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1、关于关于结核杆菌的最新核杆菌的最新研究研究进展展第1页，讲稿共24张，创作于星期二Company Logo结核杆菌的介绍结核杆菌的介绍v自从自从1882年年Robert Koch发现结核分枝杆菌发现结核分枝杆菌(MTB)以来，以来，已报道的分枝杆菌有已报道的分枝杆菌有100多种。有关分枝杆菌的分类方法很多种。有关分枝杆菌的分类方法很多，通常分为典型结核分枝杆菌多，通常分为典型结核分枝杆菌(TM)和非结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌(NTM)。vTM包括人型结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌、非洲包括人型结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌、非洲结核分枝杆菌和田鼠分枝杆菌，又称为结核分枝杆菌结核分枝杆菌和田鼠
2、分枝杆菌，又称为结核分枝杆菌复合群复合群(MTBC).该群中该群中DNA相关性为相关性为85一一100，分分类地位相近。类地位相近。vNTM包括包括MTBC和麻风分枝杆菌以外的所有其他分枝和麻风分枝杆菌以外的所有其他分枝杆菌，在自然界中分布广泛，由于杆菌，在自然界中分布广泛，由于NTM对氯化物具有抗对氯化物具有抗性，它们甚至可以在自来水管道系统中生存。性，它们甚至可以在自来水管道系统中生存。第2页，讲稿共24张，创作于星期二Company Logo 结核是由结核是由MTBC中的细菌引起的人畜共患传染病，近年来中的细菌引起的人畜共患传染病，近年来在全球的发病率逐年上升，特别是发现了由牛结核分枝杆
3、菌引在全球的发病率逐年上升，特别是发现了由牛结核分枝杆菌引起的人类结核和由起的人类结核和由MAC引起的肺炎有增多的趋势，已成为值得关引起的肺炎有增多的趋势，已成为值得关注的公共卫生问题。研究表明，结核病牛可通过痰液、乳汁、粪便等注的公共卫生问题。研究表明，结核病牛可通过痰液、乳汁、粪便等向外排出结核杆菌污染环境。因此，动物检疫是控制结核病的重要环向外排出结核杆菌污染环境。因此，动物检疫是控制结核病的重要环节。节。结核是一种慢性消耗性疾病，每年引起全球约结核是一种慢性消耗性疾病，每年引起全球约300万人死亡。万人死亡。20世纪世纪80年代后结核病的发病率曾有所降低，但近年其全球疫情年代后结核病的
4、发病率曾有所降低，但近年其全球疫情又呈现上升趋势，而且由于结核分枝杆菌耐药性和多重耐药菌株的出又呈现上升趋势，而且由于结核分枝杆菌耐药性和多重耐药菌株的出现，结核病对某些国家已构成严重的健康威胁。因此，对结核杆菌的现，结核病对某些国家已构成严重的健康威胁。因此，对结核杆菌的研究非常重要。研究非常重要。结核杆菌的介绍结核杆菌的介绍第3页，讲稿共24张，创作于星期二Company Logo结核杆菌诊断技术研究进展结核杆菌诊断技术研究进展结核杆菌诊断技术研究进展结核杆菌诊断技术研究进展一、细菌学检测一、细菌学检测 结核病人的细菌学检测是结核病诊断、治疗及结核病人的细菌学检测是结核病诊断、治疗及评价治
