《动物细胞工程第四节 培养细胞的观察 检测方法课件 高中生物竞赛.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《动物细胞工程第四节 培养细胞的观察 检测方法课件 高中生物竞赛.ppt（55页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、第四节培养细胞的观察检测方法,活细胞的观察检测方法 培养细胞常用的染色方法 细胞生长状况有关指标的检测方法 细胞生物活性的有关化学检测方法 电子显微镜技术 流式细胞术,一、活细胞的观察检测方法,肉眼观察 相差显微镜观察,细胞在体外培养过程中需要每天观察，以便及时了解细胞生长状态、数量改变、细胞形态、细胞有无移动、有无污染、培养液pH是否变酸、变黄、是否更换等。 细胞常规检查的方法为：,肉眼观察,一般常规检查用肉眼即可观察，主要看培养液的颜色和透明度的变化。 pH 颜色 透明度 正常 7.27.4 桃红色 清亮、透明 酸性产物 变浅、变黄 污染 混浊,变黄 pH 变红 pH ,显微镜观察,相差显
2、微镜 （phase contrast microscope） 20世纪30年代 荷兰 Zernike 原理：利用光的衍射和干涉特性，把透过标本不同区域的光波的光程差转变成振幅差，使细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比，从而使标本的各种结构变得清晰。,相差显微镜观察活细胞,Anip973,注意事项,标准化生产的培养板、培养瓶或皿一般成像效果都较好，但反复刷洗过的玻璃或塑料器皿将严重影响分辨力。 准备观察的瓶、皿要平坦，质地均匀，透光度好，在观察前将培养瓶、皿面擦净。 天气较冷时，由于温差使培养瓶内壁形成雾滴而影响观察的清晰度，可轻轻将瓶倾斜使瓶内培养液浸润内壁，以得到好的相差像。 对原代细胞
3、培养进行相差显微照相，应在换液后进行，这样可以去除漂浮的组织块和死细胞，提高成像清晰度。 观察细胞时要有无菌概念，动作要轻，避免猛烈震荡；观察时间不要太长，观察次数也不要太频繁，以免影响细胞生长。,显微镜观察,二、培养细胞常用的染色方法,细胞固定的基本方法 细胞常用的染色方法 细胞特殊的染色方法,体外细胞染色观察,体外活细胞染色就是在体外培养条件下，用某种染料对活细胞进行染色。利用这种方法，可以对培养物进行染色观察，经一些染料染色的培养物还可以继续进行培养。,碱性染料 酸性染料（台盼蓝、刚果红、吡咯蓝）,活体染料,噻嗪类（亚甲基蓝、甲苯胺蓝） 恶嗪类（亮焦油蓝、亮焦油紫（尼氏体） 丫嗪类（中性
4、红、詹纳斯绿） 三酚苯甲烷类（甲基紫、维克多利亚蓝）,詹姆斯绿,结晶紫染色,台盼蓝染色,亚甲基蓝,细胞核,线粒体,死细胞染色、 也可染巨噬细胞,中性红染色 常用活体染料，一般浓度为1：10000，用生理盐水（或Hanks液）溶解后进行高压蒸汽灭菌暗处存放，可直接浸染活体细胞显微镜下观察或用于细胞的病毒蚀斑。因其毒性大，染色后细胞不能再培养。 结晶紫染色 使用浓度为0.1，可用生理盐水配制，室温保存。该染料对死、活细胞均着色，故只能测出细胞总数。 台盼蓝染色 用0.4浓度的台盼蓝（trypan blue)，用PBS配制，室温保存，该染料只对死细胞着色，可测定活细胞数和计算存活百分率。,1、细胞固
5、定的基本方法,固定组织、细胞的目的： 把细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避免细胞发生降解、自溶、腐败和变形等；同时，固定还可以使细胞的各部分易于着色，适于观察、长期保存和分析。 固定组织、细胞的原则： 尽可能选用新鲜培养物；根据检测工具、对象、目的和要求选择固定剂和固定方法。,固定前的准备： 各种细胞培养物，如双盖片悬滴培养物、悬液培养物、单层培养物和盖片单层培养物都可作固定材料。 悬浮细胞：离心（8001000r/min）PBS/Hanks漂洗23次 贴壁细胞： 用镊子轻轻取出盖片PBS/Hanks漂洗23次 注：漂洗的目的是去除血清和附着于细胞表面的残渣，防止其妨碍染色。,常用固定液,
6、简单固定液：甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、戊二醛、苦味酸、重铬酸钾、锇酸等 混合固定液：甲醇/醋酸固定液、FAA固定液、Carnoy固定液、Bouin固定液、4多聚甲醛-PBS固定液等 甲醇/醋酸固定液：甲醇：冰醋酸为3：1，现用现配，适用于Giemsa染色。 FAA固定液：90mL 80酒精5mL 冰乙酸5mL 40甲醛，适用于盖片单层培养的细胞，固定效果好。 Carnoy固定液：较好的非水溶性固定液，60mL 纯酒精30mL 氯仿10mL 冰乙酸，适用于显示细胞化学成分。,2、细胞常用的染色方法,H.E（苏木精-伊红）染色法 原理：碱性染料苏木精和酸性染料伊红分别与细胞核和细胞质发生反应，使细胞
