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1、关于菌种选育理论和技术第1页，讲稿共60张，创作于星期三第一节第一节 微生物分离微生物分离1.1 菌种分离的一般过程菌种分离的一般过程土样的采取土样的采取 预处理预处理 培养培养 菌落的选择菌落的选择 产品的鉴定产品的鉴定如何使样品中所含微生物的可能性大如何使样品中所含微生物的可能性大如何在后续的操作中使这种可能性实现如何在后续的操作中使这种可能性实现目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物问题：问题：第2页，讲稿共60张，创作于星期三1.2 采样时要注意的问题采样时要注意的问题 气候、水分、空气气候、水分、空气 来源要广来源要广 结合产品的特点结合产品
2、的特点 标签：地点、时间、气候等标签：地点、时间、气候等第3页，讲稿共60张，创作于星期三 富集的三种方案：富集的三种方案：定向培养定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集采用特定的有利于目的微生物富集 的条件，进行培养。的条件，进行培养。1.3 目的微生物富集的一些基本方法目的微生物富集的一些基本方法 富集的目的：富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。能。当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑。类学中考虑。不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这
3、 时只能通过随机分离的办法。时只能通过随机分离的办法。第4页，讲稿共60张，创作于星期三定向培养的富集方法定向培养的富集方法1 1、底物、底物2 2、pHpH条件条件3 3、培养时间、培养时间4 4、培养温度、培养温度等一切能提高目的微生物相对生长速等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优连续）后使目的微生物在种群中占优势。势。定向培养的方法物理方法：加热、膜过滤等物理方法：加热、膜过滤等但主要是通过但主要是通过培养培养的方法的方法第5页，讲稿共60张，创作于星期三1.4 菌落的选出菌落的选出 从产物角度出
4、发从产物角度出发在培养时以产物的形成有目的的设计培养基在培养时以产物的形成有目的的设计培养基利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素 从形态的角度从形态的角度 菌菌落落的的外外观观形形态态，是是微微生生物物的的一一个个重重要要表表征征。如如多多糖糖产产生生菌菌在在适适当当的的培培养养基基上上生生长长，从从具具有有粘粘液液性性的的菌菌落落外观上就可以初步识别。外观上就可以初步识别。第6页，讲稿共60张，创作于星期三例：醛肟水解酶的筛选例：醛肟水解酶的筛选 -Journal of biotechnology 94(2002),65-72培养基中含培养基中含0.05%of
5、 Z-PAOx0.05%of Z-PAOx 每隔每隔2-32-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基天移去一半培养物，补充新鲜培养基不断分析样品，不断分析样品，2-32-3个月后个月后Z-PAOxZ-PAOx降低后，稀释分离单菌落降低后，稀释分离单菌落第7页，讲稿共60张，创作于星期三1.5 目的微生物富集方法的研究进展目的微生物富集方法的研究进展 分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物 的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如:16SRNA:16SRNA同同 源性分析，基因序列分析及源性分析，基因序列分
6、析及DNA/DNADNA/DNA杂交技术等杂交技术等 目前土壤中能够培养的微生物不到总数的目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%1%。微生物的。微生物的 多样性及资源的开发仍然是今后若干年的研究重点。多样性及资源的开发仍然是今后若干年的研究重点。In In contrast contrast to to this this traditional traditional approach,approach,modern modern molecular molecular biology biology techniques techniques allow allow for for DN
