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1、关于关于酶联免疫吸附免疫吸附试验检测伤寒寒O抗体抗体现在学习的是第1页，共21页Company Logo摘要摘要v目的：检测伤寒目的：检测伤寒O抗体一般采用肥达实验（直抗体一般采用肥达实验（直接凝集实验），在临床诊断中有重要的意义。接凝集实验），在临床诊断中有重要的意义。能否建立一个用酶联免疫吸附法检测血清中抗能否建立一个用酶联免疫吸附法检测血清中抗伤寒伤寒“O”抗体的实验体系，提高临床诊断效抗体的实验体系，提高临床诊断效果是本实验要解决的关键问题。果是本实验要解决的关键问题。现在学习的是第2页，共21页v原理：以伤寒原理：以伤寒O抗原免疫动物，制备出抗伤寒抗原免疫动物，制备出抗伤寒O抗抗体，
2、将后者纯化，与酶连接制备成酶标抗体，以体，将后者纯化，与酶连接制备成酶标抗体，以伤寒伤寒O抗原包被酶标板，以制备的伤寒酶标抗体抗原包被酶标板，以制备的伤寒酶标抗体为竞争抗体，可以构成竞争法检测伤寒抗体的酶为竞争抗体，可以构成竞争法检测伤寒抗体的酶联免疫实验。联免疫实验。摘要摘要现在学习的是第3页，共21页v 摘要摘要结果：成功建立了一个酶联免疫吸附试验检测伤结果：成功建立了一个酶联免疫吸附试验检测伤寒寒O抗体的实验体系抗体的实验体系结论：酶联免疫吸附法可以检测血清中抗伤寒结论：酶联免疫吸附法可以检测血清中抗伤寒“O”抗体抗体现在学习的是第4页，共21页Company Logo实验方法实验方法实
3、验材料：实验材料：实验动物实验动物：家兔（家兔（1.性格温顺，一般不咬人，但其爪性格温顺，一般不咬人，但其爪锐利，挣扎时易抓伤操作人员锐利，挣扎时易抓伤操作人员 2.与伤寒沙门菌种属与伤寒沙门菌种属差异大，可保证产生抗体差异大，可保证产生抗体 3.体重大，血量多，得到的体重大，血量多，得到的血清可保证实验顺利进行）血清可保证实验顺利进行）实验试剂：饱和硫酸铵溶液实验试剂：饱和硫酸铵溶液 PBS透析液透析液 辣根过氧化物辣根过氧化物酶酶(HRP)NaIO4溶液溶液 2.5%乙二醇溶液乙二醇溶液 硼氢化钠溶硼氢化钠溶液液 包被稀释液包被稀释液 酶标抗体酶标抗体 待测抗体待测抗体 稀释液稀释液 洗涤
4、洗涤液液 底物液底物液实验器材：兔笼实验器材：兔笼 透析膜透析膜 离心机离心机 加样器加样器 酶标板酶标板现在学习的是第5页，共21页Company Logo实验步骤实验步骤1234制备伤寒制备伤寒O抗体抗体 纯化纯化 抗体抗体 酶与抗体酶与抗体的连接的连接 ELISA竞争检测竞争检测伤寒伤寒O抗抗体（预实验体（预实验和正式实验）和正式实验）现在学习的是第6页，共21页制备伤寒制备伤寒O抗体抗体颗粒性抗原伤寒杆菌颗粒性抗原伤寒杆菌备注备注第一周第一周第一天第一天耳缘静脉注射耳缘静脉注射0.1ml0.1ml之前取血之前取血0.7-0.7-1ml1ml，分离血清，分离血清，待用待用第二天第二天耳缘
