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1、关于细胞凋亡及其相关进展第1页，讲稿共90张，创作于星期三1.细胞凋亡的概述 2.细胞凋亡的信号转导途径3.重要的凋亡调控基因 4.常见细胞凋亡检测方法内内 容容第2页，讲稿共90张，创作于星期三细胞凋亡的概述一、细胞凋亡的概念1 凋亡概念的形成 1972年，Kerr发现，结扎鼠门静脉后，电镜观察到肝实质组织中有一 些细胞体积收缩、染色质凝集。这些细胞从其周围的组织中脱落并被吞噬且机体无炎症反应。1972年Kerr等首次提出了细胞 凋亡(Apoptosis)的概念。Apoptosis一词来源于希腊，原意指秋天树叶的凋落以及花瓣的散落，其语源是apo(off,离去之意),ptosis(falli
2、ng，凋落之意）。第3页，讲稿共90张，创作于星期三英国人悉尼布雷内、美国人罗伯特霍维茨和英国人约翰苏尔斯顿，。（2002年）“for their discoveries concering genetic regulation of organ of development and programmed cell death”第4页，讲稿共90张，创作于星期三 英国科学家悉尼布雷内。1951年在南非威特沃特斯兰大学完成了他的硕士学业，1954年取得英国牛津大学博士学位，现任职于美国加利福尼亚州伯克利的分子科学研究所。他选择线虫作为新颖的实验生物模型，这种独特的方法使得基因分析能够和细胞的分裂
3、、分化，以及器官的发育联系起来，并且能够通过显微镜追踪这一系列过程。布雷内在英国剑桥完成的这些发现为他获得诺贝尔奖奠定了基础。第5页，讲稿共90张，创作于星期三 秀丽隐杆线虫 1090131959（cells）属无脊椎动物 线形动物门 线虫纲 个头小1mm 最大特点：体细胞数恒定 发现线虫ced3 4 9基因直接与细胞凋亡相关，而且这些基因在高等哺乳类动物也有普遍意义。第6页，讲稿共90张，创作于星期三2细胞凋亡的概念 细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因严格控制的细胞自主的有序死亡。也常常被称为细胞程序死亡（programmed cell death）凋亡细胞被吞噬细胞吞噬。第7页，讲稿共9
4、0张，创作于星期三第8页，讲稿共90张，创作于星期三4细胞凋亡与细胞程序性死亡的区别 细胞凋亡一词出现之前的1965年，Lockshin等在研究蛾的变态发育过程中已发现存在着细胞程序性死亡（Programmed cell death，PCD）现象。PCD是个功能性的概念，描述在一个多细胞生物体中某些细胞死亡是个体发育中,一个预定的并受到严格程序控制的正常组成部分。细胞凋亡则是一个形态学的概念，描述一件有着一整套形态学特征的与坏死完全不同的细胞死亡形式。第9页，讲稿共90张，创作于星期三3细胞凋亡的生理意义 组织分化、器官发育 免疫系统的动态平衡（损伤修复和衰老细胞的清除）抵御外界各种因素干扰
5、举例：1.胸腺 2.哺乳期乳腺发育第10页，讲稿共90张，创作于星期三 凋亡时细胞的形态学改变 空泡化空泡化固固缩缩出芽出芽边集边集凋亡小体凋亡小体第11页，讲稿共90张，创作于星期三第12页，讲稿共90张，创作于星期三DAPI即4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole)是一种能够与DNA中大部分A A，T T碱基相互结合的荧光染料碱基相互结合的荧光染料常用与荧光显微镜观测。因为DAPI可以透过完整的细胞膜它可以用于活细胞和固定细胞的染色。第13页，讲稿共90张，创作于星期三荧光染料标记(Hoechst33342、PI)的凋亡细胞(染色质凝聚).流
6、式细胞仪鉴别:正常细胞:低蓝(hocehest+)/低红(PI+);凋亡细胞:高蓝(hocehest+)/低红(PI+）坏死细胞:低蓝(hocehest+)/高红(PI+);第14页，讲稿共90张，创作于星期三二、细胞凋亡的形态学及生化特征1细胞凋亡的形态学特征 往往涉及单个细胞。凋亡细胞连接消失，与周围的细胞脱落。细胞体积变小(皱缩)，细胞质浓缩。胞膜结构完整，有泡状突起。细胞核染色质浓缩，聚集核膜周围。在胞浆中出现由降解的胞浆和胞核成分包裹于膜性成分中形成的凋亡小体(Apoptotic bodies)。无内容物外溢，因而不引起周围的炎症反应。第15页，讲稿共90张，创作于星期三生化特征细胞
