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1、关于基因的分离与鉴定(2)第1页，讲稿共114张，创作于星期日n DNA克隆片段的产生和分离n 重组体DNA分子的构建及导入受 体细胞n 基因克隆的实验方案n 克隆基因的分离n 重组子的选择与鉴定第2页，讲稿共114张，创作于星期日克隆的概念 克隆克隆,是英文Clone 的音译,它是由一个个体经无性繁殖所产生后代的总称，也可以是指用其它方式产生无性繁殖后代的技术。有两个缺一不可的特征：既是无性生殖，又是遗传同质（相同的遗传物质）。第3页，讲稿共114张，创作于星期日一、目的基因的分离一、目的基因的分离1.从生物基因组分离目的基因n利用基因文库筛选目的基因 基因组文库、cDNA文库n利用mRNA
2、或cDNA钓取目的基因第4页，讲稿共114张，创作于星期日2.利用基因表达产物来获取目的基因n使用探针从cDNA文库中筛选目的基因3.用酶学或化学方法合成目的基因n逆转录酶法合成目的基因nPCR法合成目的基因n化学合成目的基因 胰岛素基因、干扰素基因等市场化第5页，讲稿共114张，创作于星期日二、目的基因的来源1.基因组DNA的非特异性断裂2.染色体DNA的限制性内切酶酶解3.通过mRNA合成cDNA4.人工体外合成DNA片段5.PCR扩增特异性基因片段第6页，讲稿共114张，创作于星期日三、DNA克隆片段分离的方法1.利用限制性内切酶片段化基因组DNA 鸟枪法（shotgun approch
3、）：用限制性内切酶消化给体基因组DNA，这种消化产物，不经过凝胶电泳分部分离，就直接用来同载体分子作连接反应的克隆方法。2.凝胶电泳法和蔗糖梯度离心法分离第7页，讲稿共114张，创作于星期日重组重组DNADNA分子的构建分子的构建第8页，讲稿共114张，创作于星期日构建重组构建重组DNADNA分子的途径分子的途径第9页，讲稿共114张，创作于星期日第10页，讲稿共114张，创作于星期日重组子分子导入受体细胞的途径n转化(transformation)J转染(transfection)J转导（transduction）第11页，讲稿共114张，创作于星期日转化（转化（transformation
4、transformation）：）：将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。第12页，讲稿共114张，创作于星期日转化的方法：转化的方法：1.化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞；2.电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。第1
5、3页，讲稿共114张，创作于星期日感受态细胞感受态细胞(Competent cells):(Competent cells):受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的 载 体 分 子 通 过 的 感 受 态 细 胞(competent cell)第14页，讲稿共114张，创作于星期日转化的原理与技术：转化的原理与技术：Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时
6、的状态叫做感受态第15页，讲稿共114张，创作于星期日Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化100ml菌体培养至OD600600=0.5，离心收集菌体用10 ml冰冷的10 mM CaCl2 2溶液悬浮菌体，离心用1 ml 冰冷的75 mM CaCl2 2溶液悬浮菌体冰浴放置12-24小时，备用大肠杆菌感受态细胞的制备：第16页，讲稿共114张，创作于星期日取100 l 感受态细胞，加入相当于50 ng 载体的重组DNA连接液，混匀冰浴放置半小时在42保温2 分钟（热脉冲）快速将转化细胞转移至冰浴中放置1-2分钟加入1ml新鲜培养基，于37培养1 小时（扩增）涂在合适的固体培养基平板上进行筛选大肠杆
7、菌感受态细胞的质粒转化第17页，讲稿共114张，创作于星期日 革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化细菌原生质体的转化细菌原生质体的转化第18页，讲稿共114张，创作于星期日不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂细菌原生质体的制备第1
8、9页，讲稿共114张，创作于星期日取0.2-1ml的原生质体悬浮液（108-109个原生质体），加入10-20 l DNA重组连接液，同时加入含有PEG1000和Ca2+的等渗溶液，混匀细菌原生质体的再生：原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素细菌原生质体的转化：第20页，讲稿共114张，创作于星期日E.coli的电穿孔转化 在高压电场下使细胞产生瞬间的穿孔，这个穿孔足够大并可维持足够的时间，使外源DNA进入受体细胞。电穿孔法的转化效率比钙转化法高23个数量级。这种方法也可用于真核生物的转染第21页，讲稿共114张，创作于星期日 将待转化的
