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1、 第一章 基因工程 一.基本工具 (一)限制性核酸内切酶1. 分布:原核生物2. 作用:一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,并且在特定部位 进行切割,使两个核苷酸间的磷酸二酯键断开。3. 作用结果：产生黏性末端或平末端（二） DNA连接酶1. 分类（1）E.coliDNA连接酶来源：大肠杆菌 功能：只能连接黏性末端 （2）T4DNA连接酶来源：T4噬菌体 功能：连接黏性末端和平末端2. 作用：将DNA连接起来 （三）基因进入受体细胞的载体1. 条件（1）具有多个限制酶切割位点，供外源基因插入 （2）可自我复制或整合到染色体DNA中进行同步复制。 （3）具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择
2、2. 种类：噬菌体的衍生物、动植物病毒、质粒 质粒：双链环状DNA分子，最常用，要人工改造 二。基本操作程序 （一）目的基因的获取1. 目的基因：编码蛋白质的基因或具有调控作用的因子2. 获取方法（1）从基因文库中获取 *基因组文库，部分基因文库 （2）利用PCR技术扩增目的基因 （3）化学方法直接人工合成：基因小，核苷酸序列已知 （二）基因表达载体的构建（核心步骤）1. 目的(1)稳定存在，遗传给下一代 （2）表达和发挥作用2. 结构：启动子、目的基因、终止子、标记基因、复制原点 *启动子：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录 *终止子：使转录在所需要的地方停止； *标记基因：鉴别受体
3、细胞中是否含目的基因。 （三）将目的基因导入受体细胞1. 转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内 维持稳定和表达2. 将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法（2）基因枪法 （3）花粉管通道法3. 将目的基因导入动物细胞：显微注射法4. 将目的基因导入微生物细胞：Ca+处理使细胞处于感受态 *原核细胞特点：繁殖快，单细胞，遗传物质相对较少 （四）目的基因的检测及鉴定1. 分子水平的检测 （1）检测受体细胞中是否插入了目的基因:DNA分子杂交技术 （2）检测目的基因是否转录出了 mRNA：DNA分子杂交技术 （3）检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原抗体杂交法*检测成功会出现杂交带2. 个
4、体生物学水平的鉴定：接种实验三 基因工程的应用1. 动物、植物基因工程的成果 （1）植物：提高抗逆性、改良品质、生产药物； （2）动物：品种改良、建立生物反应器、器官移植；2. 基因工程药物：细胞因子、抗体、疫苗、激素；3. 基因治疗（1）概念： （2）方法体外基因治疗 体内基因治疗四 蛋白质工程的崛起1. 理论推测，人工合成2. 基因工程，蛋白合成（自然界没有的蛋白质） 第二章 细胞工程 一.细胞工程 1.原理和方法:细胞生物学和分子生物学 2.操作水平:细胞水平或细胞器水平 3.目的:按照人们的意愿改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品 4.分类:植物细胞工程和动物细胞工程二. 植物细胞工程的
5、基本技术 (一)植物组织培养技术 1.原理:植物细胞具有全能性 2.条件 (1)材料:离体 (2)培养基:营养 激素 (3)外界条件:无菌等 3.过程:离体组织器官脱分化 愈伤组织 再分化 胚状体 植株 (二)植物体细胞杂交技术 1.概念:不同种 杂种细胞 植物体 2.原理：植物细胞具有全能性 3.过程(1)制备原生质体方法酶解法 酶:纤维素酶和果胶酶 结果:获得原生质体 (2)诱导原生质体融合方法:a物理法离心、振动、电激 b化学法:聚乙二醇(PEG) 标志:杂种细胞再生出细胞壁 结果：形成杂种细胞 （3）杂种细胞的筛选：AA BB AB AB （4）植物组织培养：杂种细胞 杂种植株 4.意
6、义：克服远缘杂交不亲和的障碍 *生殖方式：无性生殖 变异类型：染色体数目变异（三）实际应用 1.植物繁殖的新途径（1） 微型繁殖：植物组织培养（2） 作物脱毒：茎尖组织培养（3） 人工种子：胚状体、芽 + 人工薄膜 *可加入固氮菌、抗生素、除草剂等有利于生长和提高产量 2.作物新品种的培育 （1）单倍体育种（2）突变体的利用 3.细胞产物的工产化生产（1）细胞产物种类蛋白质、糖类、药物、香料、生物碱（2）一般为愈伤组织时期 第二课时三 动物细胞工程 （一）动物细胞培养的过程 细胞株 细胞系取材处理 单个细胞 培养 细胞悬浮 10代细胞 50代细胞 原代培养 传代培养 1. 取材：胚胎细胞或幼龄