7、A DNA library library expression expression screening,screening,which which also also enables enables access access to to enzymes enzymes of of nonculturable nonculturable organisms.organisms.By By this this strategy,strategy,for for instance,instance,the the company company Diversa Diversa(San(San
8、Diego,Diego,CA,CA,USA)USA)identised identised 120 120 unique unique esterases/lipases esterases/lipases from from only only 16%16%of of the the total total DNA obtained from an alkaline soil sample.DNA obtained from an alkaline soil sample.第8页，讲稿共60张，创作于星期三第二节第二节 自然选育自然选育 2.1 定义定义 利用微生物在一定条件下产生自发突变的
9、原理，通过分离，利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分离，筛选排除衰退型菌株，从中选择维持原有水平的菌株，又称筛选排除衰退型菌株，从中选择维持原有水平的菌株，又称自然分离。自然分离。二、菌种退化的原因二、菌种退化的原因自发突变；异核体的存在；突变株不稳定自发突变；异核体的存在；突变株不稳定第9页，讲稿共60张，创作于星期三生产菌种斜面生产菌种斜面制备单孢子悬浮液制备单孢子悬浮液 分离出单菌落分离出单菌落 斜面种子斜面种子 高产菌株高产菌株沙土管菌种沙土管菌种斜面种子斜面种子 摇瓶复筛摇瓶复筛 高产纯化株高产纯化株 生产试验生产试验进一步选育或保藏进一步选育或保藏移种移种摇瓶初筛摇瓶初
10、筛2.2 自然选育流程图自然选育流程图第10页，讲稿共60张，创作于星期三第11页，讲稿共60张，创作于星期三第三节第三节 诱变育种诱变育种 3.1 定义定义 将生物体暴露于物理、化学或生物诱变剂作用下，促使生物将生物体暴露于物理、化学或生物诱变剂作用下，促使生物体发生突变、提高变异幅度，从而选出优良菌种的过程。体发生突变、提高变异幅度，从而选出优良菌种的过程。第12页，讲稿共60张，创作于星期三稳定性试验、菌种特性考察稳定性试验、菌种特性考察高产菌株高产菌株斜面种子斜面种子 摇瓶复筛摇瓶复筛 高产纯化株高产纯化株 生产菌种斜面生产菌种斜面制备单孢子悬浮液制备单孢子悬浮液 分离出单菌落分离出单
11、菌落 斜面种子斜面种子 诱变处理诱变处理统计存活统计存活率率统计变异率统计变异率3.2 诱变育种流程图诱变育种流程图放大、菌种保藏放大、菌种保藏第13页，讲稿共60张，创作于星期三3.3 诱变剂诱变剂 凡能提高生物体突变频率的物质称凡能提高生物体突变频率的物质称诱变剂诱变剂。3.3.1 物理诱变剂物理诱变剂 紫外线、紫外线、X射线、射线、射线、快中子、离子束射线、快中子、离子束 UV：260nm，是碱基共轭体系的最高吸收峰，是碱基共轭体系的最高吸收峰 引起胸腺嘧啶二聚体的形成和胞嘧啶水合作用引起胸腺嘧啶二聚体的形成和胞嘧啶水合作用 生物学效应：生物学效应：DNA链的断裂；链的断裂；DNA分子内
12、和分子间的交联；分子内和分子间的交联；核酸和蛋白的交联。核酸和蛋白的交联。第14页，讲稿共60张，创作于星期三 实验室：实验室：15W，253.7nm，灯管与样品的距离，灯管与样品的距离30cm，剂量，剂量由时间（由时间（30秒、秒、60秒、秒、90秒、秒、120秒）或能量（格尔）决定。秒）或能量（格尔）决定。死亡率控制在死亡率控制在7090%。诱变后注意要诱变后注意要避光培养避光培养（因为光复活现象）。（因为光复活现象）。第15页，讲稿共60张，创作于星期三 3.3.2 化学诱变剂化学诱变剂 烷化剂烷化剂：如亚硝基胍（：如亚硝基胍（NTG）、硫酸二乙酯（）、硫酸二乙酯（DES）、乙烯亚）、乙