5、静脉注射耳缘静脉注射0.2ml0.2ml第三天第三天耳缘静脉注射耳缘静脉注射0.2ml0.2ml第四天第四天耳缘静脉注射耳缘静脉注射0.5ml0.5ml第二周第二周加强免疫：皮下注射加强免疫：皮下注射1.0ml1.0ml（两（两侧各侧各0.5ml0.5ml）第三周第三周耳中央动脉采血，分离血清耳中央动脉采血，分离血清现在学习的是第7页，共21页纯化抗体纯化抗体 1份血清（份血清（5ml）+1份生理盐水份生理盐水+2份饱和硫酸铵份饱和硫酸铵 置试管中置试管中 2000转离心转离心20min 弃上清弃上清 1.52ml NS 溶解沉淀溶解沉淀 透析透析24h 收集、标记、冰冻收集、标记、冰冻 5管
6、管缓缓摇动缓缓摇动 ,室温室温2h（1.5h）盐析法盐析法现在学习的是第8页，共21页酶与抗体的连接酶与抗体的连接实验原理：实验原理：NaIO4NaIO4是强氧化剂，能将是强氧化剂，能将HRPHRP的甘露糖部分（与酶活性无的甘露糖部分（与酶活性无关的部分）的羟基氧化成醛基，然后与抗体的氨基结合，形成酶标关的部分）的羟基氧化成醛基，然后与抗体的氨基结合，形成酶标抗体，反应式如下：抗体，反应式如下：实验方法：实验方法：标记过程：标记过程：1.将将HRP 5mgHRP 5mg溶于溶于0.5 ml PH5.6 HAC-NaAc 0.5 ml PH5.6 HAC-NaAc 缓冲液中（老师做）。缓冲液中（
7、老师做）。2.2.滴入滴入NaIO4 0.25ml,NaIO4 0.25ml,此时酶的颜色由黄变绿。此时酶的颜色由黄变绿。4 4作用作用30min30min。现在学习的是第9页，共21页酶与抗体的连接酶与抗体的连接3.3.加入加入2.5%2.5%乙二醇溶液乙二醇溶液0.5ml0.5ml（稳定剂）终止反应，室温（稳定剂）终止反应，室温30min 30min。4.4.加入待标加入待标Ab1.52.0ml,Ab1.52.0ml,用用pH9.5pH9.5碳酸盐缓冲液调整反应液的碳酸盐缓冲液调整反应液的pHpH至至 9.09.0左右，左右，4 4过夜。过夜。5.5.加入加入0.1ml0.1ml硼氢化钠，
8、硼氢化钠，4242小时。小时。6.pH7.4 PBS6.pH7.4 PBS液透析过夜，收集、标记成酶标记抗体和冻存液透析过夜，收集、标记成酶标记抗体和冻存现在学习的是第10页，共21页酶联免疫竞争法检测伤寒酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体抗体v（一）（一）.酶联免疫竞争法检测伤寒酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体预实验抗体预实验1.包被包被Ag：抗原（伤寒）用包被液稀释，每孔加入：抗原（伤寒）用包被液稀释，每孔加入100l，置，置37作用作用4h或或4作用作用24h。2.洗涤：弃去孔中液体，洗涤液洗涤洗涤：弃去孔中液体，洗涤液洗涤3次，每次次，每次1min，于吸水纸上充分，于吸水纸上充分拍干。拍干。3.