5、疗效果的可靠手段。在过去的评价治疗效果的可靠手段。在过去的20年中，针年中，针对结核分枝杆菌的早期感染已经建立了一系列快对结核分枝杆菌的早期感染已经建立了一系列快速检测系统。速检测系统。1、全自动分枝杆菌检测系统（、全自动分枝杆菌检测系统（BACTEC）该法采用放射同位素技术对细菌的生长进行该法采用放射同位素技术对细菌的生长进行自动检测。该法检测的阳性率比自动检测。该法检测的阳性率比L-j法提高了法提高了10，但其局限性在于无法观察菌落形态、容易污，但其局限性在于无法观察菌落形态、容易污染、有放射性及价格昂贵。染、有放射性及价格昂贵。第4页，讲稿共24张，创作于星期二Company Logo结
6、核杆菌诊断技术研究进展结核杆菌诊断技术研究进展2、分枝杆菌生长指示系统、分枝杆菌生长指示系统(MGIT)MGIT系统是继全自动分枝杆菌检测系统系统是继全自动分枝杆菌检测系统(BACTIEC)检测系统之后发明的一种非放射性检测系统之后发明的一种非放射性培养法，包括培养法，包括MiddleBrood 7H9液体培养基和液体培养基和分枝杆菌生长指示剂，该指示剂在有氧条件下发分枝杆菌生长指示剂，该指示剂在有氧条件下发生荧光淬灭。当培养基中分枝杆菌生长代谢逐渐生荧光淬灭。当培养基中分枝杆菌生长代谢逐渐消耗氧时，培养基的氧化还原电势降低，指示剂消耗氧时，培养基的氧化还原电势降低，指示剂发出荧光这样可通过紫
7、外线透射仪观察，分枝发出荧光这样可通过紫外线透射仪观察，分枝杆菌生长所产生的荧光在气液面及试管底部呈橙杆菌生长所产生的荧光在气液面及试管底部呈橙色即为阳性结果。色即为阳性结果。第5页，讲稿共24张，创作于星期二Company Logo结核杆菌诊断技术研究进展结核杆菌诊断技术研究进展3、MBBacT系统系统 MBBacT系统是由德国系统是由德国HeiphaBiotest公司生产的一种液体培养基系统，该系统对标公司生产的一种液体培养基系统，该系统对标本中结核分枝杆菌复合群本中结核分枝杆菌复合群(MTBC)初代分离率初代分离率高于全自动分枝杆菌检测系统高于全自动分枝杆菌检测系统(BACTE)TB46
8、0，可以通过肉眼观察到细菌生长，且无放射性，可以通过肉眼观察到细菌生长，且无放射性污染污染.但不能用于分支杆菌的菌型鉴定但不能用于分支杆菌的菌型鉴定。第6页，讲稿共24张，创作于星期二Company Logo结核杆菌诊断技术研究进展结核杆菌诊断技术研究进展4、噬茵体报告技术、噬茵体报告技术 该技术原理为，萤光素酶指示的分枝杆菌噬菌体该技术原理为，萤光素酶指示的分枝杆菌噬菌体与在含抗结核药物培养基中短暂培养的待检菌混与在含抗结核药物培养基中短暂培养的待检菌混合后，能感染活的耐药菌，使之表达萤光素酶基合后，能感染活的耐药菌，使之表达萤光素酶基因，再加入萤光素底物，活菌会产生荧光，而敏因，再加入萤光
9、素底物，活菌会产生荧光，而敏感菌无荧光产生。此办法直观性高、用时短，但感菌无荧光产生。此办法直观性高、用时短，但如要被广泛应用于结核杆菌的快速检测还需要进如要被广泛应用于结核杆菌的快速检测还需要进一步的探索必须使用标准化的细菌、标准化的一步的探索必须使用标准化的细菌、标准化的萤光素酶系统，以及标准化的培养基和发光检测萤光素酶系统，以及标准化的培养基和发光检测仪，并能与用常规方法所测最低抑菌浓度值相符。仪，并能与用常规方法所测最低抑菌浓度值相符。第7页，讲稿共24张，创作于星期二Company Logo结核杆菌诊断技术研究进展结核杆菌诊断技术研究进展二、血清学检测二、血清学检测多数血清学实验检测