9、质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内 电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验电穿孔转化电穿孔转化第22页，讲稿共114张，创作于星期日转染转染 是指转化感染（Transfection来自于transfomation与infection）凡是以噬菌体（如M13）或病毒为载体，以转化的方法将DNA导入细胞的方法均称为转染。因此转染就方法来说与转化是一样的。第23页，讲稿共114张，创作于星期日将大肠杆
10、菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养基中培养至OD600=0.5吸附：加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30保温10分钟转染裂解：加入20倍体积的新鲜培养基，30培养2小时，直至培养液中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选噬菌体噬菌体DNA的转染的转染感受态细胞的培养第24页，讲稿共114张，创作于星期日体外包装颗粒的转导 将重组的 噬菌体DNA或重组的柯斯载体DNA经体外包装成具有感染能体力的噬菌体颗粒，然后经由在受体细胞表面上的DNA接受位点，使这些带有目的基因序列的重组体DNA注入大肠杆菌。第25页，讲稿共114张，创作于星期日转化率的定义：转化率是衡量转化效率的重要指标
11、，其定义为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）转化率转化率第26页，讲稿共114张，创作于星期日 例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.4X1011个分子（6.02X1017/2686X660），也就是说，每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pU
12、C18共需2ml感受态细胞，大约含有2X1010个大肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18 DNA第27页，讲稿共114张，创作于星期日 利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模。例如，某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107/g载体，经切接处理后的载体转化率比天然的载体低100倍，欲获得104个重组克隆，需投入多少载体DNA进行重组实验？若重组率为100%，则转化后产生104 4个重组克隆需要：104 4 /107 7 X 10-2-2 =0.1 g 载体DNA考虑到实验系统的重组率为20%，所以实际投入载体应为：0.1/20%=0.5 g
13、载体DNA载体投入量确定后，外源DNA的投入量即可按101的要求算出（5g），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选转化率的用途转化率的用途第28页，讲稿共114张，创作于星期日 载体及DNA重组分子方面：载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同载体的空间构象：质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级插入片段的大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低转化率的影响因素转化率的影响因素第29页，讲稿共114张，创作于星期日 受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌
14、JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高 转化方法方面：受体细胞的预处理：影响最大供受体的比例：Ca2+诱导转化 0.1 ml 感受态细胞 50 ng DNA原生质体转化 109 个原生质体 50 ng DNA转化方法：Ca2+诱导转化106-107/g DNA原生质体转化105-106/g DNA-DNA转染107-108/g DNA电穿孔转化106-109/g DNA第30页，讲稿共114张，创作于星期日扩增操作转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如：Ca2+诱导转化后的37培养一个小时原生质体转化后的再生
15、过程噬菌体转染后的30培养等，均属扩增操作转化细胞的扩增转化细胞的扩增第31页，讲稿共114张，创作于星期日增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选表达外源基因，便于筛选和鉴定扩增操作的目的扩增操作的目的第32页，讲稿共114张，创作于星期日1.基因文库的构建2.cDNA基因克隆3.基因组DNA克隆4.基因定位克隆 基因克隆的实验方案基因克隆的实验方案第33页，讲稿共114张，创作于星期日 基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和生物学功能，或建立高效表达系统，构建具