13、烯亚胺（胺（EI）、氮芥）、氮芥 作用机制：使核酸的氮原子上烷基，从而使配对错误。作用机制：使核酸的氮原子上烷基，从而使配对错误。碱基类似物碱基类似物：5-氟尿嘧啶，氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，溴尿嘧啶，2-氨基嘌呤氨基嘌呤COBr5-BU:酮式COHBr5-BU:烯醇式第16页，讲稿共60张，创作于星期三第17页，讲稿共60张，创作于星期三移码诱变剂移码诱变剂：丫啶橙、丫啶黄：丫啶橙、丫啶黄 引起碱基丧失或增加引起碱基丧失或增加抗癌药物抗癌药物：丝裂霉素、争光霉素：丝裂霉素、争光霉素 抑制抑制DNA复制复制3.3.3 生物诱变剂生物诱变剂 噬菌体，转座子噬菌体，转座子第18页，讲稿共60张，创作
14、于星期三3.4 菌种诱变的方法菌种诱变的方法 诱变育种包括诱变育种包括出发菌种选择出发菌种选择、诱变处理诱变处理和和筛选突变筛选突变株株三个部分。三个部分。3.4.1 出发菌种选择出发菌种选择原则：原则：选取纯种作为出发菌株 选择具有优良性状的菌株 对诱变剂敏感的菌株第19页，讲稿共60张，创作于星期三 处理单孢子（或单细胞）悬液：处理单孢子（或单细胞）悬液：芽孢杆菌应处理芽孢放线菌，霉菌应处理孢子细菌指数期，放线菌、霉菌要稍加萌发后使用出发菌株应制成均匀悬液第20页，讲稿共60张，创作于星期三诱变剂的使用：诱变剂的使用：剂量以诱变剂浓度和处理时间来表示剂量以诱变剂浓度和处理时间来表示合适剂量
15、：合适剂量：能扩大变异幅度又能促使能扩大变异幅度又能促使 变异移向正变范围的剂量变异移向正变范围的剂量 3.4.2 诱变处理诱变处理还可加诱变增强剂还可加诱变增强剂:如如LiCl第21页，讲稿共60张，创作于星期三充分利用复合处理的协同效应充分利用复合处理的协同效应两种或多种诱变剂先后使用同种诱变剂重复使用两种或多种诱变剂同时使用第22页，讲稿共60张，创作于星期三3.4.3 突突变株的选择变株的选择3.4.3.1 随机筛选随机筛选摇瓶筛选法摇瓶筛选法琼脂块筛选法琼脂块筛选法筛选自动化和筛选工具微型化筛选自动化和筛选工具微型化第23页，讲稿共60张，创作于星期三一个出发菌株诱变剂处理选出200
16、个单 孢子菌菌株初筛（每株1瓶）选出50株第一轮第二轮五个出发菌株初筛（每株1瓶）选出50株复筛（每株4瓶）诱变剂处理选出5 株40株40株40株40株40株复筛（每株4瓶）选出5 株高效高效摇瓶摇瓶筛选方案筛选方案第24页，讲稿共60张，创作于星期三诱变诱变春日霉素产生春日霉素产生菌的孢子悬液菌的孢子悬液含供试菌种（拮抗对象）的琼脂平板 琼脂块培养筛选法 春日霉素高产菌种第25页，讲稿共60张，创作于星期三 3.4.3.2 理性化筛选理性化筛选初级代谢产物高产菌株的筛选初级代谢产物高产菌株的筛选筛选营养缺陷型筛选营养缺陷型若分别筛选、高产菌株，根据下列代谢途径，应：若分别筛选、高产菌株，根据
17、下列代谢途径，应：A B C D EA B C DEF筛选筛选E缺陷型缺陷型筛选筛选F缺陷型缺陷型第26页，讲稿共60张，创作于星期三筛选细胞膜透性改变的突变株筛选细胞膜透性改变的突变株 筛选油酸缺陷型或甘油缺陷型筛选油酸缺陷型或甘油缺陷型 筛选结构类似物抗性突变株筛选结构类似物抗性突变株 结构类似物一方面与代谢物结构相似，结构类似物一方面与代谢物结构相似，有相似的反馈调有相似的反馈调节作用节作用；一方面不同于代谢物不具有正常的生理功能，；一方面不同于代谢物不具有正常的生理功能，使细胞死使细胞死亡亡。添加此类物质，大部分细胞缺少该种初级代谢物而死亡，生长添加此类物质，大部分细胞缺少该种初级代谢
18、物而死亡，生长下来的菌株对此结构类似物不敏感，不受此反馈调节抑制。下来的菌株对此结构类似物不敏感，不受此反馈调节抑制。第27页，讲稿共60张，创作于星期三HD:高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制的合成调节机制 HT:高丝氨酸转乙酰酶高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶结构类似物抗性结构类似物抗性：Lys的类似物AEC,Thr的类似物AHV营养缺陷型营养缺陷型：如Thr缺陷型第28页，讲稿共60张，创作于星期三黄色短杆菌黄色短杆菌F9-50的诱变谱系的诱变谱系 Bervibacterium flavum As 1.495 (Ile-)lys.