7、色素细胞色素C诱导细胞凋亡不同时间诱导细胞凋亡不同时间DNA电泳图电泳图第16页，讲稿共90张，创作于星期三生化特征1 胞浆内Ca2+浓度升高(继而激活核酸内切酶发生最早)。2 细胞内活性氧增多。3 RNA/蛋白质合成(说明凋亡是主动耗能过程与某些基因表达变化有关)。4 DNA内切酶活性被激活升高，双链DNA在核小体之间切断形成185bp为基数的有序片段。5 型谷氨酰胺转移酶和需钙蛋白酶（Calpain）活性升高。注：型谷氨酰胺转移酶是Ca2+依赖酶，可促进蛋白质谷氨酰胺与赖氨酸残基之间的交联，使细胞膜出现凹陷、皱缩，促进凋亡小体的形成。另外丝氨酸蛋白酶（如粒酶B),一氧化氮合酶（NOS),P
8、ARP,calpain,等也参与细胞的凋亡过程。第17页，讲稿共90张，创作于星期三细胞凋亡的生化改变和凋亡有关的两个酶DNase作用：切割染色质DNA特点：Ca2+/Mg2+增强活性，Zn2+抑制其活Casepases作用：灭活凋亡抑制物 水解蛋白质结构，形成凋亡小体 水解凋亡相关活性蛋白特点：一类特异的在天冬氨酸之后切割靶蛋白的半胱氨酸蛋白酶家族（cysteine-containing aspartate-specific protease）第18页，讲稿共90张，创作于星期三细胞坏死的概述一般过程：因补体反应或烈性病毒感染破坏了质膜，或者能量依赖性离子泵被破坏产生的钠钾等离子沿着各自的浓
9、度梯度进入细胞，从而导致细胞吸水膨胀，最终破膜而死。特征：线粒体膨胀，细胞骨架降解，溶酶体释放，细胞核内染色质沉淀靠近核膜边，蛋白质合成下降，由于膜破裂，出现炎症反应。第19页，讲稿共90张，创作于星期三3细胞凋亡与细胞坏死的区别 细胞坏死 细胞凋亡细胞形态 肿胀 皱缩胞 浆 肿胀 浓缩胞 膜 受损 完整、泡状核染色质 染色质不规则,移位 浓缩聚集核膜周 DNA断裂方式 不规则 在核小体间整倍性断裂结 局 崩溃 凋亡小体诱导原因 病理 生理或病理基因调控-+炎症反应 有 无第20页，讲稿共90张，创作于星期三 坏死细胞 凋亡细胞第21页，讲稿共90张，创作于星期三第22页，讲稿共90张，创作于
10、星期三第23页，讲稿共90张，创作于星期三细胞凋亡的过程大致分为如下四个阶段：凋亡信号转导 凋亡基因激活 凋亡的执行 凋亡细胞的清除第24页，讲稿共90张，创作于星期三第25页，讲稿共90张，创作于星期三第26页，讲稿共90张，创作于星期三诱导细胞凋亡的因子诱导细胞凋亡的因子 物理性因子：射线物理性因子：射线(紫外线紫外线 X X射线等射线等)，较温和的，较温和的温度刺激温度刺激(如热激如热激 冷激冷激)等等 化学及生物因子：活性氧基团和分子化学及生物因子：活性氧基团和分子,DNA,DNA和蛋白质和蛋白质合成的抑制剂合成的抑制剂,激素激素,细胞生长因子缺失细胞生长因子缺失,肿瘤坏死因子肿瘤坏死
11、因子（TNF)TNF)第27页，讲稿共90张，创作于星期三 细胞凋亡的分子调控机理 线虫（线虫（C.clengansC.clengans）凋亡研究发现）凋亡研究发现ced3 ced3、ced4ced4基因促进基因促进细胞凋亡，细胞凋亡，ced9ced9基因阻止基因阻止ced3 /ced4ced3 /ced4的激活，抑制细胞凋亡。的激活，抑制细胞凋亡。Ced3Ced3哺乳类同源物是哺乳类同源物是ICEICE（interleukininterleukin1 1convering convering enzymeenzyme）即即Caspase-1Caspase-1 Ced4 Ced4 哺乳类同源物
12、哺乳类同源物 9797年被证实为年被证实为Apaf-1(apoptosis Apaf-1(apoptosis protease activting factor)protease activting factor)一种细胞凋亡蛋白酶活化因子）一种细胞凋亡蛋白酶活化因子）Ced-9 Ced-9哺乳类对应物较早证实为哺乳类对应物较早证实为Bcl-2Bcl-2 总结总结:ced3:ced3杀手基因杀手基因 ced4ced4即使杀手基因又是存活基因且为两者的联系因即使杀手基因又是存活基因且为两者的联系因子子 ced9ced9存活基因存活基因 第28页，讲稿共90张，创作于星期三细胞凋亡的信号转导途径细
