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1、关于蛋白质杂交技术第1页，讲稿共29张，创作于星期三检测检测DNA可用可用Southern印迹法印迹法检测检测RNA可用可用Northern印迹法印迹法检检 测测 蛋蛋 白白 质质 同同 样样 有有 蛋蛋 白白 质质 印印 迹迹 法法（Western印迹法印迹法）蛋蛋白白质质印印迹迹是是将将蛋蛋白白质质转转移移到到固固相相支支持持物物上上，然然后后利利用用抗抗体体与与附附着着于于固固相相支支持持物物上上的靶蛋白发生的靶蛋白发生特异性的抗原抗体结合反应特异性的抗原抗体结合反应第2页，讲稿共29张，创作于星期三待待测测样样品品经经过过SDS聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳（SDS-PAGE）被
2、被转转移移到到固固相相支支持持物物上上，固固相相支支持持物物以以非非共共价键的形式吸附蛋白质价键的形式吸附蛋白质以以固固相相支支持持物物上上的的蛋蛋白白质质为为抗抗原原，与与对对应应的的抗体抗体发生特异性的抗原抗体结合反应发生特异性的抗原抗体结合反应与与酶或同位素标记的第二抗体酶或同位素标记的第二抗体发生反应发生反应经经过过底底物物显显色色或或放放射射自自显显影影，以以检检测测电电泳泳分分离离的靶蛋白。的靶蛋白。一、原理一、原理第3页，讲稿共29张，创作于星期三Western印迹有印迹有SDS-PAGE的高分辨力的高分辨力固固相相免免疫疫测测定定的的高高特特异异性性和和敏敏感感性性，可可测测出
3、出1ng5ng中等大小的蛋白质。中等大小的蛋白质。由由于于蛋蛋白白质质的的电电泳泳分分离离几几乎乎总总是是在在变变性性的的条条件件下下进进行行，因因此此，不不存存在在溶溶解解、聚聚集集以以及及靶蛋白与外来蛋白的共沉淀等问题。靶蛋白与外来蛋白的共沉淀等问题。还还具具有有简简便便、标标本本可可长长期期保保存存、结结果果便便于于比比较等优点。较等优点。第4页，讲稿共29张，创作于星期三（一）蛋白提取试剂（一）蛋白提取试剂 1细胞裂解液细胞裂解液 20mmol/L Tris(pH 7.5)150mmol/L NaCl 1%Triton X-100焦磷酸钠，焦磷酸钠，-磷酸甘油，磷酸甘油，EDTA，正钒
4、酸钠，正钒酸钠(Na3VO4)亮抑肽素等亮抑肽素等多种蛋白酶抑制剂多种蛋白酶抑制剂二、试剂二、试剂第5页，讲稿共29张，创作于星期三2蛋白蛋白上样缓冲液上样缓冲液100mmol/L TrisCl(pH 6.8)200mmol/L二硫苏糖醇（二硫苏糖醇（DTT）4%SDS(十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠)0.2%溴酚蓝溴酚蓝20%甘油甘油第6页，讲稿共29张，创作于星期三（二）（二）SDS-PAGE试剂试剂130%丙烯酰胺溶液丙烯酰胺溶液 丙烯酰胺丙烯酰胺30g、双丙烯、双丙烯酰胺酰胺0.8g，溶于，溶于100ml水中，过滤后贮于褐色瓶水中，过滤后贮于褐色瓶中低温保存，可用一个月。中低温保存，可用
5、一个月。2Tris缓冲液缓冲液（1）1.5mol/L Tris(pH8.8)/积层胶缓冲液：积层胶缓冲液：Tris碱碱 18.17g，用，用HCl调调pH8.8，加水至，加水至100ml。（2）1.0mol/L Tris(pH6.8)分离胶缓冲液：分离胶缓冲液：Tris碱碱 12.11g，用，用HCl调调pH6.8，加水至，加水至100ml。第7页，讲稿共29张，创作于星期三310%SDS 可用去离子水配成贮存液保可用去离子水配成贮存液保存于室温。存于室温。410%过硫酸胺过硫酸胺 过硫酸胺提供丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合过硫酸胺提供丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的所必需的自由基自由基。可用去离子