16、有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。第34页，讲稿共114张，创作于星期日 基因文库（gene library）：用重组DNA技术将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA的所有片段随机地连接在载体上，然后转移到适当的宿主细胞中通过细胞增殖而构成各个片段的克
17、隆。当制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就称为某种生物的基因文库。第35页，讲稿共114张，创作于星期日 同一定义也适用于线粒体或叶绿体的基因文库。由于制备片段的切点是随机的，所以每一克隆内所含的片段即可能是一个或几个基因，也可能是一个基因的一部分或除完整基因外还包含着两侧的邻近顺序。第36页，讲稿共114张，创作于星期日 基因文库的构建就是利用所谓的“鸟抢法”，使基因组的DNA片段随机地插入适当的载体中，引入细胞进行大量繁殖而构建的。第37页，讲稿共114张，创作于星期日鸟枪法克隆目的基因的基本战略第38页，讲稿共114张，创作于星期日鸟枪法克隆目
18、的基因的基本战略染色体染色体DNA的切断的切断超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端 全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有 可能使目的基因断开，大小不可控部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整与载体连接与载体连接如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体第39页，讲稿共114张，创作于星期日转化受体细胞转化受体细胞如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞筛选含有目的基因的目
19、的重组子筛选含有目的基因的目的重组子菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）第40页，讲稿共114张，创作于星期日鸟枪法操作的改进使用特征性限制性内切酶切开染色体使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已目的基因的酶切图谱已知知 如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率第41页，讲稿共114张，创作于星期日在连接前将在连接前将DNA片段进行分级分离片段进行分级分离第42页，讲稿共114张，创作于星期日凝胶凝胶DNA片段回收技术片段回收技术第
20、43页，讲稿共114张，创作于星期日 工作量较大，需要了解目的基因的背景知识工作量较大，需要了解目的基因的背景知识 不能获得的最小长度的目的基因不能获得的最小长度的目的基因 不能除去真核生物目的基因的内含子结构不能除去真核生物目的基因的内含子结构鸟枪法克隆目的基因的局限性第44页，讲稿共114张，创作于星期日基因库（基因库（gene pool）特定生物体全基因组的集合（天然存在）基因文库（基因文库（gene library or gene bank）从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为根据构建方法的不同，基因文库分为：基因组文库
21、（含有全部基因）cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）基因文库的基本概念基因文库的基本概念基因库与基因文库基因库与基因文库第45页，讲稿共114张，创作于星期日用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNA用cDNA法构建cDNA文库，材料来自mRNA 在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA文库等。很显然，cDNA文库的信息量远小于基因组文库基因文库构建的基本战略基因文库构建的基本战略第46页，讲稿共114张，创作于星期日基因文库的完备性是指：基因文库
22、的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：N=ln(1 P)/ln(1 f)其中：P=任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率(一般期望一般期望99%99%)f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小例如，人的单倍体DNA总长为2.9 x 109 bp，基因文库中克隆片段的平均大小为15 kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180万个克隆基因文库的完备性基因文库的完备性第47页，讲稿共114张，创作于星期日For example:期望值为0.99，插入片断为2