10、时间短，具有较高的特异性。多数血清学实验检测时间短，具有较高的特异性。可用于人群筛选。但日前已商品化的组合抗原检可用于人群筛选。但日前已商品化的组合抗原检测试剂盒都无法检测出所有结核患者血清中的抗测试剂盒都无法检测出所有结核患者血清中的抗结核抗体。结核分枝杆菌抗原多且复杂，在宿主结核抗体。结核分枝杆菌抗原多且复杂，在宿主体内表达的数量、种类或时机可能随患者的个体体内表达的数量、种类或时机可能随患者的个体免疫背景和病程而异，从而表现出不同的抗体谱。免疫背景和病程而异，从而表现出不同的抗体谱。因此，采用多种抗原联合检测的手段，在保证特因此，采用多种抗原联合检测的手段，在保证特异性的基础上有助于改善
11、灵敏低的缺点。异性的基础上有助于改善灵敏低的缺点。第8页，讲稿共24张，创作于星期二Company Logo结核杆菌诊断技术研究进展结核杆菌诊断技术研究进展1、酶联免疫吸附法、酶联免疫吸附法由于酶联免疫吸附法由于酶联免疫吸附法(ELSA)简使、易简使、易行、快速、无需特殊精密仪器，所以在结行、快速、无需特殊精密仪器，所以在结核病血清学诊断方面研究最多、应用最广。核病血清学诊断方面研究最多、应用最广。第9页，讲稿共24张，创作于星期二Company Logo2、斑点金标免疫渗滤法、斑点金标免疫渗滤法斑点金标免疫渗滤法斑点金标免疫渗滤法(DIGFA)是将固相人型结是将固相人型结核分枝杆菌蛋白衍生物
12、核分枝杆菌蛋白衍生物(PPD)纯化抗原包被在斑纯化抗原包被在斑点反应板上，其与体液中的抗结核分枝杆菌抗体点反应板上，其与体液中的抗结核分枝杆菌抗体(PPDIgG)形成复合物胶体金标记抗人形成复合物胶体金标记抗人IgG或海藻硫酸多糖或海藻硫酸多糖(SPA)与复合物结合，形成肉眼与复合物结合，形成肉眼可见的红色斑点。这种方法具有简便、快速、结可见的红色斑点。这种方法具有简便、快速、结果易于判读、无需特殊仪器、能进行单个标本的果易于判读、无需特殊仪器、能进行单个标本的测定、受检患者可及时得到结果等特点。测定、受检患者可及时得到结果等特点。但受结但受结核菌或其他分枝杆菌感染及卡介苗接种等影响，核菌或其
13、他分枝杆菌感染及卡介苗接种等影响，可能出现交叉反应。可能出现交叉反应。结核杆菌诊断技术研究进展结核杆菌诊断技术研究进展第10页，讲稿共24张，创作于星期二Company Logo结核杆菌诊断技术研究进展结核杆菌诊断技术研究进展3、结明实验、结明实验结明实验结明实验(MycoDot)是国内外使用较早、较普是国内外使用较早、较普遍的结核抗体快速检测实验。将脂阿拉伯甘露聚遍的结核抗体快速检测实验。将脂阿拉伯甘露聚糖糖(LAM)作为抗原固定在电泳梳上，再将此附有作为抗原固定在电泳梳上，再将此附有抗原的电泳梳于稀释的血清或全血中浸泡，标本抗原的电泳梳于稀释的血清或全血中浸泡，标本中如有中如有LAM抗体，
14、则与梳上抗体，则与梳上LAM抗原相结合，抗原相结合，浸入显色液后，抗体会颗粒便会特异性地聚集在浸入显色液后，抗体会颗粒便会特异性地聚集在抗原抗体复合物上，在梳上附着抗原处形成红色抗原抗体复合物上，在梳上附着抗原处形成红色圆形斑点，即为阳性。结核菌细胞壁成份中含有圆形斑点，即为阳性。结核菌细胞壁成份中含有阿拉伯甘露糖因此只有当患者患活动性结核病阿拉伯甘露糖因此只有当患者患活动性结核病时，才会有阳性反应。健康人、既往感染者以及时，才会有阳性反应。健康人、既往感染者以及卡介苗接种者都显示为阴性。卡介苗接种者都显示为阴性。第11页，讲稿共24张，创作于星期二Company Logo结核杆菌诊断技术研究