6、水配制小量的贮存液并保存于可用去离子水配制小量的贮存液并保存于4冰箱中冰箱中。由于过硫酸胺会缓慢分解，故应由于过硫酸胺会缓慢分解，故应隔周重新隔周重新配制配制。第8页，讲稿共29张，创作于星期三5TEMED（N,N,N,N四甲基乙二胺）四甲基乙二胺）通通过过催化过硫酸胺形成自由基催化过硫酸胺形成自由基而加速丙烯酰胺与而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。双丙烯酰胺的聚合。6Tris-甘氨酸电泳缓冲液甘氨酸电泳缓冲液 配成配成10贮存液备用，在贮存液备用，在900ml去离子水中去离子水中溶解溶解30g Tris碱和碱和144g甘氨酸，然后加入甘氨酸，然后加入10g SDS，用，用HCl调调pH至至8
7、.3，用去离子水补至，用去离子水补至1000ml。使用前用使用前用去离子水稀释成去离子水稀释成1应用液应用液。第9页，讲稿共29张，创作于星期三（三）转膜缓冲液（三）转膜缓冲液 39mmol/L 甘氨酸甘氨酸 48mmol/L Tris碱碱 0.037%SDS 20%甲醇甲醇第10页，讲稿共29张，创作于星期三（四）染色液与脱色液（四）染色液与脱色液1考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250染液染液 100mg考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250溶于溶于40ml 乙醇，加乙醇，加10ml冰醋酸，补水至冰醋酸，补水至100ml。2考马斯亮蓝脱色液考马斯亮蓝脱色液 40ml 乙醇，加乙醇，加10ml冰冰醋酸，补水至醋
8、酸，补水至100ml。3丽春红丽春红S贮存液贮存液 2g丽春红丽春红S，30g三氯乙酸，三氯乙酸，30g磺基水杨酸，加水至磺基水杨酸，加水至100ml。使用时，将使用时，将1份上述贮存液加份上述贮存液加9份去离子水即为份去离子水即为丽春红丽春红S应用液，使用后应废弃。应用液，使用后应废弃。第11页，讲稿共29张，创作于星期三（五）封闭液（五）封闭液5脱脂奶粉脱脂奶粉0.01%防沫剂防沫剂A0.02%叠氮钠叠氮钠溶于磷酸盐缓冲液（溶于磷酸盐缓冲液（PBS）第12页，讲稿共29张，创作于星期三（一）样品前处理（一）样品前处理细菌细菌一般直接用蛋白上样缓冲液裂解；一般直接用蛋白上样缓冲液裂解；真核细
9、胞或哺乳动物组织通常真核细胞或哺乳动物组织通常加细胞裂解液，机加细胞裂解液，机械或超声波械或超声波室温匀浆室温匀浆0.5min1min。4 10,000g13,000g离心离心5min，取上清取上清按照每按照每4l蛋白样品加入蛋白样品加入1l 5蛋白上样缓冲蛋白上样缓冲液的比例混合。液的比例混合。100水浴加热水浴加热3min5min，以，以充分充分变性蛋白变性蛋白。冷却到室温，冷却到室温，上样到上样到SDS-PAGE胶加样孔胶加样孔三、实验方法三、实验方法第13页，讲稿共29张，创作于星期三原原理理是是根根据据大大多多数数蛋蛋白白质质都都能能与与阳阳离离子子表表面面活性剂活性剂SDS按重量比
10、结合成复合物按重量比结合成复合物使使蛋蛋白白质质复复合合物物所所带带的的负负电电荷荷远远远远超超过过天天然然蛋蛋白白质质分分子子所所带带的的负负电电荷荷，消消除除了了不不同同蛋蛋白质分子的电荷效应白质分子的电荷效应蛋蛋白白质质分分子子的的迁迁移移速速率率完完全全取取决决于于分分子子量量的的大大小小，从从而而达达到到了了分分离离不不同同分分子子量量大大小小蛋蛋白白质的目的质的目的（二）（二）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳第14页，讲稿共29张，创作于星期三胶胶有有效效分分离离范范围围取取决决于于用用于于灌灌胶胶的的聚聚丙丙烯烯酰胺的酰胺的浓度和交联度浓度和交联度。经经双双丙丙烯烯酰酰
