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1、第二节 原代细胞培养,一、动物细胞原代培养,哺乳动物细胞结构极为精密复杂、性质脆嫩，对生活环境要求非常严格，比植物细胞和微生物细胞要难培养得多。 对动物细胞原代培养的关键主要集中在培养组织的选择、培养基的选择与优化、培养条件的优化、添加物（包括营养成分与生长因子等）的筛选等几个方面。,（一）最适培养组织的筛选,作为组织来源的动物个体，一定要健康无毒。 组织来源的动物越年轻，其细胞保持有较强的分裂能力，细胞培养成功的可能性就越大。,（二）最佳培养基的选择与优化,必须确定细胞培养的最适营养液，主要包括培养基的成分、类型及所需补充的营养成分。,RPMI 1640MEMDMEMM199 F-12ACM
2、L-15GIM DMTC-100,1. 常用的培养基：,2. 培养用血清的选择,无血清培养,3.其它补充营养成分的选择,除补充血清外，还要包括碳水化合物、氨基酸、维生素和生长因子等。 许多学者的研究表明，适量的葡萄糖、氨基酸、维生素C、巯基乙醇等对动物细胞的培养也是必需的。,（一）取材的基本要求 (1) 取材要注意新鲜和保鲜 (2) 应严格无菌 (3) 防止机械损伤 (4) 去除无用组织和避免干燥 (5) 应注意组织类型、分化程度、年龄等 (6) 作好记录,二 原代细胞的取材,（二）实体组织材料的分离方法 对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机
3、械分散法（物理裂解）和消化分离法。 1.机械分散法 特点:简便、快速,但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差,适用于处理纤维成分少的软组织。,2 消化分离法 原 理 ： 组织消化法是把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。,（1）酶消化分离法 酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶 胰蛋白酶分散原理：主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水
4、解而使细胞分散开。 影响胰蛋白酶作用的主要因素: 细胞类型;酶的活力;酶的浓度;温度;pH; 无机盐离子;消化时间。 胶原酶消化法 适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用。,表2-1 胰蛋白酶和胶原酶在不同温度下消化各种组织小块 时所需时间（小时）（0.5-1cm3）,（2）非酶消化法（ EDTA 消化法） EDTA是一种非酶消化物。常用不含钙、镁离子的PBS配成0.02%的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好，该化学物质能与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离。,1）胰蛋白酶（胰酶）广泛用于组织
5、和单层细胞的解离。将贴壁细胞从培养板上消化水解下来制备单细胞悬液，常用的工作浓度是0.25-5%（w/v）。2）分散酶常用于从不同的组织或器官分离单细胞，并用于后续细胞培养，如原代细胞的分离，细胞传代等。与其他细胞生物学常用蛋白酶（如胰蛋白酶、胶原酶、链霉蛋白酶等）相比，该酶具有以下优势：1）一种快速有效且温和的细胞消化酶，对细胞损伤小，且能维持细胞膜完整性；2）来源于细菌，无支原体或其他动物病毒污染；3）稳定性强，不受温度、pH及血清组分的影响；4）可用于多种类型组织和细胞的分离等,3）ACCUTASE 细胞消化液包含有蛋白水解酶和胶原酶活性，是胰酶/EDTA消化液的完美替换产品，用于从常规
6、组织培养器皿和粘附培养器皿中消化细胞。与传统的胰酶消化液相比，本品具有以下优势：1）适用于绝大多数原代细胞和哺乳动物细胞系的消化，以及昆虫细胞；2）温和有效的消化干细胞（hESCs和mESCs），冻存后细胞具更高复苏率；3）几分钟内实现粘附细胞的分离，不需清洗或中和反应，节省细胞传代时间；4）对细胞消化较为温和，能增加细胞产量和存活率；增强细胞贴壁效率；改善细胞形态和细胞生长特性等。,（3）消化分离法的操作步骤,（4）消化分离法的注意事项 组织块必须漂洗2-3次以除去组织中的钙、镁离子和血清对胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。 胰蛋白浓度不宜过高，作用时间不能太长，以避免毒性作用。 消化后组织不仅