7、动物的组织器官2. 处理：剪碎、胰蛋白酶或胶原蛋白酶3. 培养：（1）培养基：液体培养基、合成培养基 （2）条件无菌无毒环境（灭菌 抗生素 更换） 营养:、维生素、动物的血清、血浆 温度PH:36.5+/-0.5 7.27.4 气体环境：O2代谢所必需；CO2维持培养液PH4. 原代培养：细胞贴壁、接触抑制、冷冻保存（110代）5. 传代培养：酶处理、分装； 细胞株：1050代，正常 细胞系：50代以后，有癌变特点6. 应用：皮肤移植、生产蛋白质制品、有毒物质的检测、研究 四.动物细胞核移植和克隆动物1. 概念:核移植 重组胚胎 个体2. 原理:动物细胞核具有全能性3. 分类:胚胎细胞核移植和
8、体细胞核移植4. 过程:见课本5. 应用及存在的问题 (1)畜牧业、保护濒危物种、医药卫生、治疗疾病、器官移植 (2)问题:成功率低 健康问题 食品安全问题 五.动物细胞融合1. 概念:2. 原理:细胞膜的流动性3. 方法(1)物理法(2)化学法(3)生物法：灭活的病毒4. 意义：5. 用途：制备单克隆抗体 六.单克隆抗体1. 概念:化学性质单一,特异性强的抗体2. 制备过程(1)免疫动物：注入特定抗原 (2)细胞融合：灭活病毒 (3)筛选杂交瘤细胞 用选择培养基筛选出杂交瘤细胞 抗体抗原杂交检测出能产生特定抗体的杂交瘤细胞 (4)生产并提纯单克隆抗体 体内：动物腹腔 体外：液体培养基3. 优
9、点:特异性强 灵敏度高 能大量制备应用:(1)诊断(2)治疗:生物导弹 第三章 胚胎工程一 精子的发生1. 场所：睾丸2. 时间：初情期 生殖机能衰退 有丝分裂 精原细胞3. 过程：精原细胞 MI MII 精细胞 变形 精子4. 变形：细胞核 头部 高尔基体 頂体 中心体 尾部 线粒体 线粒体鞘 其他物质 原生质滴（脱落）*精子的大小及动物体型的大小无关二 卵子的发生1. 场所：卵巢 输卵管2. 时间：胎儿期 初情期3. 过程：（1）胎儿期 卵原细胞 有丝分裂 卵原细胞 复制 卵泡形成：初级卵母细胞 + 卵泡细胞（卵巢） 卵巢 MI （2）初情期 排卵 次级卵母细胞 + 第一极体 （输卵管）
10、受精 输卵管 MII 合子 + 第二极体*卵子发生过程中MI MII不连续*初级卵母细胞周围形成透明带*卵子受精的标志:卵细胞膜及透明带间可观察到两个极体*精卵发生的重要区别：胎儿期卵泡的形成和储备三 受精1. 场所：输卵管2. 过程：（1）精子获能：场所为雌性生殖道内 （2）卵子准备：发育至MII中期 （3）受精阶段： 精子穿越放射冠和透明带 a頂体反应：释放頂体酶 b透明带反应：防止多精入卵受精（第一道屏障） 进入卵细胞膜 a时间：精子入卵后 b作用：防止多精入卵受精（第二道屏障） 原核形成和融合 a精子头尾分离 形成雄原核 b受精后MII，排极体，形成雌原核 c雄原核及雌原核融合四 胚胎
11、发育 （一）卵裂 1.受精卵：个体发育的起点 2.桑椹胚：之前细胞具有全能性 3.囊胚：开始分化 内细胞团（个大) 滋养层(个小) 具有囊胚腔 *卵裂特点:有丝分裂 细胞增多 总体积不变或缩小 *孵化:透明带破裂 (二)原肠胚 (1)内细胞团:外胚层 内胚层 原肠腔 组织器官 (2)滋养层:胎盘和胎膜 第二课时 胚胎工程一 体外受精五 卵母细胞的采集和培养1. 小型动物（1）处理：促性腺激素 超数排卵 （2）场所：输卵管中冲取卵子2. 大型动物（1）场所：卵巢 （2）培养：人工培养至MII中期 （二）精子的采集和获能1. 收集精子的方法（1）假阴道法（2）手握法（3）电刺激法2. 精子获能的方
12、法（1）培养法：获能液 （2）化学诱导法：肝素或钙离子载体A23187溶 液 + 化学药物 （三）受精：获能溶液或专用的受精溶液二 胚胎的早期培养 1.发育培养液（1）成分：有无 两素 两酸 血清 （2）继续发育 检查发育能力 2.结果：早期胚胎三 胚胎移植的生理基础 1.发情处理后，供体、受体生殖器官的生理变化相同 2.早期胚胎处于游离状态，可收集 3.受体对外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应 4.孕育过程中胚胎的遗传特性不受影响四 胚胎移植的基本程序 1.对供体、受体的选择和处理（1） 选择供体：遗传性能和生产性能优秀 受体：体质和繁殖能力正常（2）处理性激素：同期发情处理 促性腺激素：超数
13、排卵 2. 配种或人工受精 3.对胚胎的收集、检查、培养或保存 收集：子宫中冲卵 检查：桑椹胚或囊胚 保存：-196液氮 4.胚胎移植（1）手术法（2）非手术法 5.妊娠检查、分娩*优势：充分发挥雌性优良个体的繁殖能力五 胚胎分割 1.概念：机械 2n 移植 2.生殖方式：无性生殖 3.仪器设备：实体显微镜和显微操作仪 4.分割时期：发育良好形态正常的桑椹胚或囊胚*囊胚分割时注意将内细胞团均等分割*性别鉴定和胚胎分割取材部位不同 5.意义：提高胚胎利用率六 胚胎干细胞 1.来源：早期胚胎细胞和原始性腺 2.特性（1）形态：细胞体积小、核大、核仁明显 （2）功能：细胞具有全能性*体外培养只增殖而不分化 3.应用：体外诱导分化 治疗疾病 用于研究第 9 页