11、胺胺交交联联后后丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶的的刚刚性性和和抗抗张张强强度度都都有有所所增增加加，形形成成的的小小孔孔必必须能够允许须能够允许SDS蛋白复合物通过蛋白复合物通过这这些些小小孔孔的的孔孔径径随随双双丙丙烯烯酰酰胺胺、丙丙烯烯酰酰胺胺比比率率的的增增加加而而变变小小，比比率率接接近近1:20时时孔孔径径达达到到最最小小值值。一一般般按按双双丙丙稀稀酰酰胺胺、丙丙烯烯酰酰胺胺为为1:29配制配制第15页，讲稿共29张，创作于星期三表表1 SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围 丙烯酰胺浓度丙烯酰胺浓度（）（）线性分离范围线性分离范围（kD）151243101668
12、7.53694557212第16页，讲稿共29张，创作于星期三1SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制聚丙烯酰胺凝胶的灌制（1）安装玻璃板安装玻璃板（2）确定凝胶溶液体积，按所需丙烯酰胺）确定凝胶溶液体积，按所需丙烯酰胺浓度配制一定体积的分离胶溶液浓度配制一定体积的分离胶溶液。依次混合各成分（见下表）一旦加入一旦加入TEMED，马上开始聚合，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作 第17页，讲稿共29张，创作于星期三表表2 积层胶、分离胶所需溶液成分的配比积层胶、分离胶所需溶液成分的配比溶液成分溶液成分（ml）5%积层积层胶胶不同浓度的分离胶不同浓度的分离胶6%8%10%12%15%水水3.4
13、5.34.64.03.32.330%丙稀酰胺丙稀酰胺0.832.02.73.34.05.01.5mol/L Tris(pH8.8)2.52.52.52.52.51.0mol/L Tris(pH6.8)0.6310%SDS0.050.10.10.10.10.110%过硫酸胺过硫酸胺0.050.10.10.10.10.1TEMED0.0050.0080.006 0.0040.0040.004总体积（总体积（ml）51010101010第18页，讲稿共29张，创作于星期三（3）迅速在两板的间隙）迅速在两板的间隙灌注丙烯酰胺溶液，灌注丙烯酰胺溶液，留出积层胶所需空间留出积层胶所需空间（梳子的齿长再加（
14、梳子的齿长再加1cm）。然后小心的在丙烯酰胺溶液上）。然后小心的在丙烯酰胺溶液上加一层去加一层去离子水离子水。凝胶垂直放置于室温下。凝胶垂直放置于室温下。（4）分离胶聚合完全后（约）分离胶聚合完全后（约30min），倾斜），倾斜倒出覆盖的去离子水。倒出覆盖的去离子水。（5）配制）配制5%积层胶积层胶。第19页，讲稿共29张，创作于星期三（6）在已聚合的分离胶上直接）在已聚合的分离胶上直接灌注积层胶灌注积层胶，立即在积层胶溶液中立即在积层胶溶液中插入干净的梳子。小心插入干净的梳子。小心避免混入气泡。避免混入气泡。（7）积层胶聚合完全后（约）积层胶聚合完全后（约30min），小心），小心移出梳子。
15、将凝胶固定于电泳装置上，上、下移出梳子。将凝胶固定于电泳装置上，上、下槽各加入槽各加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。必须设法甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。第20页，讲稿共29张，创作于星期三2上样和电泳上样和电泳 取取一一定定量量样样品品与与上上样样缓缓冲冲液液混混合合后后，加加入入上上样样孔。孔。将将电电泳泳槽槽与与电电源源连连接接（正正极极应应接接下下槽槽），凝凝胶胶上上所所加加的的电电压压为为8伏伏/cm。当当上上样样缓缓冲冲液液中中的的染染料料前前沿沿进进入入分分离离胶胶后后，把把电电压压提提高高到到15伏伏/cm，继继续续电电