13、胞凋亡的过程：接受凋亡信号凋亡调控子间的相互作用 Caspase激活和级联反应 死亡底物的活化细胞凋亡细胞凋亡信号转导的两大途径：由死亡受体(Fas、TNFR)介导的外源途径。在这条途径中，caspase-8首先被激活；线粒体介导的内源途径。在这条途径中，caspase-9首先被激活。细胞凋亡后期的共同途径：Caspase的激活。第29页，讲稿共90张，创作于星期三 凋亡过程如何发生？第30页，讲稿共90张，创作于星期三CaspaseCaspase致细胞凋亡变化机制致细胞凋亡变化机制1凋亡抑制物凋亡抑制物 正常活细胞核酸酶和抑制物结合正常活细胞核酸酶和抑制物结合 CAD-ICAD CAD-IC
14、AD，CaspaseCaspase激活的脱激活的脱氧核糖核酸酶（氧核糖核酸酶（caspase-activateddeoxyribonuleaseCADcaspase-activateddeoxyribonuleaseCAD）2 2破坏细胞结构破坏细胞结构 核纤层蛋白核纤层蛋白(核膜的骨架结构核膜的骨架结构)作为底物被作为底物被CaspaseCaspase裂解裂解 染色质染色质的固缩的固缩3 3调节蛋白丧失功能调节蛋白丧失功能 作用于几种与细胞骨架调节有关的酶或蛋白，改变细胞结构作用于几种与细胞骨架调节有关的酶或蛋白，改变细胞结构 DNA DNA修复有关的酶、修复有关的酶、mRNAmRNA剪切蛋
15、白和剪切蛋白和DNADNA交联蛋白交联蛋白第31页，讲稿共90张，创作于星期三 胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径 一、死亡受体介导的凋亡途经（外源途径）一、死亡受体介导的凋亡途经（外源途径）死死亡亡受受体体均均属属于于肿肿瘤瘤坏坏死死因因子子受受体体（TNFRTNFR）超超家家族族，它它们们与与相相应应的的配配体体（LigandLigand）结结合合后后信信号号分分子子相相互互聚聚集集并并于于细细胞胞内内衔衔接接蛋蛋白白（adapotor adapotor proteinprotein）结结合合，这这些些衔衔接接蛋蛋白白又又募募集集在在受受体体部部Procaspas
16、eProcaspase相相互互活活化化产产生级联反应，使细胞凋亡。生级联反应，使细胞凋亡。第32页，讲稿共90张，创作于星期三 下游Caspase活化后，作用于底物，核纤层蛋白，导致细胞核形成凋亡小体；裂解Dnase结合蛋白，使Dnase释放，降解DNA形成DNA ladder；裂解参与细胞连接或附着的骨架和其他蛋白,使凋亡细胞皱缩、脱落，便于细胞吞噬；导致膜质PS重排,便于吞噬细胞识别并吞噬。TNFR超家族成员及其配体分子主要包括 Fas(又称CD95)/FasL、TNFR/TNF、DR3及TRAILR/TRAIL。第33页，讲稿共90张，创作于星期三死亡受体介导的凋亡途经示意图第34页，讲
17、稿共90张，创作于星期三二、线粒体介导的凋亡途经 线粒体不仅是细胞能量代谢的中心，而且在起源于细胞内部的死亡信号所诱导的细胞凋亡中处于中心位置。这些细胞内部的死亡信号源自 各种因素，如DNA损伤、氧化压力、X-射线、化疗药物、营养缺乏等 等。因而，线粒体所介导的凋亡途径又称为细胞凋亡的内源途径，其过程大致如下:1线粒体渗透转运孔（PTP）的开放和线粒体跨膜电位（）的消失，Bcl-2Bcl-2家家族族蛋蛋白白对对于于PTPT孔孔的的开开放放和和关关闭闭起关键的调节作用起关键的调节作用2.细胞色素c从线粒体中的释放和Caspase-9的激活.第35页，讲稿共90张，创作于星期三 凋亡信号转导途径第
18、36页，讲稿共90张，创作于星期三 2004年4月21日，美国科学院宣布，王晓东被选为该院院士，这是美国科学界的最高荣誉。在目前的美国科学院院士中，42岁的王晓东是最年轻的一位。主要研究领域：细胞凋亡的生化途径。第37页，讲稿共90张，创作于星期三凋亡的调控 细胞凋亡是多基因严格控制的过程。这些基因在种属之间非常保守，如 Caspase家族、Bcl-2家族、抑癌基因P53、IAP家族等。抑制凋亡基因：Bcl-2，IAP（凋亡抑制蛋白）促进凋亡基因：wtP53，Bax，ICE（caspases亚型）双向调控基因：c-myc，Bcl-x第38页，讲稿共90张，创作于星期三一、Caspase是凋亡的
19、执行者Caspase(Cysteine aspartatic acic specific protease)：在特异的天冬氨酸之后切割靶蛋白的一类进化上保守的半胱氨酸蛋白酶。又称半胱天冬酶（胱冬蛋白酶）。1Caspase家族特征Caspase通常以酶原（Procaspase）的形式存在，相对分子质量为29-49kD。N末端具有一个原结构域（Prodomain），C端同源区存在半胱氨酸激活位点，此激活位点结构域为QACX(G、Q或R)G。第39页，讲稿共90张，创作于星期三2.Caspases的分类 根据在细胞凋亡中起的作用，Caspases分为两大类：启始Caspase(Initiator)和
