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1、关于食品中致病菌和病毒第1页，此课件共74页哦8.1 8.1 肠杆菌科肠杆菌科肠杆菌科是存在于人和动物肠道或自然界中的一群肠杆菌科是存在于人和动物肠道或自然界中的一群生物学性状很相似的革兰氏阴性短小杆菌。无芽孢，生物学性状很相似的革兰氏阴性短小杆菌。无芽孢，多数有周身鞭毛，能运动。多数有周身鞭毛，能运动。在普通培养基上能生长。在普通培养基上能生长。培养温度为培养温度为35C。需氧或兼性厌氧。需氧或兼性厌氧。能还原硝酸盐为亚硝酸盐，氧化酶试验阴性，触能还原硝酸盐为亚硝酸盐，氧化酶试验阴性，触酶试验阳性。酶试验阳性。第2页，此课件共74页哦8.1.18.1.1大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌E.c
2、oli是肠道正常菌群。一般情况下，多不致是肠道正常菌群。一般情况下，多不致病，是人和动物肠道中的常居菌。病，是人和动物肠道中的常居菌。在一定条件下，可引起肠道道外感染。在一定条件下，可引起肠道道外感染。致病性大肠杆菌：肠产毒性大肠杆菌致病性大肠杆菌：肠产毒性大肠杆菌（EnterotoxigenicE.coli);肠致病性大肠杆菌肠致病性大肠杆菌（EnteropathogenicE.coli);肠侵袭性大肠杆菌肠侵袭性大肠杆菌（EnteroinvasiveE.coli);肠出血性大肠杆菌肠出血性大肠杆菌（EnterohemorrhagicE.coli)。引起腹泻、出血性肠引起腹泻、出血性肠炎。炎
3、。第3页，此课件共74页哦肠产毒性大肠杆菌（肠产毒性大肠杆菌（EnterotoxigenicE.coli，ETEC)v引起婴幼儿和旅游者腹泻，出现轻度水引起婴幼儿和旅游者腹泻，出现轻度水泻，也可呈严重霍乱样症状。腹泻常为泻，也可呈严重霍乱样症状。腹泻常为自限性，一般自限性，一般23d即愈。即愈。v鉴定鉴定ETEC主要测定大肠杆菌肠毒素，血主要测定大肠杆菌肠毒素，血清型有一定的参考意义。清型有一定的参考意义。第4页，此课件共74页哦v肠致病性大肠杆菌（肠致病性大肠杆菌（EnteropathogenicE.coli，EPEC)是婴儿腹泻的主要病原菌，是婴儿腹泻的主要病原菌，具有高度传染性，严重者可
4、致死，成人具有高度传染性，严重者可致死，成人少见。少见。EPEC产生产生VT毒素。毒素。VT毒素具有毒素具有神经毒素、细胞毒素和肠毒素性。神经毒素、细胞毒素和肠毒素性。v鉴定鉴定EPEC根据临床表现和血清型。根据临床表现和血清型。肠致病性大肠杆菌肠致病性大肠杆菌第5页，此课件共74页哦肠侵袭性大肠杆菌（肠侵袭性大肠杆菌（EnteroinvasiveE.coli，EIEC)EIEC的多数菌株无动力，生化反应和抗的多数菌株无动力，生化反应和抗原结构均类似痢疾杆菌。原结构均类似痢疾杆菌。EIEC可引起豚鼠角结合膜炎，临床上可可引起豚鼠角结合膜炎，临床上可借此协助鉴定借此协助鉴定EIEC。第6页，此课
5、件共74页哦肠出血性大肠杆菌（肠出血性大肠杆菌（EnterohemorrhagicE.coli，EHEC)可引起散发性或爆发性出血性结肠炎。主要菌可引起散发性或爆发性出血性结肠炎。主要菌型是型是O157：H7，还可有，还可有O26、O111、O103、O145等。等。1996年年O157：H7在日本引起万人的食物中毒，此外，美在日本引起万人的食物中毒，此外，美国、加拿大、瑞典、澳大利亚、英国等国家和地区相继国、加拿大、瑞典、澳大利亚、英国等国家和地区相继报道了报道了EHECO157：H7的散发性感染和爆发流行。的散发性感染和爆发流行。我国于我国于1999年在苏、皖、鲁、豫发生爆发流行。年在苏、
6、皖、鲁、豫发生爆发流行。肠出血性大肠杆菌肠出血性大肠杆菌第7页，此课件共74页哦肠出血性大肠杆菌肠出血性大肠杆菌O157:H7的检验方法：的检验方法：1、培养基制备、培养基制备改良改良EC新生霉素增菌肉汤新生霉素增菌肉汤（mEC）：）：EC肉汤灭菌后添加肉汤灭菌后添加20mg/mL过滤除菌的新生霉素，使终浓度为过滤除菌的新生霉素，使终浓度为20g/mL。改良山梨醇麦康凯琼脂（改良山梨醇麦康凯琼脂（TC-SMAC）：山梨醇麦康凯琼脂加入）：山梨醇麦康凯琼脂加入过滤除菌的过滤除菌的1%亚碲酸钾溶液，使终浓度亚碲酸钾溶液，使终浓度2.5mg/L，头孢克污，头孢克污，使终浓度为使终浓度为0.05mg/