23、0kb20kb的的 E.coli(4.6106 bp)和 human(3109 bp)基因组的克隆数的计算N E.coli=1.1 103 ln(1-0.99)ln1-(2104/4.6106)Nhuman=6.9 105 ln(1-0.99)ln1-(2 104/3 109)这个例子说明用质粒载体（插入片断5-10kb）就可以建立很好的原核生物基因文库，只需要几千个克隆；而真核生物则需要更大承载能力的载体。第48页，讲稿共114张，创作于星期日除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力以减轻筛选工作的压力 载体的装载量最好大于基因的
24、长度，避免基因被分隔克隆避免基因被分隔克隆 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序以利克隆排序 克隆片段易于从载体分子上完整卸下 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选基因文库的质量标准基因文库的质量标准第49页，讲稿共114张，创作于星期日 为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性，用于基因组文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高基因组基因组DNA的制备的制备用常规方法制备的染色体用常规方法制备的染色体DNA的长度一般在的长度一般在100 kb左右。如果先将细胞固
25、定在左右。如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有低融点凝胶中，然后置入含有SDS、蛋白酶、蛋白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获的缓冲液中浸泡，可获得得1000 kb大小的大小的DNA片段片段基因文库的构建程序第50页，讲稿共114张，创作于星期日基因组基因组DNA的切割的切割用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区第二，保证DNA片段大小均一 超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如：Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的
26、大小可控 连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！第51页，讲稿共114张，创作于星期日载体和受体的选择载体和受体的选择 为了压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体 由于绝大多数真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒上述几种载体的最大装载量如下：质粒 15 kb-DNA 25 kb考斯质粒 45 kbBAC 300 kbYAC 400 kb用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌第52页，
27、讲稿共114张，创作于星期日 大型基因组文库一般由数十万甚至上百万个重组克隆组成。除了一些具有特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因、结合蛋白编码基因等）可以采用特殊的正选择筛选程序（如抗药性筛选法、酵母双杂交技术等）直接筛选外，一般的基因组文库筛选均需多轮操作步骤从基因文库中筛选目的基因从基因文库中筛选目的基因第53页，讲稿共114张，创作于星期日从基因文库中筛选目的基因从基因文库中筛选目的基因第54页，讲稿共114张，创作于星期日基因文库构建的技术性问题基因文库构建的技术性问题在基因组文库的构建过程中，最应引起重视的问题是：严禁外源DNA片段之间的连接！为了避免上述情况的发生，可采取下列措
28、施的组合：将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离 用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基团 用TdT酶在DNA片段的末端上增补同聚尾末端第55页，讲稿共114张，创作于星期日cDNAcDNA基因克隆基因克隆cDNA libraries第56页，讲稿共114张，创作于星期日cDNA基因克隆 cDNA文库是指得到足够多的分别克隆的cDNA片段，汇集这些克隆应包含某种细胞中各种mRNA的相应顺序，每种顺序至少有一份拷贝，这种克隆片段的汇集体称为某种细胞的cDNA文库。第57页，讲稿共114张，创作于星期日 cDNA librariesmRNA isolation,purificationC
29、heck the RNA integrity Fractionate and enrich mRNA Synthesis of cDNA Treatment of cDNA ends Ligation to vector第58页，讲稿共114张，创作于星期日cDNA文库特点文库特点1.1.没有原核生物的没有原核生物的cDNA cDNA 文库文库2.2.原核生物的原核生物的 mRNA mRNA 非常不稳定；非常不稳定；3.3.原核生物的基因组文库比较容易构原核生物的基因组文库比较容易构建，能包含所有基因的序列。建，能包含所有基因的序列。第59页，讲稿共114张，创作于星期日2.2.cDNA cD
