过来进一步促进单核细胞、巨噬细胞和树突细胞的激活。过来进一步促进单核细胞、巨噬细胞和树突细胞的激活。协协同同刺刺激激抗抗原原特特异异性性B细细胞胞和和T细细胞胞分分化化，在在Thl细细胞胞因因子子的的作作用用下下，显著增强获得性细胞免疫显著增强获得性细胞免疫-优良的优良的T细胞免疫佐剂。细胞免疫佐剂。1CpGDNA对多种免疫细胞有激活作用对多种免疫细胞有激活作用第

40、四十七张，PPT共五十七页，创作于2022年6月含有GACGTT-基序的CpGOND小鼠淋巴细胞含有AGCGTG基序的CpGOND小鼠的NK细胞含有GTCGTT基序的CpGOND人淋巴细胞含有ATCGAT基序的CpGOND鸡外周血单核细胞含有GTCGTT基序的CpGOND牛B细胞的增殖和分泌IL-6PBMC分泌IL-6、IL-l2和IFN-r；含有ATCGAT基序的CpGOND猪(Kamstrup，2001)2CpGOND免疫刺激作用具有物种和细胞特异性免疫刺激作用具有物种和细胞特异性第四十八张，PPT共五十七页，创作于2022年6月CpGODN的体内效应与应用的体内效应与应用1对天然免疫系统

41、的刺激活性对天然免疫系统的刺激活性（1）抗感染：单核李斯特杆菌、利什曼原虫、疟原虫、单纯疱疹病毒 （2）抗肿瘤活性：黑色素瘤2.对特异性免疫反应的调节作用对特异性免疫反应的调节作用疫苗佐剂疫苗佐剂（1）CpGODN对蛋白质抗原的作用对蛋白质抗原的作用能够增强许多抗原诱导的Thl型反应HbsAg、牛疱疹病毒I型糖蛋白D、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、疟疾的多肽、麻疹病毒、放线杆菌胸膜肺炎、流感病毒疫苗、猫疱疹病毒、猫细小病毒和猫白血病病毒（2）CpGONG对对DNA疫苗的作用疫苗的作用3 3过敏性疾病治疗过敏性疾病治疗第四十九张，PPT共五十七页，创作于2022年6月霍乱毒素（霍乱毒素（CT）大肠杆

42、菌不耐热毒素（大肠杆菌不耐热毒素（LT）破伤风类毒素（破伤风类毒素（TT）基因工程减毒素基因工程减毒素第五十张，PPT共五十七页，创作于2022年6月（一）霍乱毒素（一）霍乱毒素（CT）良好的粘膜免疫佐剂 由A和B两个区构成的蛋白B区具有主要免疫学作用，内含5种独立的非共价连接的B亚单 位（CTB），无毒性，可与细胞结合。A区是CT的生物学活性部分，具有酶活性。仙台病毒CT；CTB流感病毒HA；链球菌表面蛋白CTB；CT毒素A和B两个亚单位的表达质粒DNA作为佐剂与DNA疫苗联和应用，还可诱导机体产生很强的Th1细胞因子反应（如IFN-）和Th2细胞因子反应（如IL-4），具有很强的佐剂作用。

43、第五十一张，PPT共五十七页，创作于2022年6月（二）大肠杆菌不耐热毒素（二）大肠杆菌不耐热毒素（LT）大肠杆菌LT毒素有A和B两个亚单位，有一定抗原性A亚单位基因工程点突变体LT(R192G)无毒性作用，但仍保留了其佐剂效应可诱导机体产生局部粘膜免疫反应。利用基因突变技术，构建的A和B两个亚单位的表达质粒DNA联合应用，也可诱导机体产生很强的Th1细胞因子反应（IFN-）和Th2细胞因子反应（IL-4）。而且，LT毒素表达质粒作为佐剂，可协助DNA疫苗诱导机体产生更强的细胞免疫反应，有望成为一种新型免疫增强剂。第五十二张，PPT共五十七页，创作于2022年6月免疫刺激复合物（免疫刺激复合物