19、HCl 2.1 g/lF6-16 (Ile-,Thr-)20.8 g/lF9-50(leu-,Thr-,AEC r)33.5 g/l第29页，讲稿共60张，创作于星期三 利用回复突变筛选抗反馈突变株利用回复突变筛选抗反馈突变株 先选对产物敏感的菌株，再诱变处理得到恢复突变株（改先选对产物敏感的菌株，再诱变处理得到恢复突变株（改变酶的调节位点，不受产物的反馈抑制）。变酶的调节位点，不受产物的反馈抑制）。第30页，讲稿共60张，创作于星期三 次级代谢产物高产菌株的筛选次级代谢产物高产菌株的筛选筛选营养缺陷型筛选营养缺陷型筛选负变株或零变株的回复突变株筛选负变株或零变株的回复突变株筛选去磷酸盐调节突
20、变株筛选去磷酸盐调节突变株 磷酸盐对许多抗生素的生物合成有抑制作用磷酸盐对许多抗生素的生物合成有抑制作用第31页，讲稿共60张，创作于星期三筛选去除碳源分解代谢突变株筛选去除碳源分解代谢突变株 能被菌快速利用的碳源在被代谢后，对其他代谢途径能被菌快速利用的碳源在被代谢后，对其他代谢途径的酶有抑制作用，例葡萄糖效应。的酶有抑制作用，例葡萄糖效应。葡萄糖效应：培养基中同时含有葡萄糖和乳糖，微生物葡萄糖效应：培养基中同时含有葡萄糖和乳糖，微生物先利用葡萄糖、葡萄糖利用完后才利用乳糖，出现两次菌体先利用葡萄糖、葡萄糖利用完后才利用乳糖，出现两次菌体生长旺盛时期，若加入乳糖酶诱导物，也不产生乳糖酶，而生
21、长旺盛时期，若加入乳糖酶诱导物，也不产生乳糖酶，而是在葡萄糖利用完后才产生。是在葡萄糖利用完后才产生。方法：将菌在含有葡萄糖和以组氨酸为唯一氮源的培养基连续方法：将菌在含有葡萄糖和以组氨酸为唯一氮源的培养基连续传代。传代。筛选氨基酸结构类似物抗性突变株筛选氨基酸结构类似物抗性突变株 许多抗生素和氨基酸有共同的前体许多抗生素和氨基酸有共同的前体第32页，讲稿共60张，创作于星期三筛选二价金属离子抗性突变株筛选二价金属离子抗性突变株 二价金属离子可与产物或其中间体结合，抑制产物合二价金属离子可与产物或其中间体结合，抑制产物合成成筛选前体或前体结构类似物抗性突变株筛选前体或前体结构类似物抗性突变株
22、前体或前体结构类似物对菌体的生长和抗生素的前体或前体结构类似物对菌体的生长和抗生素的生物合成有抑制作用生物合成有抑制作用筛选自身所产抗生素抗性突变株筛选自身所产抗生素抗性突变株第33页，讲稿共60张，创作于星期三第四节第四节 杂交育种杂交育种 4.1 定义定义 将两个基因型不同的菌株经吻合或接合使遗传物质重新组合，从将两个基因型不同的菌株经吻合或接合使遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株。中分离和筛选具有新性状的菌株。4.2 举例举例 一株大肠杆菌一株大肠杆菌A-B+Lac-SMrT1s 另一株大肠杆菌另一株大肠杆菌A+B-Lac+SMsT1r 混合培养后，长出少数菌落。混合培养后
23、，长出少数菌落。第34页，讲稿共60张，创作于星期三4.2.1 细菌杂交细菌杂交 在细菌中实现杂交的种类尚不多，主要是大肠杆菌，其他在细菌中实现杂交的种类尚不多，主要是大肠杆菌，其他还有鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、淋病奈氏球菌等。还有鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、淋病奈氏球菌等。大肠杆菌中存着大肠杆菌中存着致育因子致育因子F，有，有F因子为因子为F+，没有，没有F因子因子称称F-。整合状态为。整合状态为Hfr。F因子有明显的感染性，大肠杆菌的接合，实质上是因子有明显的感染性，大肠杆菌的接合，实质上是F因因子的转移，所以子的转移，所以F+和和Hfr称供体菌，而称供体菌，而F-称受体菌。称受体菌