7、L。MUG-LST肉汤：肉汤：LST肉汤中添加肉汤中添加4-甲基伞形酮甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷葡萄糖醛酸苷（MUG），使终浓度为），使终浓度为0.1g/L。2、增菌培养、增菌培养称取称取25克样品放入克样品放入225mLmEC中，均质。于中，均质。于411培养培养18-24小时。小时。第8页，此课件共74页哦3、分离、分离将将mEC肉汤培养物肉汤培养物10倍递增稀释。从倍递增稀释。从10-4，10-5，10-6稀释度，各取稀释度，各取0.1mL涂布于涂布于TC-SMAC平板。于平板。于361培养培养1824小时。小时。可疑可疑EHECO157:H7菌落扁平，透明或半透明，边缘光滑，呈淡褐色
8、中心，直径约菌落扁平，透明或半透明，边缘光滑，呈淡褐色中心，直径约2mm。4、鉴定、鉴定挑取挑取TC-SMAC上的可疑菌落，接种上的可疑菌落，接种MUG-LST，于，于361培养培养1824小时，出现小时，出现产气，且无荧光者，分离到普通营养琼脂。产气，且无荧光者，分离到普通营养琼脂。对纯菌落用对纯菌落用EHECO157:H7标准血清或胶乳凝集试剂作凝集试验，必要时进行生标准血清或胶乳凝集试剂作凝集试验，必要时进行生化试验。化试验。在检测过程中，也可以在选择性增菌后，取出在检测过程中，也可以在选择性增菌后，取出5mL增菌液，经增菌液，经100水浴水浴15分分钟灭活后，供自动酶联荧光免疫测试（钟
9、灭活后，供自动酶联荧光免疫测试（VIDAS），迅速获得初步结果，阳性反），迅速获得初步结果，阳性反应者需作进一步证实。应者需作进一步证实。第9页，此课件共74页哦EHEC OEHEC O157157:H:H7 7检验程序图解检验程序图解检样检样25gmEC225mL酶联荧光免疫测试酶联荧光免疫测试VIDAS快速筛选快速筛选411，18-24h10-4，10-5，10-6稀释度涂布稀释度涂布TC-SMAC361，18-24h挑取挑取5-10个可疑菌落接种个可疑菌落接种MUG-LST361，18-24hMUG阴性培养物转种普通营养琼脂阴性培养物转种普通营养琼脂生化反应鉴定生化反应鉴定血清凝集鉴定或
10、胶乳凝集试验血清凝集鉴定或胶乳凝集试验第10页，此课件共74页哦生化试验：生化试验：将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。1色氨酸肉汤色氨酸肉汤：在361培养242h后,加Kovacs氏试剂0.20.3mL,上层出现红色为靛基质阳性反应。2MR-VP培养基：培养基：在361培养482h。以无菌操作移取培养物1 mL至13mm100mm试管中,加5-萘酚乙醇溶液0.6mL,40氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶,振摇试管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性。将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5 滴甲基红溶液。如培养物变红色,为甲基红试验阳性,若变黄色则为阴性反应。3Kose
11、r氏枸椽酸盐肉汤：氏枸椽酸盐肉汤：于361培养96h记录有无生长。4LST肉汤：肉汤：于361培养482h,观察试管中是否产气。5革兰氏染色：革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。第11页，此课件共74页哦靛基质（靛基质（Indole）试验：）试验：某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。试验方法：将待试纯培养物小量接种于试验培养基管，于试验