15、进展结核杆菌诊断技术研究进展三、分子生物学诊断方法三、分子生物学诊断方法1、结核杆茵、结核杆茵DNA扩增法扩增法(PCR法法)在过去的在过去的20年，已建立起多种年，已建立起多种PCR技术用来检测结核分枝技术用来检测结核分枝杆菌特异性的靶序列。实验证明，杆菌特异性的靶序列。实验证明，PCR是一种简便、快速、灵是一种简便、快速、灵敏、特异的基因诊断技术，特别适用于因排菌量少、结核杆菌发敏、特异的基因诊断技术，特别适用于因排菌量少、结核杆菌发生生L型变异而被常规细菌学检查漏诊者的早期诊断、鉴别诊型变异而被常规细菌学检查漏诊者的早期诊断、鉴别诊断及化疗后排菌情况的观察，标本不需要预培养，有很高的断及
16、化疗后排菌情况的观察，标本不需要预培养，有很高的临床诊断价值。虽然临床诊断价值。虽然PCR技术有诸多好处，但是目前该方法仍缺技术有诸多好处，但是目前该方法仍缺少权威性的诊断试剂盒，存在的主要问题是扩增时气溶胶污染导毁的少权威性的诊断试剂盒，存在的主要问题是扩增时气溶胶污染导毁的假阳性、标本中假阳性、标本中PCR抑制物质导致的假阴性，因此还有待进一步改抑制物质导致的假阴性，因此还有待进一步改进。进。第12页，讲稿共24张，创作于星期二Company Logo结核杆菌诊断技术研究进展结核杆菌诊断技术研究进展2、实时荧光定量、实时荧光定量PCR技术技术 实时荧光定量实时荧光定量PCR技术具有引物和探
17、针的双技术具有引物和探针的双重特异性。与传统重特异性。与传统PCR相比，在对结核分枝杆菌相比，在对结核分枝杆菌检测的特异性上大为提高。尽管检测的特异性上大为提高。尽管实时荧实时荧光定量光定量PCR技技术术在结核分枝杆菌检测方面有许多优势，在结核分枝杆菌检测方面有许多优势，但由于其高灵敏性、实验操作易受污染等而容易但由于其高灵敏性、实验操作易受污染等而容易出现假阳性。只要有微量病原体存在，出现假阳性。只要有微量病原体存在，PCR扩增扩增即可为阳性结果，故并不能作为诊断依据，只有即可为阳性结果，故并不能作为诊断依据，只有当一定数量的病原体存在时才有临床意义。当一定数量的病原体存在时才有临床意义。第
18、13页，讲稿共24张，创作于星期二Company Logo结核杆菌诊断技术研究进展结核杆菌诊断技术研究进展3、限制性片段长度多态性（、限制性片段长度多态性（PCRRFLP）分子生物学诊断方法分子生物学诊断方法PCRRFLP(限制性片限制性片段长度多态性段长度多态性)是以是以PCR为基础的分类鉴定技术为基础的分类鉴定技术和限制性内切酶分析相结合的技术。和限制性内切酶分析相结合的技术。PCRRFlJP分析是鉴定分枝杆菌种的可靠程序，比形分析是鉴定分枝杆菌种的可靠程序，比形态学和生理、生化特征等常规方法更准确，快速。态学和生理、生化特征等常规方法更准确，快速。第14页，讲稿共24张，创作于星期二Co
19、mpany Logo 4、DNA探针技术探针技术 结核杆菌结核杆菌DNA探针主要包括探针主要包括eDNA探针、全染色探针、全染色体体DNA探针、克隆探针、克隆DNA探针和寡核甘酸探针等。探针和寡核甘酸探针等。DNA探针的缺点是灵敏度低标本中细菌数较少探针的缺点是灵敏度低标本中细菌数较少时难以检出，因此限制了其临床应用。将灵敏度时难以检出，因此限制了其临床应用。将灵敏度高的高的PCR技术与特异性强的技术与特异性强的DNA探针技术有机探针技术有机结合，将成为结核病诊断的发展趋势。世界卫生结合，将成为结核病诊断的发展趋势。世界卫生组织最近推出一种分子检测法，又称为线性探针组织最近推出一种分子检测法，