24、。第35页，讲稿共60张，创作于星期三4.2.2 酵母杂交育种技术酵母杂交育种技术 酵母繁殖方式：酵母繁殖方式：酵母为单细胞型真菌，一般以酵母为单细胞型真菌，一般以出芽方式生殖出芽方式生殖，在通，在通常情况下，常情况下，繁殖体为双倍体繁殖体为双倍体，但经过特定条件的诱导，可使，但经过特定条件的诱导，可使其产生单倍体孢子并可出芽产生单倍体繁殖体。其产生单倍体孢子并可出芽产生单倍体繁殖体。单倍体细胞具单倍体细胞具及及2两种交配型。两种交配型细胞经两种交配型。两种交配型细胞经其细胞壁上特定的凝聚因子诱导而进行交配，恢复为双其细胞壁上特定的凝聚因子诱导而进行交配，恢复为双倍体；同一交配型细胞之间，则因
25、细胞壁上凝集因子的倍体；同一交配型细胞之间，则因细胞壁上凝集因子的存在而存在而不能进行交配不能进行交配。在生活过程中，酵母细胞还可以形成三倍体、四在生活过程中，酵母细胞还可以形成三倍体、四倍体、多倍体或非整倍体细胞。倍体、多倍体或非整倍体细胞。第36页，讲稿共60张，创作于星期三 一般而言，杂交育种一般而言，杂交育种运用了酵母的单双倍生活周期运用了酵母的单双倍生活周期，将不同基因型和相对的交配型的单倍体细胞经诱导杂交而形成二将不同基因型和相对的交配型的单倍体细胞经诱导杂交而形成二倍体细胞，经筛选便可获得新的遗传性状。倍体细胞，经筛选便可获得新的遗传性状。第37页，讲稿共60张，创作于星期三第五
26、节第五节 原生质体技术原生质体技术 菌体经溶菌酶处理后，去掉了细胞壁，露出球形且特菌体经溶菌酶处理后，去掉了细胞壁，露出球形且特别脆弱的原生质体。它对渗透压、振荡、离心等十分敏感。别脆弱的原生质体。它对渗透压、振荡、离心等十分敏感。但由于原生质体结构与生理活性均未发生改变，故在但由于原生质体结构与生理活性均未发生改变，故在适宜的条件下，可以适宜的条件下，可以再生出细胞壁再生出细胞壁进行细胞分裂。进行细胞分裂。第38页，讲稿共60张，创作于星期三原生质体制备和再生的过程原生质体制备和再生的过程 培养菌丝培养菌丝(细胞细胞)洗涤菌丝洗涤菌丝溶菌酶处理菌丝溶菌酶处理菌丝 形成原生质体、离心形成原生质
27、体、离心 用高渗溶液洗涤原生质体用高渗溶液洗涤原生质体过滤过滤显微计数原生质体显微计数原生质体原生质体融合原生质体融合 原生质体再生原生质体再生融合子的选择融合子的选择第39页，讲稿共60张，创作于星期三第六节第六节 分子育种分子育种6.1 提高次级代谢产物的产量提高次级代谢产物的产量基因工程技术提高抗生素产量的主要手段基因工程技术提高抗生素产量的主要手段1.增加限速酶的基因拷贝数增加限速酶的基因拷贝数2.增加正调节基因增加正调节基因,去除负调节基因去除负调节基因3.增加抗性基因的拷贝数增加抗性基因的拷贝数第40页，讲稿共60张，创作于星期三6.1.1 增加限速酶的基因拷贝数增加限速酶的基因拷
28、贝数原理：原理：Ea Eb Ec Ed A B C D E(代代谢产谢产物）物）限速限速酶酶 Rate-limiting enzyme(Bottleneck)例例1:起始原料起始原料 Ea Eb Ec -aminoadipic acid ACV三三肽肽 异青霉素异青霉素N 青霉素青霉素 L-cysteine L-valine Ea:ACV合成合成酶酶（限速（限速酶酶）Eb:异青霉素异青霉素N合成合成酶酶 Ec:异青霉素异青霉素N酰酰基水解基水解酶酶 第41页，讲稿共60张，创作于星期三例例2.头孢菌素头孢菌素C生物合成的限速酶生物合成的限速酶 在头孢菌素在头孢菌素C C 的工业发酵生产中，人们