30、NA 文库对于真核生物的基因分析文库对于真核生物的基因分析3.3.cDNAcDNA文库是只含有编码蛋白的基因文库文库是只含有编码蛋白的基因文库4.4.cDNAs cDNAs 没有内含子没有内含子 基因可以在基因可以在E.coliE.coli 中直接中直接表达表达5.5.用于新基因的鉴别用于新基因的鉴别6.6.组织或特殊类型细胞（基因的特异表达）组织或特殊类型细胞（基因的特异表达）第60页，讲稿共114张，创作于星期日cDNA cDNA 文库文库-mRNA-mRNA 分离分离 大部分真核生物的 mRNAs 有 3 poly（A）尾巴 oligo(dT)能与poly(A)尾巴互补，由此来获得mRN
31、A.AAAAAAAAAAn5 cap5 cap第61页，讲稿共114张，创作于星期日第62页，讲稿共114张，创作于星期日用纤维素纯化poly(A)mRNA的流程图第63页，讲稿共114张，创作于星期日方法:mRNAmRNA的翻译的翻译:用体外蛋白质合成检测mRNAs。（麦胚无细胞转译体系或兔网织细胞裂解物转译体系）通过凝胶电泳分析通过凝胶电泳分析mRNAs mRNAs:用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳cDNA cDNA 文库文库-检测检测mRNAmRNA的完整性的完整性确定确定 mRNA 没被降解没被降解第64页，讲稿共114张，创作于星期日克隆特殊的克隆特殊的 mRNAsmRNAs克隆一个特殊
32、的基因比建立完整的cDNA文库更有用凝胶分离凝胶分离:通过琼脂糖凝胶电泳回收 mRNAsmRNAs（根据（根据mRNAmRNA的大小）的大小）富集富集:通过杂交来实现第65页，讲稿共114张，创作于星期日cDNA法克隆目的基因的基本战略cDNA第一链的合成第一链的合成G5PPP5GAAAAAAAAOH3引物引物退火退火mRNA逆转录酶逆转录酶dNTPG5PPP5GAAAAAAAAOH3G5PPP5GAAAAAAAAOH3TTTTTTTTTp5TTTTTTTTTp5第66页，讲稿共114张，创作于星期日自身引导法自身引导法：获得的双链：获得的双链cDNA 5 端会有几对碱基缺失端会有几对碱基缺失
33、cDNA第二链的合成第二链的合成G5PPP5GAAAAAAAAOH3TTTTTTTTTp5NaOH煮沸TTTTTTTTTp5OH3KlenowdNTPsTTTTTTTTTp5AAAAAAAAOH3S1AAAAAAAAOH3TTTTTTTTTp5第67页，讲稿共114张，创作于星期日置换合成法：置换合成法：获得的双链获得的双链cDNA 5端也会有几对碱基缺失端也会有几对碱基缺失cDNA第二链的合成第二链的合成G5PPP5GAAAAAAAAOH3TTTTTTTTTp5RNaseHDNApol dNTPTTTTTTTTTp55TTTTTTTTTp5S1T4DNAligaseTTTTTTTTTp5AA
34、AAAAAAOH3第68页，讲稿共114张，创作于星期日引导合成法：引导合成法：获得的双链获得的双链cDNA 能保留完整的能保留完整的5端序列端序列cDNA第二链的合成第二链的合成核酸末端转移酶核酸末端转移酶G5PPP5GAAAAAOH3TTTTTTp5TdTdCTPG5PPP5GAAAAACCCCCCOH3CCCCCC3OHTTTTTp5NaOHTTTTTp5CCCCCC3OH退火TTTTTp5CCCCCC3OH5PGGGGGGklenowdNTPsTTTTTp5CCCCCC3OH5PGGGGGGAAAAAOH3第69页，讲稿共114张，创作于星期日对对cDNA cDNA 末端的处理末端的处
35、理平末端的片断需要加入特殊的核苷酸序列形成粘性末端，才能进平末端的片断需要加入特殊的核苷酸序列形成粘性末端，才能进行克隆行克隆步骤步骤:移去突出的移去突出的 3-ends(strand-special nuclease)填充缺失填充缺失 3 核苷酸核苷酸(klenow fragment of DNA polyI and 4 dNTPs)衔接物和平末端的连接衔接物和平末端的连接(T4 DNA ligase)限制性内切酶的消化限制性内切酶的消化(E.coRI)第70页，讲稿共114张，创作于星期日与载体的连接与载体的连接 任何一个含有任何一个含有E.coRIE.coRI 酶切位点的载体都可以用来克
36、隆酶切位点的载体都可以用来克隆cDNAcDNA步骤步骤:载体末端脱磷酸（碱性磷酸酶）载体末端脱磷酸（碱性磷酸酶）用用T4 DNA T4 DNA 连接酶连接连接酶连接 载体载体 和和 cDNAcDNA(plasmid or l l phage vector)第71页，讲稿共114张，创作于星期日 提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部克隆，然后借助于合适的筛选手段找到目的重组子 筛选时，若使用的是多拷贝载体，则采用菌落原位杂交法筛选；若使用的是表达型载体，则采用菌落免疫杂交法筛选 完备分离程序适用于mRNA分子数少的目的基因的克隆，如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子VIII基因等 cDN