12、方法：将待试纯培养物小量接种于试验培养基管，于361C培养培养24h时后，取约时后，取约2ml培养液，加入培养液，加入Kovacs氏氏试剂试剂23滴，轻摇试管，呈红色为阳性，或先加少量乙滴，轻摇试管，呈红色为阳性，或先加少量乙醚或二甲苯，摇动试管以提取和浓缩靛基质，待其浮于醚或二甲苯，摇动试管以提取和浓缩靛基质，待其浮于培养液表面后，再沿试管壁徐缓加入培养液表面后，再沿试管壁徐缓加入Kovacs氏试剂数滴，氏试剂数滴，在接触面呈红色，即为阳性。在接触面呈红色，即为阳性。第12页，此课件共74页哦甲基红（甲基红（MethylRed）试验）试验肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产肠杆
13、菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基基PH值下降至值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。以下，使甲基红指示剂变红。V-P试验试验某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨碱环境下，被空
14、气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，中的胍基生成红色化合物，称称VP（+）反应。）反应。大肠杆菌：大肠杆菌：MR+/VP-第13页，此课件共74页哦枸椽酸盐试验：枸椽酸盐试验：某些细菌能利用枸椽酸盐作为碳源，及磷酸铵作某些细菌能利用枸椽酸盐作为碳源，及磷酸铵作为氮源，将枸椽酸盐分解为二氧化碳，培养基反为氮源，将枸椽酸盐分解为二氧化碳，培养基反应后成碱性，由于指示剂的作用，培养基变为兰应后成碱性，由于指示剂的作用，培养基变为兰色。色。第14页，此课件共74页哦用上述方法在样品中分离获得的纯菌落，经用上述方法在样品中分离获得的纯菌落，经抗抗E.coliO157:H7标准血清或
15、标准血清或EHECO157:H7胶乳凝集测试为阳性者，报告检出肠出血胶乳凝集测试为阳性者，报告检出肠出血性大肠杆菌性大肠杆菌O157:H7。如需要进一步检测如需要进一步检测Vero毒素基因的存在，可毒素基因的存在，可通过接种通过接种Vero细胞或细胞或Hela细胞，观察细胞细胞，观察细胞病变进行判定，或可使用基因探针检测和病变进行判定，或可使用基因探针检测和聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）检测法。）检测法。第15页，此课件共74页哦大肠杆菌的检测大肠杆菌的检测（1）常规检测方法）常规检测方法国家标准：国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和国家标准采用三步法，即：乳糖发酵
16、试验、分离培养和证实试验。证实试验。乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。乳糖胆盐发酵管。361培养培养482h，观察是否产气。，观察是否产气。分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，361培培养养18-24h，观察菌落形态。，观察菌落形态。证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管乳糖发酵管361培养培养242h，观察产气情况。，观察产气情况
17、。报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每表，报告每100ml（g）大肠菌群的）大肠菌群的MPN值。值。第16页，此课件共74页哦第17页，此课件共74页哦原国家商检局制订的行业标准原国家商检局制订的行业标准，等效采用美国，等效采用美国FDA的标准方的标准方法，用于对出口食品中的大肠杆菌进行检测。本方法采法，用于对出口食品中的大肠杆菌进行检测。本方法采用两步法：用两步法：推测试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度推测试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管接种三管LST肉汤。肉汤。361培养培养482h，观察是否产气。，观察