29、发现发酵结束后在得到的工业发酵生产中，人们发现发酵结束后在得到的发酵液中，除了主要产物是头孢菌素的发酵液中，除了主要产物是头孢菌素C C外，在发酵液中还积累另一外，在发酵液中还积累另一种产物种产物-青霉素青霉素N N。问题：积累中间产物问题：积累中间产物-青霉素青霉素N N 原因：下一步反应为限速酶反应原因：下一步反应为限速酶反应 解决：导入额外的扩环酶解决：导入额外的扩环酶/羟化酶基因羟化酶基因 结果：使头孢菌素结果：使头孢菌素C C的产量提高的产量提高 25-50%25-50%，积累的青霉素积累的青霉素N N消失。消失。第42页，讲稿共60张，创作于星期三例例3：十一烷基灵菌红素十一烷基灵
30、菌红素 产生菌产生菌:天蓝色链霉菌天蓝色链霉菌 S.colicolorA3(2)acetyl CoA polyketide pathway 氧甲基转移酶氧甲基转移酶S-腺苷甲硫氨酸构建重组质粒构建重组质粒(带甲氧基转移酶带甲氧基转移酶)转化到氧甲基转移酶缺陷变株转化到氧甲基转移酶缺陷变株 转化菌株转化菌株十一烷基灵菌红素十一烷基灵菌红素产量提高产量提高5倍倍第43页，讲稿共60张，创作于星期三6.1.2 增加正调节基因增加正调节基因,去除负调节基因去除负调节基因 调节基因根据其作用的不同分为调节基因根据其作用的不同分为正调节和负调节正调节和负调节。正调正调节促进生物合成结构基因的转录，负调节阻
31、扼结构基因的转录。节促进生物合成结构基因的转录，负调节阻扼结构基因的转录。第44页，讲稿共60张，创作于星期三 次级代谢产物生物合成基因簇内的正负调节基因次级代谢产物生物合成基因簇内的正负调节基因 基因基因 效应效应 菌株菌株 次级代谢产物次级代谢产物 功功 能能 brpA 正 吸水链霉菌 Bialaphos 激活bar(Bialaphos 抗性)基因和 6个bap(生物合成)基因的转录 tylG 正 弗氏链霉菌 泰洛星 激活tyl F(编码 MOMT)和其它 tyl 生物合成基因的表达 actII 正 天蓝色链霉菌 放线紫红素 能使act菌株放线紫红素的产 量增加30 40倍 mmy 负 天
32、蓝色链霉菌 次甲霉素 该基因的插入失活导致次甲霉 素过量生产 strR 正 灰色链霉菌 链霉素 调节链霉素的生物合成 .第45页，讲稿共60张，创作于星期三去除负调节基因使结构基因超量表达去除负调节基因使结构基因超量表达Methylenomycin（次甲霉素）次甲霉素是由天蓝色链霉菌产生的抗生素，研究结果表明，次甲霉素是由天蓝色链霉菌携带的质粒SCP I 编码的。在其生物合成结构基因的上游，存在一个负调节基因-mmy。克隆到质粒上 转化变青链霉菌 转化子 （次甲霉素高产表达）mmy第46页，讲稿共60张，创作于星期三6.1.3 增加抗性基因的拷贝数增加抗性基因的拷贝数 抗性基因的作用是避免抗生