37、A法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序完备分离程序完备分离程序第72页，讲稿共114张，创作于星期日cDNA法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序 提取细胞总mRNA，琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标mRNA，由此合成双链cDNA，然后进行克隆 特异分离程序较适用于mRNA丰度极高的目的基因克隆。如血红蛋白基因等特异分离程序特异分离程序第73页，讲稿共114张，创作于星期日 利用两组细胞mRNA种类的差异，分离克隆差异mRNA所对应的cDNA，因而这种程序较适用于分离克隆新基因例如：正常的大鼠FR3T3成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任
38、务是要分离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能cDNA法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序差异分离程序差异分离程序第74页，讲稿共114张，创作于星期日差异分离程序差异分离程序多瘤病毒感染的FR3T3细胞正常的FR3T3细胞提取mRNA总mRNA共价交联提取mRNA总mRNA合成cDNAcDNA合成第二链单链cDNA克隆原位杂交病毒诱导表达的cDNA克隆上柱双链双链cDNA第75页，讲稿共114张，创作于星期日 1.以mRNA为材料；（一些RNA病毒，不经过DNA中间体，对其研 究，cDNA是唯一可行的方法）2.与基因文库的筛选比较，更简单易行；3.由于每一个cDNA克隆都含有一种
39、mRNA序列，在选择中出现假阳性的几率比较低；4.克隆在细菌中表达的基因，用作基因序列的测定 和发育过程中或组织中基因特异表达 cDNA克隆的优越性克隆的优越性第76页，讲稿共114张，创作于星期日 并非所有的并非所有的mRNA分子都具有分子都具有polyA结构结构 细菌或原核生物的细菌或原核生物的mRNA半衰期很短半衰期很短 mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难分离纯化困难 仅限于克隆蛋白质编码基因仅限于克隆蛋白质编码基因cDNA法克隆目的基因的局限性法克隆目的基因的局限性第77页，讲稿共114张，创作于星期日基因组基因组DNADNA克隆克
40、隆 Genomic libraries第78页，讲稿共114张，创作于星期日基因组基因组 DNA DNA 文库文库纯化基因组DNA 基因组DNA的片断化物理切割和限制性内切酶 eukaryotes prokaryotes与载体连接第79页，讲稿共114张，创作于星期日 构建基因文库的基因组DNA必须进行纯化后，才能用来制备适用于载体插入片断大小的随机片断基因组基因组 DNADNA的纯化的纯化 原核生物:直接从细胞中体取基因组DNA去除蛋白（蛋白酶消化）,脂类和其它“杂质”。真核生物真核生物 :从细胞核中第80页，讲稿共114张，创作于星期日Hae：5-GG/CC 3,Sau3A:5-/GATC
41、-3,Alu:5-AG/CT 3,BamH1:5-G/GATCC限制性内切酶消化限制性内切酶消化1.将片断的末端(粘性或平头)和酶消化的载体连接2.酶切位点是否被修饰3.内切酶消化的时间和用量取决于要插入片断的大小范围。第81页，讲稿共114张，创作于星期日载体选择 根据基因组的大小选择合适的载体构建DNA文库 载载 体体 Plasmid phage cosmid BAC YAC 插入片断插入片断(kb)5 23 45 350 1000最常用的载体是phage第82页，讲稿共114张，创作于星期日Hae 、Alu 第83页，讲稿共114张，创作于星期日第84页，讲稿共114张，创作于星期日 有
42、一些序列不能被克隆有一些序列不能被克隆Example:1.序列缺乏酶切位点;2.目的基因包容在一个其大小范围超出载体承载能力的DNA片断上 Too long for the vector used第85页，讲稿共114张，创作于星期日基因定位克隆Map-based cloning第86页，讲稿共114张，创作于星期日 是用于分离其编码产物上不知道的目的基因的一种有效的方法。从理论上讲，任何一种可鉴定出有一个突变的基因，都可以通过基因定位克隆技术予以分离。基因定位克隆基因定位克隆第87页，讲稿共114张，创作于星期日 步骤：1.先将目的基因定位到染色体上，并在目的基因的两侧确定一对紧密连接的RF
43、LP分子标记；2.利用最紧密连锁的一对两侧分子标记作探针，通过染色体步移技术将位于这两个分子标记之间的含目的基因组片断克隆并分离出来；3.最后根据其同突变体发生遗传互补的能力从此克隆中鉴定出目的基因。第88页，讲稿共114张，创作于星期日 1.以酵母人工染色体为载体构建含有大片断DNA的YAC文库。2.有可用的同目的基因紧密连锁的DNA探针，（距离几百bp）分离目的基因的必要条件分离目的基因的必要条件第89页，讲稿共114张，创作于星期日主要内容：1.拟南芥简介 2.RFLP分子标记 3.RFLP作图的原理与步骤 4.染色体步移 5.大尺度基因组物理图谱的构建第90页，讲稿共114张，创作于星