9、加入样品：每孔加入酶标加入样品：每孔加入酶标Ab及及Ab各各100l，放入，放入37恒温箱中恒温箱中孵育孵育30min。（如图。（如图1）4.洗涤：同上洗涤：同上5.加入底物液：每孔加入底物液加入底物液：每孔加入底物液A1滴、滴、B1滴，避光放置约滴，避光放置约5-15min，密切观察。，密切观察。6.终止反应终止反应现在学习的是第11页，共21页酶联免疫竞争法检测伤寒酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体抗体 待测待测酶标酶标原液原液1：51：251：125阴性阴性对照对照1：251：501：1001：200（图1）选择每一排阴阳色差最明显者为最佳工作浓度现在学习的是第12页，共21页酶联免疫竞争法检
10、测伤寒酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体抗体v稀释方法：稀释方法：v1.酶标抗体酶标抗体1:251200ul(牛奶）牛奶）+50ul（酶标）（酶标）=1250ul1:50600ul(牛奶）牛奶）+600=1200ul1:100 600ul(牛奶）牛奶）+600=1200ul1:200600ul(牛奶）牛奶）+600=1200ul现在学习的是第13页，共21页酶联免疫竞争法检测伤寒酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体抗体v2.待测抗体待测抗体1:5600ul(牛奶牛奶)+150ul(待测待测)=750ul1:25600ul(牛奶牛奶)+150ul=750ul 1:125600ul(牛奶牛奶)+150ul=75
11、0ul 现在学习的是第14页，共21页酶联免疫竞争法检测伤寒酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体抗体v（二）酶联免疫竞争法检（二）酶联免疫竞争法检测伤寒测伤寒O抗体正式实验抗体正式实验 选取预实验所选定的最佳工作浓度对酶标抗体及待测抗体进行选取预实验所选定的最佳工作浓度对酶标抗体及待测抗体进行稀释，验证该检测方法的可行性。方法如下：稀释，验证该检测方法的可行性。方法如下：1.1.包被包被 2.2.洗涤洗涤 3.3.加样加样(如图如图2)2)4.4.洗涤洗涤 5.5.显色显色 6.6.判断检出率判断检出率现在学习的是第15页，共21页酶联免疫竞争法检测伤寒酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体抗体自己的待测自己的
12、待测Ab100ul+酶标酶标Ab100ul别组的待测别组的待测Ab100ul+酶标酶标Ab100ul稀释液稀释液100ul+酶酶标标Ab100ul 阳性阳性 对照对照 待测待测1 待测待测2 待测待测3 待测待测4 阴性阴性 对照对照图(2)经洗涤显色后经洗涤显色后,根据颜色深浅判断检出率根据颜色深浅判断检出率,若待测组颜色更接近于若待测组颜色更接近于阳性对照阳性对照,则记为则记为“+”+”，反之则记为，反之则记为“-”-”。现在学习的是第16页，共21页结果讨论结果讨论v（一）实验结果（一）实验结果v 阴阴 阳阳现在学习的是第17页，共21页结果讨论结果讨论v 以酶标抗体以酶标抗体1 1：1
13、00100稀释和待测抗体原液为最佳工稀释和待测抗体原液为最佳工作浓度做正式实验，得到以下结果，待测作浓度做正式实验，得到以下结果，待测1“+”1“+”,待测待测2“+”,2“+”,待测待测3“+”,3“+”,待测待测4“+”;44“+”;4组待组待测抗体均被成功检出，检出率测抗体均被成功检出，检出率100%100%。现在学习的是第18页，共21页结果讨论结果讨论v（二）实验讨论（二）实验讨论v伤寒，由伤寒杆菌引起，检测伤寒伤寒，由伤寒杆菌引起，检测伤寒O抗体在伤寒抗体在伤寒杆菌感染的诊断中具有重要意义，采用肥达实验杆菌感染的诊断中具有重要意义，采用肥达实验可对抗体进行半定量检测。但近年来发现，
14、随着可对抗体进行半定量检测。但近年来发现，随着轻型和亚型病人的增多，伤寒杆菌变异株增多，轻型和亚型病人的增多，伤寒杆菌变异株增多，或发病早期大量使用抗生素，抑制伤寒沙门菌或或发病早期大量使用抗生素，抑制伤寒沙门菌或应用肾上腺皮质激素等免疫抑制剂抑制抗体的形应用肾上腺皮质激素等免疫抑制剂抑制抗体的形成，肥达实验阳性率有下降的趋势，难以满足临成，肥达实验阳性率有下降的趋势，难以满足临床要求。床要求。ELISA法检测伤寒杆菌抗原或抗体，灵法检测伤寒杆菌抗原或抗体，灵敏度好、特异性强、二者均达到敏度好、特异性强、二者均达到70%现在学习的是第19页，共21页结果讨论结果讨论v 以上，反应时间短，操作简便，结果易于判断。以上，反应时间短，操作简便，结果易于判断。对伤寒早起诊断，有较高的临床价值，因此，早对伤寒早起诊断，有较高的临床价值，因此，早起诊断以起诊断以ELISA法检测血液中伤寒特异性或抗体法检测血液中伤寒特异性或抗体为依据为依据。现在学习的是第20页，共21页感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第21页，共21页