16、泳泳直直至至溴溴酚酚蓝蓝到到达达分分离离胶胶底底部部（约约4h），然后关闭电源。然后关闭电源。从从电电泳泳装装置置上上卸卸下下玻玻璃璃板板，用用刮刮勺勺撬撬开开玻玻璃璃板板，取下凝胶取下凝胶。第21页，讲稿共29张，创作于星期三3考马斯亮蓝对考马斯亮蓝对SDS凝胶进行染色凝胶进行染色 考马斯亮蓝染色的主要目的包括：考马斯亮蓝染色的主要目的包括：显显示示靶靶蛋蛋白白在在凝凝胶胶中中的的粗粗略略位位置置，从从而而切切去去不不含含靶靶蛋蛋白白的的凝凝胶胶，这这样样可可以以节节省省硝硝酸酸纤纤维素膜；维素膜；转膜后，凝胶染色可转膜后，凝胶染色可判断蛋白质转膜是否完全判断蛋白质转膜是否完全。第22页，讲
17、稿共29张，创作于星期三Western印迹的固相支持体有多种：印迹的固相支持体有多种：重氮苯硫醚重氮苯硫醚（diazophenylthio,DPT）纸纸重氮苄氧甲基重氮苄氧甲基（diazobenzyloxymethyl,DBM）纸纸溴化氰活化纸溴化氰活化纸氰尿酰氯纸氰尿酰氯纸活化尼龙膜活化尼龙膜目前最常用的是目前最常用的是硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜（三）蛋白质从凝胶转移至固相支持体（三）蛋白质从凝胶转移至固相支持体第23页，讲稿共29张，创作于星期三蛋白质从凝胶转移至硝酸纤维素滤膜上：蛋白质从凝胶转移至硝酸纤维素滤膜上：凝凝胶胶及及与与之之相相贴贴的的硝硝酸酸纤纤维维素素滤滤膜膜夹夹于于事事
18、先先用用转转膜膜缓缓冲冲液液浸浸泡泡过过的的Whatman 3MM滤滤纸纸之间之间然然后后把把结结合合体体夹夹在在石石墨墨电电极极板板之之间间，硝硝酸酸纤纤维维素滤膜朝阳极素滤膜朝阳极一侧一侧蛋蛋白白质质转转移移可可用用于于室室温温进进行行，1.5h2h便便可可完成。完成。第24页，讲稿共29张，创作于星期三对硝酸纤维素膜上的蛋白进行染色对硝酸纤维素膜上的蛋白进行染色判断转膜是否完全判断转膜是否完全可可供供硝硝酸酸纤纤维维素素滤滤膜膜上上的的蛋蛋白白质质进进行行染染色色的的方方法法有有很很多多种种，但但只只有有丽丽春春红红S染染色色法法可可与与免免疫疫学学检检测测方方法法兼兼容容，这这是是因因
19、为为该该染染料料只只会会短短暂暂显色而且在进行显色而且在进行Western印迹时被洗去。印迹时被洗去。第25页，讲稿共29张，创作于星期三1封闭滤膜的蛋白结合位点：在加入一抗封闭滤膜的蛋白结合位点：在加入一抗之前，之前，必须封闭可能结合的位点必须封闭可能结合的位点以降低这类非以降低这类非特异性结合的背景。特异性结合的背景。封闭液常用封闭液常用脱脂奶粉脱脂奶粉将硝酸纤维素滤膜放入自封袋中，根据滤膜将硝酸纤维素滤膜放入自封袋中，根据滤膜面积以面积以0.1ml/cm2的量加入封闭液的量加入封闭液尽可能尽可能排除里面的气泡排除里面的气泡，然后封闭袋口，平放，然后封闭袋口，平放在平缓的在平缓的摇床平台上
20、室温温育摇床平台上室温温育1h2hPBS漂洗滤膜漂洗滤膜3次次，每次，每次10min。（四）抗原抗体反应（四）抗原抗体反应第26页，讲稿共29张，创作于星期三2第一抗体和靶蛋白的结合第一抗体和靶蛋白的结合 将抗体以适当的将抗体以适当的比例稀释比例稀释室温反应室温反应1h2hPBS漂洗漂洗滤膜滤膜3次，每次次，每次10min3加入第二抗体加入第二抗体 加入适当加入适当稀释的二抗稀释的二抗室温反应室温反应1h2hPBS漂洗漂洗滤膜滤膜3次，每次次，每次10min第27页，讲稿共29张，创作于星期三4显色显色第二抗体通常是抗免疫球蛋白抗体或第二抗体通常是抗免疫球蛋白抗体或A蛋白蛋白可用可用125I进行放射性标记进行放射性标记也可与也可与辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶共价偶联共价偶联与与碱性磷酸酶碱性磷酸酶共价偶联共价偶联由由于于放放射射性性标标记记过过程程有有时时可可导导致致抗抗体体失失活活，因此更倾向于使用酶联标记的抗体。因此更倾向于使用酶联标记的抗体。第28页，讲稿共29张，创作于星期三感感谢谢大大家家观观看看第29页，讲稿共29张，创作于星期三