44、期日 1.植株小，便于筛选突变体；2.时代时间短（5个星期左右），可以积累大量遗传数据）；3.种子产率高，每株可产生4104粒以上的种子；4.基因组小，结构简单，总长度7 107bp适合于用染色体步移技术克隆目的基因；5.天然自花授粉，可得到突变基因的纯合子，同时也可通过人工杂交授粉，以便给基因定位。拟南芥简介拟南芥简介第91页，讲稿共114张，创作于星期日 DNA限制片断长度多态性，它是指应用特定的核酸内切酶切割有关的DNA分子，所产生的DNA片断在长度上的简单变化。由于核酸内切酶是以一种序列特异的方式切割DNA分子，来自一个完整的纯合子个体（所有的基因及DNA序列）的每一种同源DNA分子，
45、都会在同样的位点被准确地切割。RFLP 分子标记分子标记第92页，讲稿共114张，创作于星期日 它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异，由于不同个体等位基因之间碱基的互换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别位点发生改变，从而造成基因型间限制性片段长度的差异。第93页，讲稿共114张，创作于星期日 当这些大小不等的片段通过凝胶电泳时，就形成不同带，通过与克隆的DNA探针进行Southren杂交和放射自显影后，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。第94页，讲稿共114张，创作于星期日GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGCTTAAGGAATTCEcoRCTTAA
46、GGAATTCCCTAAGGGATTCGAATTCCTTAAGEcoREcoR生态型生态型A A的的DNADNA生态型生态型B B的的DNADNAEcoR分别切割两种生态型DNA电泳后作电泳后作SouthenSouthen杂交杂交同放射性同位素标记的基因同放射性同位素标记的基因A A克隆杂交克隆杂交ab基因A基因A第95页，讲稿共114张，创作于星期日 abX探针A探针B探针B探针AF F1 1杂合子杂合子探针B探针AF F2 2代代CNHRFLP作图的原理和步骤作图的原理和步骤第96页，讲稿共114张，创作于星期日2 :1 :1不连锁AB紧密连锁H C N自由组合需要筛选相当大量的需要筛选相
47、当大量的F2代群体，代群体，通过重组子计算基因通过重组子计算基因A与与B之间之间的遗传距离的遗传距离。第97页，讲稿共114张，创作于星期日缺点：缺点：1.克隆可表现基因组多态性的探针较为困难2.实验操作繁琐，检验周期长，成本费用高3.用反射性同位素及核酸杂交技术，既不安全又不易自动化特点：特点：1.共显性2.标记位点数量不受限制，可检测14个基因座位数第98页，讲稿共114张，创作于星期日 这种技术通过逐一克隆来自染色体基因DNA的彼此重叠的序列，而慢慢靠近目的基因，因此形象的称为染色体步移染色体步移（染色体步移（chrosome walking）第99页，讲稿共114张，创作于星期日1.先
48、构建起点RFLP标记克隆的限制图，把其中最靠近目的基因的限制片断亚克隆出来；2.经同位素标记之后，用作分子杂交探针；从基因组文库中筛选与起点克隆具有重叠序列的新克隆；重复进行上述步骤，直到找到目的基因的克隆 步骤步骤第100页，讲稿共114张，创作于星期日第101页，讲稿共114张，创作于星期日 1.在基因组的不同位置上散布着重复的DNA序列，它们会扰乱步移的顺序性，因此，进行染色体步移的探针必须是唯一的序列的克隆。2.在基因组DNA中存在着一些无法克隆的序列，因为当它们被克隆到所使用的克隆载体上时，会发生致死效应。染色体步移的影响因素染色体步移的影响因素第102页，讲稿共114张，创作于星期
49、日 在拟南芥和番茄中1cM的图距大约相当于290 kb和750 kb，而在人类基因组中1cM的图距大约相当于1 000 kb，在小麦中这个数字是3 5000 kb。由于大多数高等真核基因组中都存在着大量的散在重复序列，致使染色体步移对于超大型的DNA序列的作图和超长的距离进行基因定位克隆存在一定的困难。图距图距第103页，讲稿共114张，创作于星期日染色体跳跃（染色体跳跃（chromosome jumping）染色体步移最多只能走1000kb。而真核生物基因组中有许多重复序列，常使步移发生差错；大多数的基因组克隆使得每前进一步都要做大量的工作，可以说是步履艰难；基因组片断在克隆过程中在大多数情
50、况下保真度很好，但也有发生缺失的情况。设计出染色体跳跃文库，常常可以跳跃十万bp。一般用识别序列长的限制性内切酶，Not 1(GC GGCCGC)。第104页，讲稿共114张，创作于星期日NNNN1.用用Not1切染色体切染色体DNA然后走琼脂糖然后走琼脂糖PFG电泳电泳2.熔解琼脂糖，洗出熔解琼脂糖，洗出DNA并与经酶切的质粒相连接并与经酶切的质粒相连接3.用识别序列较短且质粒又缺少此中位点的酶切用识别序列较短且质粒又缺少此中位点的酶切BamH 1进行切割进行切割NNNNNN质粒质粒NNNNNN第105页，讲稿共114张，创作于星期日NBBN4.将所得片断与经将所得片断与经BamH 1切割的