20、效应Caspase(Effector)1）启始Caspases包括-2，-8，-9，-10等，对细胞凋亡的刺激信号作出反应，启动细胞的凋亡过程；2）效应Caspases包括-3，-6，-7等，是在细胞凋亡过程中的具体执行者，完成对特定蛋白底物的水解。第40页，讲稿共90张，创作于星期三CaspaseCaspase活化基本有两种机制，即活化基本有两种机制，即同源活化同源活化和和异源活化异源活化，这两，这两种活化方式密切相关，一般来说后者是前者的结果，发生种活化方式密切相关，一般来说后者是前者的结果，发生同源活化的同源活化的CaspaseCaspase又被称为启动又被称为启动caspase.cas
21、pase.通常通常caspase-caspase-8,10,28,10,2介导死亡受体通路的细胞凋亡，分别被募集到介导死亡受体通路的细胞凋亡，分别被募集到FasFas和和TNFR1TNFR1死亡受体复合物，而死亡受体复合物，而Caspase-9Caspase-9参与线粒体通路参与线粒体通路的细胞凋亡，则被募集到的细胞凋亡，则被募集到Cytc/dATP/Apaf-1Cytc/dATP/Apaf-1组成的凋组成的凋亡体（亡体（apoptosomeapoptosome）。）。异源活化（异源活化（hetero-activationhetero-activation）即由一种）即由一种caspaseca
22、spase活化另一活化另一种种caspasecaspase是凋亡蛋白酶的酶原被活化的经典途径。被异源是凋亡蛋白酶的酶原被活化的经典途径。被异源活化的活化的CaspaseCaspase又称为执行又称为执行caspase.caspase.执行执行CaspaseCaspase不象启动不象启动CaspaseCaspase，不能被募集到或结合起始活化复合体，它们必，不能被募集到或结合起始活化复合体，它们必须依赖启动须依赖启动CaspaseCaspase才能活化。才能活化。第41页，讲稿共90张，创作于星期三图：ICE家族成员 A：3类caspase：蓝色参与炎症反应，红色为执行者，绿色为启动者；B：ca
23、spase-3的结构模型；C：caspase-3的活化过程 引自Katja C.Zimmermann等2001第42页，讲稿共90张，创作于星期三3Caspase激活的机制 非活化的Procaspase（前体）存在，其激活依赖于以其他的caspase在他的天冬位点裂解（释放一个大亚基和一个小亚基，形成四聚体）活化或自身活化。当Caspase-8活化后，他一方面作用于Procaspase3，另一方面使Bid裂解成两个片段，其中含BH3结构域的C-端被运送到线粒体，域Bcl-2/Bax的BH3结构域形成复合物，导致细胞色素C释放。Cytc与胞质中ced4同原物Apaf1结合并活化Apaf1，再活化
24、procaspase-9，最后引起凋亡。第43页，讲稿共90张，创作于星期三 Caspase以一种有序的的方式对细胞进行“破坏”，通过切 断细胞与周围的联系，拆散细胞骨架，阻断细胞DNA复制和修复，干 扰mRNA剪切，损伤DNA与核结构，从而使细胞降解为凋亡小体。因此，可以说Caspase在细胞凋亡过程中的作用处于中心地位。第44页，讲稿共90张，创作于星期三 Bcl-2家族、线粒体与细胞凋亡 Bcl-2是一种原癌基因，是ced-9在哺乳动物中的同原物，能诱导细胞凋亡；与线粒体及内质网膜相结合；Bcl-2蛋白羧基末端有一穿膜的结构域，Bcl-2家族成员的基因中，常常含有三个保守的Bcl-2同源
25、区，及BH1，BH2,BH3.第45页，讲稿共90张，创作于星期三二、Bcl-2 基因家族 根据它们对细胞凋亡作用结果的不同，可将Bcl-2家族成员分为两类：一类能抗细胞凋亡，如Bcl-2、Bcl-xL、Al、Bcl-w、Mcl-1。在这类分子 中，都含有Bcl-2同源区1-4(Bcl-2 homology domains，BH1-BH4)的结构。另一类能促进细胞凋亡，有Bax、Bak、Bcl-xS、Bik、Bad、Bid、Hrk。在这类分子中，根据它们的结构特点，又分为两个亚族：Bax亚族，如 Bax、Bak、Bok，都有BH1、BH2和BH3的结构；BH3-only亚族（只有BH3的结构）