20、又称为线性探针检测法，其应用将给抗药性结核病的治疗带来显检测法，其应用将给抗药性结核病的治疗带来显著进展。著进展。结核杆菌诊断技术研究进展结核杆菌诊断技术研究进展第15页，讲稿共24张，创作于星期二Company Logo5、生物芯片检测、生物芯片检测 生物芯片生物芯片(又称又称DNA芯片、基因芯片芯片、基因芯片)。该方。该方法适用于基因表达、基因功能、基因分型和序列法适用于基因表达、基因功能、基因分型和序列分析等的研究。基因芯片正以其无可比拟的信息分析等的研究。基因芯片正以其无可比拟的信息量、高通量及快速、准确地分析基因的本领，在量、高通量及快速、准确地分析基因的本领，在结核分枝杆菌菌种鉴定
21、、耐药性监测、基因组比结核分枝杆菌菌种鉴定、耐药性监测、基因组比较分析等方面发挥着重要的作用，但由于仪器昂较分析等方面发挥着重要的作用，但由于仪器昂贵和制备芯片成本偏高等因素限制了其普及。贵和制备芯片成本偏高等因素限制了其普及。结核杆菌诊断技术研究进展结核杆菌诊断技术研究进展第16页，讲稿共24张，创作于星期二Company Logo结核疫苗研究进展结核疫苗研究进展v结核疫苗的研究策略目前，研究疫苗的总体思路结核疫苗的研究策略目前，研究疫苗的总体思路来说，主要分为以下三种。来说，主要分为以下三种。v第一种策略将一些重要的抗原或者其它因子重新第一种策略将一些重要的抗原或者其它因子重新导入到现有的
22、导入到现有的BCG 株，得到一个以株，得到一个以BCG 为载体为载体的重组的重组BCG 疫苗，或者使结核分枝杆菌的基因缺疫苗，或者使结核分枝杆菌的基因缺失得到基因缺失突变株从而制造出新的结核疫苗，失得到基因缺失突变株从而制造出新的结核疫苗，取代我们传统用的取代我们传统用的BCG，这种方法制备的结核分，这种方法制备的结核分枝杆菌减毒活疫苗可显著地表达多种抗原并激活枝杆菌减毒活疫苗可显著地表达多种抗原并激活各各T 细胞群联合免疫。作为临床试验的候选，这细胞群联合免疫。作为临床试验的候选，这种疫苗肯定会比种疫苗肯定会比BCG 更有效，更安全。更有效，更安全。第17页，讲稿共24张，创作于星期二Com
23、pany Logo结核疫苗研究进展结核疫苗研究进展v第二种策略是对已接种卡介苗的儿童进行强化免疫，进而加强第二种策略是对已接种卡介苗的儿童进行强化免疫，进而加强免疫应答并将免疫保护力延续至成人阶段。这一策略目前公认免疫应答并将免疫保护力延续至成人阶段。这一策略目前公认的最佳方案是应用亚单位疫苗加强免疫。亚单位疫苗组成明确，的最佳方案是应用亚单位疫苗加强免疫。亚单位疫苗组成明确，结构简单，可应用于有免疫缺陷的人群，倍受人们关注。亚单结构简单，可应用于有免疫缺陷的人群，倍受人们关注。亚单位疫苗主要是由有限数量的抗原构成，所引起的保护性免疫应位疫苗主要是由有限数量的抗原构成，所引起的保护性免疫应答也
24、高度集中。但其在体内滞留时间短，免疫应答的持续时间答也高度集中。但其在体内滞留时间短，免疫应答的持续时间也较短，必须与佐剂联用才有效，使其应用受到限制，几种主也较短，必须与佐剂联用才有效，使其应用受到限制，几种主要的候选疫苗均采用了将单抗原与多聚蛋白融合的方法，这样要的候选疫苗均采用了将单抗原与多聚蛋白融合的方法，这样不仅增强了单抗原的免疫力，也易于进行规模化生产。所以佐不仅增强了单抗原的免疫力，也易于进行规模化生产。所以佐剂的发展对强化免疫策略的实现功不可没。剂的发展对强化免疫策略的实现功不可没。第18页，讲稿共24张，创作于星期二Company Logo结核疫苗研究进展结核疫苗研究进展v第