7、微细结构通过颜色而改变它的折射率，从而在光镜下能清晰地呈现出细胞图像，并能提供良好的核浆对比染色。 染色结果：细胞核染成蓝色，细胞质染成红色。,Giemsa（吉姆萨）染色法,染色结果：细胞核染成红色，细胞质染成蓝色。,3、细胞特殊的染色方法,Feulgen染色法 Coomassie染色法 PAS反应法 油红O（oil red O）法 免疫荧光染色法 免疫酶染色法,Feulgen（福尔根）染色法,在60条件下，DNA分子中的嘌呤碱和脱氧核糖的连键可被1mol/L 盐酸水解打开，游离出的脱氧核糖醛基能与希夫（Schiff）试剂结合，形成紫红色复合物。在此过程中，RNA不受影响，故染色具DNA特异性
8、。准确的温度和盐酸浓度，适宜的水温、时间是成功的关键。水温过度或不足均降低染色强度。此法能对DNA 进行特异性染色。,考马斯亮蓝（Coomassie，BB）染色法,原理：显示细胞骨架、胞内微丝染色方法 染色结构：细胞内的微丝呈现蓝色。,过碘酸席夫反应法（periodic acid Schiff reaction，PAS）,细胞内糖类的染色方法 原理：过碘酸是一种强氧化剂，能将葡萄糖的乙二醇基（CHOH-CHOH）氧化成两个游离的醛基，它们与Schiff试剂反应生成紫红色产物。 染色结果：细胞含糖原区呈紫红色。,细胞内脂类的染色方法,苏丹（Sudan）/法 苏丹黑法 Lillie油红O（oil
9、red O）法 Cain硫酸尼罗蓝（Nile）法 锇酸（osmic acid）法,油红O染色的脂肪比苏丹法染的颜色要深，对微小的脂滴易于显示，而且沉淀较少。,苏丹（Sudan）/法苏丹（Sudan）/法,苏丹黑法,Lillie油红O（oil red O）法,免疫荧光染色法 原理：将已知抗体或抗原标记荧光素，用此特异性试剂，浸染含有相应抗原或抗体的组织细胞标本，借助抗原抗体的特异性结合，于抗原或抗体的存在部位呈现荧光，从而可以定位标本内的抗原或抗体。,三、细胞生长状况检测方法,细胞计数法 细胞生长曲线 细胞分裂指数 克隆形成率,1、细胞计数法,细胞计数法是用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数目，
10、以测定细胞增殖和调整细胞浓度。 台盼蓝染色法用于检测存活细胞数。 注：台盼蓝染色排除检测法，由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，染料可大量进入却不能被排出，因而细胞被染色；而活细胞能排出细胞内的染料，因而不易着色。,2、细胞生长曲线,细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标，是观察同一代细胞的增殖过程。根据细胞生长曲线分析细胞增殖 方法一：在同一规格的培养瓶中，接种同等量的同一代细胞，经培养后每隔24h取出几瓶细胞进行计数，以培养时间为横坐标，不同时刻的细胞数为纵坐标，即为该细胞的生长曲线。 方法二：四氮唑盐（MTT）比色法,3、细胞分裂指数,细胞分裂指数是表示细胞增殖旺盛程度的指标；以被测10
11、00个细胞中的分裂细胞数来计算。 方法：染色后计数 细胞分裂指数细胞分裂相数/细胞总数（1000）100,4、克隆形成率,克隆形成率所计数的细胞必为贴壁和有增殖能力的细胞，反映细胞群体依赖性和增殖能力。 各种细胞克隆形成率差别很大，一般初代细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。 方法 克隆形成率克隆数/接种细胞数100 注意：细胞要分散好，不能有细胞团，接种密度不要过大。,四、细胞生物活性的化学检测法,四氮唑盐（MTT）比色法 细胞蛋白质含量测定法 细胞蛋白质合成的3H-亮氨酸掺入试验 细胞DNA合成的3H-TdR掺入试验,1、
12、四氮唑盐（MTT）比色法,原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将MTT黄色溶液还原成不溶性的蓝紫色结晶物，并沉积于细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）和酸化的异丙醇或酸化的SDS等均能溶解细胞中的紫蓝色结晶物，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值（OD），可间接反映活细胞数量。在一定细胞数值范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。 此法已广泛用于生物因子的活性检测、细胞毒性实验、抗肿瘤药物筛选和肿瘤放射敏感性测定等。,2、细胞蛋白质含量测定法（考马斯亮蓝测定法）,原理：考马斯亮蓝在酸性溶液与蛋白质结合后，在595nm波长处呈现最大吸收量，其吸光值与蛋白质含量呈正相关。 此法