26、，如 Bik、Bad、Bid、Hrk，。第46页，讲稿共90张，创作于星期三 图Bcl-2家族 引自Katja C.Zimmermann等2001第47页，讲稿共90张，创作于星期三Bcl-2 基因家族的结构特征抑制细胞凋亡所必需抑制细胞凋亡所必需促进细胞凋亡所必需促进细胞凋亡所必需第48页，讲稿共90张，创作于星期三summarysummaryBcl-2Bcl-2家族各成员可以形成二聚体，二聚体中的某一单体对另一家族各成员可以形成二聚体，二聚体中的某一单体对另一单体的功能具有促进或抑制作用。因此某一细胞中抑制因子与激单体的功能具有促进或抑制作用。因此某一细胞中抑制因子与激活因子的比例决定了细
27、胞是否发生凋亡。活因子的比例决定了细胞是否发生凋亡。第49页，讲稿共90张，创作于星期三 IAP(inhibitor of apoptosis protein)为一组具有抑制凋亡作用的蛋白质，首先是从杆状病毒基因组克隆到。在人类中，已发现IAP至少有五种：c-IAP1、c-IAP2、NIAP、XIAP和Survivin。1IAP的特征：IAP家族是哺乳动物体内唯一被发现的Caspase抑制剂。所有的IAP都含有对抗凋亡作用非常重要。三三、IAP家族家族第50页，讲稿共90张，创作于星期三IAP的拮抗蛋白 果蝇中对IAP有拮抗作用的蛋白：Reaper,Hid and Grim。在哺乳类中,200
28、0年Wang和Vaux领导的两个实验室同时分别发现了Smac和DIABLO。结 果证明为同一蛋白。故称此蛋白为Smac/DIABLO。Smac/DIABLO在凋亡中的两个功能：i）结合在IAP上，拮抗IAP的作用，促进凋亡。ii）促使procaspase3从无活性形式切割成成熟形式。研究发现 Smac/DIABLO的N端的7个氨基酸，对其激活caspase3的能力是必须的。此7个氨基酸序列与Reaper,Hid与Grim中的14个氨基酸的序列是保守的。第51页，讲稿共90张，创作于星期三四、P53基因家族1P53基因（分子警察）p53并非为所有细胞的凋亡过程所必需，但对DNA损伤而诱发的细胞凋
29、亡却是必不可少的。1）p53的两大功能：使细胞在G1期停滞。当DNA由于各种原因损伤后，p53首先诱导细胞进 入G 1期，抑制细胞增殖，直至损伤的DNA修复。一旦DNA不能被修复，p53就会活化那些诱导细胞凋亡的基因转录，使细胞发生凋亡。野生型P53还可逆转变异细胞为正常细胞。第52页，讲稿共90张，创作于星期三 例如caspase-8切割胞质促凋亡蛋白Bid。Bid是 Bcl-2家族中只包含BH3 domain 的亚家族中的一员。Bid经切割后转移至线粒体膜，和Bad结合，诱导 细胞色素c（cytochrome c）从线粒体中释放出来。Cytochrome c再依次使Apaf-1激活case
30、pase-9。在多数情况下这种交叉是少见的，两条通路一般独立发挥作用。线粒体和死亡受体凋亡通路紧密结合线粒体和死亡受体凋亡通路紧密结合第53页，讲稿共90张，创作于星期三细胞凋亡检测一、Annexin V-FITC(结合膜表PS实验）二、细胞培养液LDH活性检测三、核DNA片段检测 1.DNA Ladder 2.Tunel 法（优点：原位标记，定量分析）四、形态学鉴定镜检（DNA特异性染料Hochest33342，33258，DAPI)五、细胞凋亡反应核心因子检测六、流式细胞分析（Heochst 33342/PI双染色法）注：Annexin V-FITC是一种标记有荧光素的钙依赖磷脂结合蛋白，
31、与磷脂酰丝氨酸有很高的亲和力，可特异性的与磷脂酰丝氨酸结合。第54页，讲稿共90张，创作于星期三第55页，讲稿共90张，创作于星期三第56页，讲稿共90张，创作于星期三第57页，讲稿共90张，创作于星期三流式细胞术分析细胞周期时相实验原理 流式细胞仪（Flow Cytometry FCM）的工作原理是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。细胞内的DNA含量随细胞周期进程发
32、生周期性变化，如G0/G1期的DNA含量为2C，而G2期的DNA含量是4C。利用PI标记的方法，通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。第58页，讲稿共90张，创作于星期三神经细胞凋亡（体外培养）的研究模型与应用1 神经营养因子的撤除与神经细胞凋亡的诱导 神经生长因子（NGF)，脑源性神经生长因子（BDNF）在神经系统发育中重要作用，维持神经元存活和功能。可用无生长因子、无血清培养基、或加入生长因子抗体制作诱导凋亡模型。2 低钾引起的细胞凋亡（培养小脑粒细胞 KCl浓度小于5mmol/l）3 一氧化氮与细胞凋亡 神经元、内生型皮细胞、胶质细胞和巨噬细胞损伤