25、三种策略是将重组第三种策略是将重组BCG 和亚单位疫苗或两种以和亚单位疫苗或两种以上的疫苗结合到一起，从而解决结核疫苗免疫效上的疫苗结合到一起，从而解决结核疫苗免疫效果低下这一难题，虽然这个方法要求至少需要几果低下这一难题，虽然这个方法要求至少需要几年的时间进行第三期临床试验，这就需要做一个年的时间进行第三期临床试验，这就需要做一个时间计划表来设法减少疫苗期试验，做一个成功时间计划表来设法减少疫苗期试验，做一个成功的疫苗接种计划。的疫苗接种计划。第19页，讲稿共24张，创作于星期二Company Logo结核疫苗研究进展结核疫苗研究进展v从疫苗结构完整性来看一般可分为：重组从疫苗结构完整性来看
26、一般可分为：重组BCG、亚单位疫苗、亚单位疫苗、DNA 疫苗基因和缺失疫苗等。疫苗基因和缺失疫苗等。第20页，讲稿共24张，创作于星期二Company Logo结核疫苗研究进展结核疫苗研究进展1、重组弱毒疫苗、重组弱毒疫苗主要包括基因缺失弱毒疫苗和以主要包括基因缺失弱毒疫苗和以BCG 为载体的重组疫苗。为载体的重组疫苗。vrBCG30 是一种经过基因改造的卡介苗。比是一种经过基因改造的卡介苗。比BCG能产生更强的免疫应答。能产生更强的免疫应答。rBCG30已经通过临床已经通过临床1 期试验，人体对其显示了良好的耐受期试验，人体对其显示了良好的耐受性性12。vrBCG reC:Hly 德国柏林德
27、国柏林Max-Planck 研究所研发的携带李斯特菌溶解素研究所研发的携带李斯特菌溶解素（Hly）而自身尿素酶）而自身尿素酶C 基因缺乏的重组基因缺乏的重组BCG。v基因剔除疫苗基因剔除疫苗ICLv营养缺陷株疫苗营养缺陷株疫苗 该疫苗可用于该疫苗可用于HIV 感染者而不引起相关性疾病。正在研制的该感染者而不引起相关性疾病。正在研制的该类疫苗约有类疫苗约有9 种，在动物实验中均有一定的保护效果，但持续时种，在动物实验中均有一定的保护效果，但持续时间短，免疫记忆差，且毒力尚不确定。间短，免疫记忆差，且毒力尚不确定。第21页，讲稿共24张，创作于星期二Company Logo结核疫苗研究进展结核疫苗
28、研究进展v2、亚单位基因工程疫苗、亚单位基因工程疫苗v Ag85B-ESAT6 融合蛋白（融合蛋白（Hybrid1）和）和Ag85B-TB10.4 融合蛋白（融合蛋白（Hybrid4）v 热休克蛋白疫苗（热休克蛋白疫苗（J774-HSP65，BMC-HSP65）v MTB72f.利用表现为利用表现为Rv0125(MTB39)和和Rv1196(MTB32)融合蛋白融合蛋白质配合免疫佐剂（质配合免疫佐剂（AS02A，AS01B）。）。v MVA-85A.利用自己不复制的痘苗病毒为载体利用自己不复制的痘苗病毒为载体,表达出具有强免疫原性的表达出具有强免疫原性的结核杆菌结核杆菌Ag85A 抗原的基因疫
29、抗原的基因疫_苗重组，从而在儿童中获苗重组，从而在儿童中获得预防结核病的长久免疫保护效果。在技术上只是为了增强得预防结核病的长久免疫保护效果。在技术上只是为了增强卡介苗的效果。卡介苗的效果。第22页，讲稿共24张，创作于星期二Company Logo结核疫苗研究进展结核疫苗研究进展v3、DNA 疫苗疫苗v Pro-apoptotic BCG 俗称俗称“促凋亡卡介苗促凋亡卡介苗”，卡介苗的生产抗细胞凋，卡介苗的生产抗细胞凋亡的因素在减少，改造提高疫苗的免疫水平从而亡的因素在减少，改造提高疫苗的免疫水平从而可以诱导出更为强烈的免疫反应。可以诱导出更为强烈的免疫反应。v 联合多价联合多价DNA 疫苗疫苗第23页，讲稿共24张，创作于星期二感感谢谢大大家家观观看看第24页，讲稿共24张，创作于星期二