13、主要用于测定酶、受体及细胞外代谢产物特异性活性的度量单位。,3、细胞蛋白合成的3H-Leu掺入试验,原理：细胞在合成蛋白质时需摄取外源性氨基酸，用核素标记氨基酸，如3H-亮氨酸，可以掺入细胞蛋白质合成代谢中，通过测定细胞的放射性强度，可了解细胞蛋白质合成代谢状况。,4、细胞DNA合成的3H-TdR掺入试验,原理：胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，也是DNA合成的必需物质。用核苷3H标记TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DNA合成代谢过程，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DNA的代谢及细胞增殖情况。,五、电子显微镜技术,光学显微镜 0.2m 电子显微镜 0.2 n m,
14、中幼红细胞透射电镜,血小板纵切面透射电镜,电子显微镜检测细胞自噬,流式细胞术(FCM)定义: FCM是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。,六、流式细胞术,特点: 单细胞的流动的 活细胞的 定量的 多参数的 高统计学精度的 分选细胞,1、液流系统: 样品流和鞘流 2、光学系统:激光、透镜组、 光电倍增管等。 3、数据处理系统,一 基本组成结构,测量群体中单个细胞经适当染色后其成分所发出的散射光和荧光，经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞经过焦点时，发出一束散射光/或荧光,经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器,光检
15、测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，以调出显示和进行分析。,二、流式细胞仪工作原理,（一）分选的基本原理,三 细胞分选原理,流式细胞计的分选功能是由细胞分选器来完成的。由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴，根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，穿过一双极板。带正电荷的微滴被吸引至阴极,而带负电荷的被吸引至阳极。以这种方式,特定的细胞亚群由于标记着不同的荧光抗体而带有不同的电荷,从而将目的细胞从混合的细胞群中分拣出来.,细胞分选原理,以分布直方图(distribution histogr
16、am) 来显示，横轴为该参数测量强度相对值，强度分布可以是线性的，也可以是对数的。纵轴一般是细胞数或细胞出现的频数。,1. 单参数直方图的显示,Single-Parameter Histogram Displays,2.双参数数据的显示 Two-Parameter Data Displays,细胞双参数测定不仅能提供二个参数各自与细胞数量的关系，更重要的是获得了这二个参数之间的相关关系，其中包含了更多的生物学信息。双参数数据显示最常用的是二维的散点图( Dot Plot )。在二维图上，横轴代表第一个测量参数，纵轴代表第二个测量参数。,纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数,在图中每一个点代表一个细胞,（1）散点图,1）前向散射光 (foword scatter)：FSC信号的强弱与细胞的大小相关 2）侧向散射光（side scatter)：SSC信号的强弱与细胞内的颗粒多少相关,双参数点图,用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相 同，不同的等高线上细胞数不同。,(2) 二维等高图,纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数,Z轴为细胞数。,（3 )假三维等高图,分选纯度 是指分离后的样品中该亚群细胞所占的百分比。 分选收获率 是指分离后所得的细胞亚群数占原细胞样品中该亚群细胞数的百分比。,细胞分选,双参数点图,