33、后均可产生iNOS（诱生型一氧化氮合酶）。缺血性损伤可激活NO合酶。加入NO供体（如硝普纳）可诱导细胞凋亡。第59页，讲稿共90张，创作于星期三第60页，讲稿共90张，创作于星期三4 氧化损伤与神经细胞凋亡 原理同前，过量活性氧（reactive oxygen sppecies ROS）包括氧自由基和过氧化氢，引起氧化应急损伤。脑组织对氧化损伤尤为敏感。神经细胞凋亡被证实是缺血再灌注死亡经神主要形式。氧化损伤参与急慢性神经退行性疾病发生发展过程。AD中A-beta（淀粉样蛋白）沉积诱导氧自由基形成和氧化损伤。暴露于过量过氧化氢或凋亡。提供NO供体诱导5 蛋白磷酸酶和蛋白激酶抑制剂与细胞凋亡蛋白
34、磷酸酶抑制剂抑制蛋白磷酸化，破坏蛋白功能，细胞死亡。神经细胞中，藻毒素（OA)可使tau蛋白磷酸化，突触结构改变。第61页，讲稿共90张，创作于星期三6 DNA损伤制剂与核苷（阿糖胞苷）7 钙离子的神经毒作用 线粒体内钙超负荷，引起线粒体膜通透性改变，细胞色素C释放，激活Caspase。8 兴奋型神经递质的神经毒作用 谷氨酸浓度过高，神经毒作用，机制可能与钙离子浓度升高、自由基形成。半胱氨酸蛋白酶（caspase）激活等有关。9 beta淀粉样蛋白与神经细胞凋亡10 脂类与细胞凋亡11 紫外线照射与细胞凋亡第62页，讲稿共90张，创作于星期三神经细胞凋亡形态学检测1 台盼兰排斥实验测定细胞膜完
35、整性 台盼蓝(Trypan Blue)是检测细胞膜完整性最常用的生物染色试剂。健康的正常细胞能够排斥台盼蓝，而死亡的细胞，膜的完整性丧失，通透性增加，细胞可被台盼蓝染成蓝色。依据此原理，细胞经台盼蓝染色后，可通过显微镜，直接镜下计数或拍照后计数，实现对细胞存活率比较精确的定量分析。第63页，讲稿共90张，创作于星期三 2 细胞Hoechst染色 Hoechst 33342是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。正常细胞膜，Hoechst 33342能少许进入染上低蓝色。凋亡细胞的膜通透性增强，进入凋亡细胞中的Hoechst 33342较正常细胞多，荧光强度较高。此外，细胞凋亡后D
36、NA的结构改变使染料更有效地结合DNA，并且凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵损伤不能染料排出都使凋亡细胞的蓝色荧光增强。而PI染料是不能进入细胞膜完整的正常细胞和凋亡细胞中，即活细胞对PI染料拒染，而坏死细胞由于膜完整性在早期即已破损，可被PI染料染色。第64页，讲稿共90张，创作于星期三 根据这些特性，用Hoechst 33342结合PI染料对凋亡细胞进行双染色，就可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来。在双变量流式细胞仪的散点图上，这三群细胞表现分别为：正常细胞为低蓝色/低红色（Hoechst 33342+/PI+），凋亡细胞为高蓝色/低红色（Hoechst 33342+/PI+
37、），坏死细胞为低蓝色/高红色（Hoechst 33342+/PI+）。第65页，讲稿共90张，创作于星期三荧光染料标记（Hocest、PI）的凋亡细胞（染色质凝聚）第66页，讲稿共90张，创作于星期三3 细胞质和细胞核的分化染色 细胞核用酸性染料染色，细胞质这用碱性染料着色。可同时观察细胞质和细胞核的形态学变化。4 细胞膜磷脂酰丝氨酸暴露 由于Annexin V-FITC(fluuorescein isothiocyanate)也可标记坏死细胞，不特异。结合PI区分坏死及凋亡细胞。Annexin V-FITC阳性且PI着色提示为坏死细胞。Annexin V-FITC隐性且PI未染色提示为正常细
38、胞。Annexin V-FITC阳性且PI无染色提示为凋亡早期细胞。（Annexin V-FITC阳性呈细胞表面绿色荧光，PI染色呈胞浆红色).5 扫描电子显微镜观察方法6 透射电镜观察方法第67页，讲稿共90张，创作于星期三 原位末端标记（TUNEL法）实验原理 细胞凋亡中染色体DNA的断裂是分阶段、渐进的过程，染色体DNA首先在内源性核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段，然后在Ca2+和Mg2+依赖的核酸内切酶作用下，大约30的染色体DNA在核小体单位之间被随机切断，形成180-200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口即可产生一系列DNA的3-OH末端