44、（immunostimulatingcomplex，ISCOM）ISCOM由抗原物质与由皂树皮提取的一种糖苷QuilA和胆固醇按1:1:1混合后自发形成的一种具有较高免疫活性的脂质小泡。ISCOM直径40nm，每个ISCOM约含1012分子的蛋白质。ISCOM应用于多种细菌、病毒和寄生虫病的疫苗，具有产生“全面”免疫应答的效力，可长期增强特异性抗体应答。ISCOM能有效地通过粘膜给药，从而可以用于抗呼吸道感染。目前，兽用ISCOM疫苗已在国外投放市场。第五十三张，PPT共五十七页，创作于2022年6月2、佐剂作用机理：、佐剂作用机理：机理非常复杂，但可概括三个方面。（不同书有不同写法）机理非常

45、复杂，但可概括三个方面。（不同书有不同写法）抗原储存库延长抗原储存时间，延长抗原释放，加强抗原降抗原储存库延长抗原储存时间，延长抗原释放，加强抗原降解等；解等；形成肉芽肿，促进炎症反应，增强吞噬细胞吞噬作用；形成肉芽肿，促进炎症反应，增强吞噬细胞吞噬作用；刺激淋巴细胞增殖和转化。刺激淋巴细胞增殖和转化。二、佐剂分类二、佐剂分类 不溶性铝盐类佐剂不溶性铝盐类佐剂 油水乳剂佐剂油水乳剂佐剂 常用常用佐剂佐剂免疫免疫 蜂胶佐剂蜂胶佐剂 细胞因子佐剂细胞因子佐剂 佐剂佐剂 微生物及代谢产物佐剂微生物及代谢产物佐剂 免疫刺激复合物（免疫刺激复合物（Iscom）新型免疫佐剂新型免疫佐剂 脂质体佐剂（脂质体

46、佐剂（Liposomes）MF59佐剂佐剂第五十四张，PPT共五十七页，创作于2022年6月一）常用免疫佐剂一）常用免疫佐剂1、铝盐类佐剂、铝盐类佐剂 氢氧化铝胶：主要用于兽用细菌灭活苗（氢氧化铝胶：主要用于兽用细菌灭活苗（20%乳胶液）乳胶液）2、油水乳剂佐剂、油水乳剂佐剂油乳佐剂是指一类由油类物质和乳化剂按一定比例混合形成的佐油乳佐剂是指一类由油类物质和乳化剂按一定比例混合形成的佐剂。剂。弗氏佐剂：矿物质（液体石蜡）、乳化剂（羊毛脂）、卡介弗氏佐剂：矿物质（液体石蜡）、乳化剂（羊毛脂）、卡介 苗组成苗组成 的油包水乳化佐剂（三种成分俱全成为的油包水乳化佐剂（三种成分俱全成为弗弗 氏完全佐剂

47、氏完全佐剂，不含卡介苗或死结核杆菌的为，不含卡介苗或死结核杆菌的为弗氏弗氏 不完全佐剂不完全佐剂）很少用于疫苗，因为太稠，注射困）很少用于疫苗，因为太稠，注射困 难，但在实验中应用广。难，但在实验中应用广。矿物油：白油矿物油：白油白油佐剂白油佐剂 乳化剂：司苯乳化剂：司苯-80、硬脂酸铝、吐温、硬脂酸铝、吐温-80。第五十五张，PPT共五十七页，创作于2022年6月油乳剂疫苗生产方法见书上油乳剂疫苗生产方法见书上55页。即油乳佐剂和病毒液或菌液按一定比页。即油乳佐剂和病毒液或菌液按一定比例混合，经搅拌（高油）或胶体磨乳化而成例混合，经搅拌（高油）或胶体磨乳化而成油乳剂疫苗：油乳剂疫苗：4以上保

48、存，不能冻结，否则易分层即破乳（常温以上保存，不能冻结，否则易分层即破乳（常温下保存下保存1年以上，都不分层）。年以上，都不分层）。3、蜂胶佐剂（见书）、蜂胶佐剂（见书）二二)新型免疫佐剂新型免疫佐剂 1、细胞因子类佐剂（相当于胸腺肽、干扰素等因子作用）、细胞因子类佐剂（相当于胸腺肽、干扰素等因子作用）干扰素（干扰素（、（抗病毒）（抗病毒）（免疫调节，抗肿瘤）（免疫调节，抗肿瘤）细胞因子细胞因子 白细胞介素（白细胞介素（IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-18IL-21）肿瘤坏死因子（肿瘤坏死因子（TFN-,TFN-集落刺激因子集落刺激因子第五十六张，PPT共五十七页，创作于2022年6月感感谢谢大大家家观观看看9/17/20229/17/2022第五十七张，PPT共五十七页，创作于2022年6月