7、要尽量弃去消化液，以避免毒性产生，而且动作要轻，以避免膨松的细胞随漂洗而丢失。,（三）原代细胞的培养方法 1.组织块培养法 组织块培养是常用、简便易行和成功率较的原代培 养方法。 其基本方法是将剪成的小组织团块接种于培养瓶 （或皿）中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组 织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长。,2. 消化培养法,3.悬浮细胞培养法 对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、 骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消 化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞 分层液分离后接种培养。,三 原代细胞和传代的培养和维持,1.原代细胞的维持 贴壁细胞长成网状或基本单层时
8、，未达到饱和密度，需采 取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要。 换入等量完全培养基或换成含2%小牛血清的维持液。悬浮 细胞培养基中不仅会发生转化而且会发生分裂繁殖，此时培 养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求，需进行换液。 通常采用半量换液的方法。,(2) 原代细胞培养的首次传代 原代培养后由于悬浮细胞增殖，数量增加甚至达 饱和密度；贴壁细胞的相互汇合，使整个瓶底逐渐被 细胞覆盖，细胞难以继续生长繁殖，需要进行分瓶培 养传代。,(3)传代细胞的传代培养 传代细胞，可根据不同细胞采取不同的方法进行细胞传代。 贴壁生长的细胞用消化法传代，部分贴壁的细胞用直接吹打传代。 悬浮细胞
9、可采用加入等量新鲜培养基后直接吹打分散进行传代，或用自然沉降法加入新培养基后再吹打分散进行传代。,(4)传代细胞的建系和维持 细胞系的维持通过换液传代再换液、再传代和细胞 种子冻存来实现。对每一个细胞系来说都有其自身的 特点，要做好建系的维持必须记录好细胞档案,换液传 代和做好细胞系（或株）的鉴定和管理工作。,5 原代细胞的纯化和克隆 （1）细胞的纯化 细胞的纯化分为: 1. 自然纯化：长期传代过程中靠自然淘汰法，不断 排挤其他生长慢的细胞，最后留下生长优势旺的细 胞，达到细胞纯化的目的。如肿瘤突变细胞通过此 方法建立细胞系。 2. 人工纯化：利用人为手段造成某一细胞生长有利 的环境条件，抑制
10、其他细胞的生长从而达到纯化细 胞的目的。,人工纯化主要有以下5种方法 （1）细胞因子依赖纯化法：通过加入某些特殊的细胞因子而纯化出只依赖于这种细胞因子生长的细胞系。 （2）酶消化法：利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，使两者分开，达到纯化的目的。另外对贴壁细胞与半贴壁及粘附细胞间的分离纯化也是十分有效的。 例1：上皮细胞与成纤维细胞的分离纯化 例2：骨髓基质肌样细胞的纯化,（3）机械刮除法 （4）反复贴壁法 （5）电烙筛选法,（二）细胞的克隆化 细胞克隆技术又称单个细胞分离培养技术，即从细胞群体 中分离出一个细胞，并使其在体外培养体系中能繁殖成新的 细胞群体，这种由单个细胞所形成的
11、细胞群（或集落）称为 一个克隆，这种纯化后的细胞群体称为细胞株。,细胞克隆法,1.毛细管克隆法 2.有限稀释克隆法 3.平皿克隆分离法 4.软琼脂克隆分离法 5.单细胞显微克隆法,集落（克隆）计数：在倒置显微镜下观察并计数直径 大于75m或含有50个细胞以上的克隆。,体外培养细胞的转化,一 基本概念和原理 （一）细胞转化的基本概念 细胞转化是细胞发生遗传性改变而导致细胞永生化的转变方式，由限定性细胞系转变成连续性传代细胞系，获得了永生化。 （二）细胞转化与恶变的区别 转化：只是遗传特性、生长特性、生物学性状改变，但无致瘤性 恶变：是细胞癌性变，有致瘤性,(三) 细胞转化的方式 细胞自发转化：体
12、外培养的细胞在无任 何诱变剂存在的条件下，细胞自发出现的转 化现象。 人工诱发转化(人工诱变)：在体外培养的 细胞中，常因化学、物理和生物等各种致癌 因素的影响，而使细胞发生转化，转化周期 大大缩短，转化率高。,二 诱变因素的选择 1. 要根据体外培养的细胞而定，这可能与细胞对某种诱变剂的敏感及其特异受体的存在有关，因此，实验时要根据细胞特性来选择合适的诱变剂。 2. 人胃上皮细胞适宜用SV40病毒转化； 3. 人淋巴细胞适宜用EB病毒转化； 4. 地鼠肾细胞适宜用多发病病毒(Polioma)转化； 5. C3H小鼠胚纤维细胞适宜化学致癌物转化。,复习题,细胞转化、细胞克隆 原代单细胞培养方法及注意事项 细胞纯化的方法 细胞克隆的方法 细胞转化的方法,