39、。在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物可标记到DNA的3-OH末端，通过酶显色反应来进行凋亡细胞的识别和检测称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL TdT-mediated dUTP nick end labeling）第68页，讲稿共90张，创作于星期三 原位细胞凋亡检测（TUNEL法）原理第69页，讲稿共90张，创作于星期三原位细胞凋亡检测（TUNEL法）实验程序第70页，讲稿共90张，创作于星期三第71页，讲稿共90张，创作于星期三实验试剂1 TUNEL-POD试剂盒（Roch公司，批号:
40、11684817910）试剂1:末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT酶）试剂2:含有核苷酸混合液的反应液试剂3:酶标记抗荧光素抗体2 DAB 试剂盒（北京中山金桥公司）试剂：Tris-HCl缓冲液试剂B：DAB溶液试剂C：过氧化氢溶液 3脱氧核糖核酸酶I（15000U Sigma公司）第72页，讲稿共90张，创作于星期三主要试剂的配制1 0.2M A液和0.2M B液A液：称取NaH2PO42H2O（分子量136.08）27.6g，双蒸水溶解后倒入1000ml容量瓶中，加双蒸水至终刻度。B液：称取Na2HPO412H2O（分子量358.14）71.628g，双蒸水溶解后倒入1000ml容量瓶中,加双
41、蒸水至终刻度。2 0.2 mol/L PB液 取A液19ml，B液81ml，充分混合，室温保存。第73页，讲稿共90张，创作于星期三3 0.01mol/L PBS缓冲液取NaCl 8.5-9g及0.2 mol/L PB 50ml加入1000ml容量瓶中，加双蒸水至1000ml充分摇匀，室温保存。4 0.1mol/L HCl溶液取0.84ml浓盐酸（HCl比重1.19，含量37%）加蒸馏水至100ml，充分混合，室温保存。5 100mmol/L Tris-HCl取Tris 3.025g（Tris三羟甲基氨基甲烷，分子量为121.14）溶于200ml双蒸水中充分搅拌溶解，用浓盐酸约3ml调节pH值
42、至6.4，最后加双蒸水定容至250ml，棕色瓶装，室温保存。第74页，讲稿共90张，创作于星期三7 0.1%DEPC水1mlDEPC（二乙基焦碳酸酯）原液加入1000ml单蒸水中，间歇剧烈振荡，避光室温静置12h以上。8 20g/ml蛋白酶K 1mg/ml储备液：取蛋白酶K 1mg 加入10mM Tris-HCl（pH7.4-8.0）1ml充分混合后，分装成40份，20储存，用时再冻融；20ug/ml工作液（临用前配制）：取蛋白酶K储备液5l加入10mM Tris-HCl 245l再次稀释，混合均匀。9 3%H2O2-甲醇取3%H2O2 40l，加入2.0ml甲醇中（按1：50），混合均匀，现
43、用现配。第75页，讲稿共90张，创作于星期三实验步骤1 染色前处理（1)玻片预先用多聚赖氨酸或APES进行处理。（包被目的以防止染色中切片脱落）（2)组织固定：常规4%多聚甲醛/0.01M PBS(pH7.0-7.6)或10%中性甲醛固定4h以上，石蜡包埋。（目的最大限度保持组织细胞原有形态结构）（3)石蜡切片常规脱蜡入水 二甲苯、脱蜡各5-10min(脱蜡务必干净)，然后放入100%、95%、90%、80%、70%等各级酒精溶液中各3-5min，再放入蒸馏水中3min。第76页，讲稿共90张，创作于星期三10 TUNEL反应液1液1l；2液 9l，混匀，置于冰上备用。11 二氨基联苯（DAB
44、）溶液1ml单蒸水中加入A液，B液，C液各一滴（约50l）混合均匀，避光保存，30min内使用完。12 5%牛血清白蛋白（BSA）0.5mg牛血白蛋白加入10ml单蒸水中溶解。注意应先加牛血清白蛋白，再加入单蒸水混匀时避免漩涡混匀，4保存。第77页，讲稿共90张，创作于星期三13 脱氧核糖核酸酶I（Dnase I）将15000U Dnase I溶解于0.15M氯化钠溶液（5mg/ml）1ml中，分装成50份，80保存。每份20l，每次取20l 加入0.15M氯化钠溶液中180l再次稀释，现用现配。第78页，讲稿共90张，创作于星期三2 每张切片加一滴或50l新鲜稀释至20g/ml的蛋白酶K（1