33、素产生菌被自身产生的代谢产抗性基因的作用是避免抗生素产生菌被自身产生的代谢产物所杀灭。物所杀灭。其作用可通过三条途径实现：其作用可通过三条途径实现：抗性基因产物抗性基因产物(酶酶)将抗生素作用的底物加以修饰将抗生素作用的底物加以修饰;将抗生素的分子结构加以修饰将抗生素的分子结构加以修饰,使其失活使其失活;将抗生素分子排出细胞外。将抗生素分子排出细胞外。第47页，讲稿共60张，创作于星期三例例1.Davies J.利用链霉菌质粒利用链霉菌质粒pIJ702 从卡那霉素产生菌克隆了从卡那霉素产生菌克隆了6-N-氨基糖苷乙酰转移酶氨基糖苷乙酰转移酶AAC6的基因的基因(aacA),该基因产物在乙该基因
34、产物在乙酰辅酶酰辅酶A的存在下的存在下,可将氨基糖苷类抗生素的氨基糖可将氨基糖苷类抗生素的氨基糖6乙酰化。将乙酰化。将aacA基因转入新霉素和卡那霉素的产生菌中基因转入新霉素和卡那霉素的产生菌中,结果显著提高了结果显著提高了抗生素的产量抗生素的产量.转化 转化子-链霉菌细胞 氨基糖苷类抗生素产量提高第48页，讲稿共60张，创作于星期三卡那霉素卡那霉素6-乙酰转移酶乙酰转移酶AAC（6）的作用的作用第49页，讲稿共60张，创作于星期三例例2.螺旋霉素抗性基因螺旋霉素抗性基因srmB 重组质粒重组质粒 转化转化 S.ambofaciens（生二素链霉菌）（生二素链霉菌）转化子转化子 使螺旋霉素产量
35、提高。使螺旋霉素产量提高。第50页，讲稿共60张，创作于星期三6.2 改进代谢产物的组分改进代谢产物的组分 链霉菌产生的次级代谢产物常常是一组结构相似的混合物。每链霉菌产生的次级代谢产物常常是一组结构相似的混合物。每个化合物称为它的个化合物称为它的一个组分一个组分。多组分产生的分子基础是。多组分产生的分子基础是因为次因为次级代谢产物的合成酶对底物的选择性不强以及合成途径中分支途径级代谢产物的合成酶对底物的选择性不强以及合成途径中分支途径的存在的存在。通过基因工程手段，灭活某分支途径的酶，就可以去除通过基因工程手段，灭活某分支途径的酶，就可以去除该分支途径的产物。此策略常用来去除发酵产物中的无用
36、组分，该分支途径的产物。此策略常用来去除发酵产物中的无用组分，提高有用组分的含量。提高有用组分的含量。第51页，讲稿共60张，创作于星期三 只产只产Avermectin“2”组分基因工程菌的构建组分基因工程菌的构建 aveC 脱水酶阿维菌素“2”组分阿维菌素“1”组分第52页，讲稿共60张，创作于星期三aveC基基因在染色因在染色体上的位体上的位置置第53页，讲稿共60张，创作于星期三重组质粒的构建重组质粒的构建 第54页，讲稿共60张，创作于星期三 pC04 Bgl II p pC05 图1-8 质粒pC05的构建过程 Fig.1-8 The procedures in the constr
37、uction of plasmid pC05 pC03 Ligase 第55页，讲稿共60张，创作于星期三重组质粒的转化重组质粒的转化转化阿维菌素产生菌tsrR amRtsrR amR第56页，讲稿共60张，创作于星期三Gene replacement(基因置换）基因置换）DBB C am CaveCaveCam tsrR amR aveC+tsrS amR aveC第57页，讲稿共60张，创作于星期三遗传型的改变遗传型的改变 B amaveCamaveC tsrR amR aveC tsrS amR aveC 传几代后，丢掉质粒 基因工程菌AveC9第58页，讲稿共60张，创作于星期三基因工程菌基因工程菌AveC-9发酵产物的发酵产物的HPLC分析分析 control 基因 工程 菌AveC9 B2a A2a B1a A1a B2a A2a 第59页，讲稿共60张，创作于星期三感谢大家观看第60页，讲稿共60张，创作于星期三