45、0mM Tris-HCl 147l加入1mg/ml 蛋白酶K3l），37消化30min，0.01M PBS洗5min3次(细胞涂片和冰冻切片一般不消化或消化10-60s，新鲜石蜡切片消化5-10min，陈旧石蜡切片消化10-30min)。阳性对固定过程中照加入Dnase I室温孵育10min 0.01M PBS洗5min3次。（目的暴露固定过程中因交联作用被遮蔽的蛋白抗原，同时部分消化细胞膜利于后续试剂的进入）第79页，讲稿共90张，创作于星期三3 0.1%DEPC水浸泡，室温30min。0.01M PBS洗5min3次。（目的减少消除外源性核酸内切酶造成的假阳性）4 标记 甩去切片上多余液体
46、，标本片擦干组织及周边水分，按每张切片滴加凋亡试剂盒1液和2液（按照1：9比例，在一次性PE手套上配制，多次抽吸，混合均匀）配成TUNEL反应混合液（冰上操作）；阴性对照组只加入试剂2液，而不加1液；标本上覆盖塑料盖片，置样品于湿盒中，37标记1h，4过夜（20h以上）。0.01M PBS洗5min3次。(目的荧光素标记的寡核苷酸在TdT酶作用下与凋亡细胞内断裂的DNA片段结合）第80页，讲稿共90张，创作于星期三5 新鲜配制3%H2O2-甲醇，室温孵育15min。0.01M PBS液洗涤5min3次。（目的封闭内源性的过氧化物酶）6 每张切片加5%牛血清白蛋白封闭液50l，37 30min，
47、甩掉封闭液，不洗。（目的封闭醛固定后醛基和生物负电荷)7 每张切片滴加转化剂POD 50l；置样品于湿盒中，37孵育40min；0.01M PBS洗5min3次。（目的辣根过氧化物酶标记的抗体与已标记的断裂DNA片段结合)第81页，讲稿共90张，创作于星期三8 DAB显色，室温，显微镜下观察5-10min；单蒸水终止显色，流水冲洗10min（冲净附着在标本上的DAB显色液颗粒）。9 苏木素轻度复染。10 常规脱水，透明，封片，显微镜观察。第82页，讲稿共90张，创作于星期三实验中的试剂及仪器设备第83页，讲稿共90张，创作于星期三实验结果分析 判断标准：TUNEL反应阳性产物定位在胞核。细胞核
48、内呈棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡的细胞。苏木素复染核为蓝色者，为阴性正常细胞。（以全横断术后3天脊髓及大脑皮质为例）第84页，讲稿共90张，创作于星期三实验结果分析1 阳性对照及实验片阴性 核对试剂是否按步骤加入，有无漏加，试剂孵育条件和时间是否充分。或调整蛋白酶K的条件。2 阳性对照有结果而实验片无 对实验片的操作有误，或可能组织中无此蛋白的表达，重复实验验证结果。3 阴性对照有结果 是否误加入了试剂1，或其他组织标本试剂1的污染。第85页，讲稿共90张，创作于星期三 实验结果图图-1-1 全横断全横断3 3天脊髓天脊髓 阴性对照阴性对照 (50(50)图图-2-2 全横断全横断3 3天脊
49、髓天脊髓 阳性对照（阳性对照（400400)图图-2-图图-1第86页，讲稿共90张，创作于星期三 实验结果图图-3图图-4图图-3 3 全横断全横断3 3天脊髓天脊髓 阳性对照阳性对照 (50(50)图图-4 4 全横断全横断3 3天脊髓天脊髓 阳性对照阳性对照 (400(400)第87页，讲稿共90张，创作于星期三凋亡细胞形态不一，典型呈核内散在分布棕黄色颗粒，贴附在核膜周边，部分呈花瓣状，月牙状，紧贴核膜，部分染色质浓聚在核一端。可观察到典型的凋亡小体，外观呈枭眼状，核仁深染，核膜完整或不完整。图图-5图图-6图图-6-6 全横断全横断3 3天大脑皮质凋亡椎体细胞（天大脑皮质凋亡椎体细胞
50、（400400)图图-5-5 全横断全横断3 3天脊髓凋亡神经元（天脊髓凋亡神经元（400400）实验结果实验结果第88页，讲稿共90张，创作于星期三实验注意事项1.阳性对照可使用Dnase I部分降解的标本。阴性对照不加TdT酶，其余步骤与实验组相同。2.石蜡切片抗原修复宜采用蛋白酶K修复，此方法较微波修复好（因微波修复可导致DNA断裂损伤），可降低假阳性发生率。3.使用现配的H2O2-甲醇溶液，此步骤宜在TUNEL标记之后（H2O2可导致DNA损伤）。4.TUNEL反应混和液配制应在冰盒内操作，现配现用，避免反复冻融。5.根据标本类型决定孵育时间和浓度（蛋白酶K、TdT），保证最佳效果。6