18、是否产气。证实试验：将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐（证实试验：将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉）肉汤管中，汤管中，361培养培养482h，观察是否产气。以，观察是否产气。以BGLB产气产气为阳性。查为阳性。查MPN表，报告每表，报告每ml(g)样品中大肠菌群的样品中大肠菌群的MPN值。值。第18页，此课件共74页哦(2)PCR(2)PCR方法方法大肠杆菌是食品和水源污染粪便的指示菌。大肠杆菌是食品和水源污染粪便的指示菌。Gene-TARK研制出用浸染棒检测大肠杆菌中研制出用浸染棒检测大肠杆菌中16SrRNA的探针，样品需前增菌处理，以异硫氰荧光的探针，样品需前增菌处理，以异硫氰荧光
19、素（素（FITC）标记探针，再用辣根过氧化物酶标记）标记探针，再用辣根过氧化物酶标记抗抗FITC抗体检测杂交复合物。抗体检测杂交复合物。Hsu等报导此方法特异性（除相近的志贺氏菌外）等报导此方法特异性（除相近的志贺氏菌外）达达100，假阳性率达，假阳性率达1.2。第19页，此课件共74页哦8.1.2 8.1.2 沙门氏菌属（沙门氏菌属（Salmonella)Salmonella)v沙门氏菌是引起食物中毒的重要病原菌。在世界各国各沙门氏菌是引起食物中毒的重要病原菌。在世界各国各类细菌性的食物中毒中，沙门氏菌常居前列。因此，沙类细菌性的食物中毒中，沙门氏菌常居前列。因此，沙门氏菌的检测是各国检验机
20、构对多种进出口食品的必检门氏菌的检测是各国检验机构对多种进出口食品的必检项目之一。项目之一。v沙门氏菌属是肠杆菌科中最复杂的菌属。它属于革兰氏阴沙门氏菌属是肠杆菌科中最复杂的菌属。它属于革兰氏阴性杆菌。可根据沙门氏菌的菌体抗原（性杆菌。可根据沙门氏菌的菌体抗原（O抗原）分群（抗原）分群（A,B,C等），再根据其鞭毛抗原（等），再根据其鞭毛抗原（H抗原）分血清型（抗原）分血清型（1、2等）。等）。第20页，此课件共74页哦沙门氏菌不产生外毒素，但能产生毒力较强的内沙门氏菌不产生外毒素，但能产生毒力较强的内毒素。毒素。沙门氏菌主要通过食物、饮水经口感染。可存在多种沙门氏菌主要通过食物、饮水经口感染
21、。可存在多种食物中，包括生肉、禽、蛋、奶制品、虾、鱼和田鸡食物中，包括生肉、禽、蛋、奶制品、虾、鱼和田鸡腿等。腿等。沙门氏菌主要通过食物、饮水经口感染。根据侵入沙门氏菌主要通过食物、饮水经口感染。根据侵入机体沙门氏菌菌种的不同，在临床上引起四种不同机体沙门氏菌菌种的不同，在临床上引起四种不同的疾病。的疾病。第21页，此课件共74页哦（1）伤寒、副伤寒）伤寒、副伤寒由沙门氏属中的伤寒杆菌和甲、乙、丙型副伤寒杆菌引起。由沙门氏属中的伤寒杆菌和甲、乙、丙型副伤寒杆菌引起。（2）食物中毒）食物中毒沙门氏菌属引起的食物中毒，主要以肠炎杆菌、鼠伤寒杆菌、沙门氏菌属引起的食物中毒，主要以肠炎杆菌、鼠伤寒杆菌
22、、猪霍乱杆菌、丙型副伤寒杆菌和汤普逊杆菌等最为多见。临床猪霍乱杆菌、丙型副伤寒杆菌和汤普逊杆菌等最为多见。临床症状主要是胃肠炎。病程较短，一般症状主要是胃肠炎。病程较短，一般24d,可完全恢复。可完全恢复。（3）败血症）败血症多为猪霍乱杆菌引起，甲、乙、丙型副伤寒杆菌和肠炎杆多为猪霍乱杆菌引起，甲、乙、丙型副伤寒杆菌和肠炎杆菌亦可引起败血症。菌亦可引起败血症。（4）慢性肠炎）慢性肠炎沙门氏杆菌可引起慢性、持久性肠炎。沙门氏杆菌可引起慢性、持久性肠炎。第22页，此课件共74页哦从食品中分离沙门氏菌样品制备从食品中分离沙门氏菌样品制备由于食品种类繁多，且每类中包括许多品种。因其加工方式不由于食品种
23、类繁多，且每类中包括许多品种。因其加工方式不同，导致性状各异。故在进行微生物学检验时，应按不同的形同，导致性状各异。故在进行微生物学检验时，应按不同的形状、加工方式及检验目的合理进行检样处理。状、加工方式及检验目的合理进行检样处理。检样处理检样处理冷冻的检样冷冻的检样在检样前最好不要解冻，将沙门氏菌的损伤降低在检样前最好不要解冻，将沙门氏菌的损伤降低到最低限度。到最低限度。粉状样品粉状样品应将应将225ml增菌液分数次加入，并用灭菌玻棒搅拌成均增菌液分数次加入，并用灭菌玻棒搅拌成均匀悬液。匀悬液。带壳蛋类带壳蛋类在流水下用刷子刷洗蛋类，并沥干。将蛋类在含在流水下用刷子刷洗蛋类，并沥干。将蛋类在
24、含0.1十二十二烷基磺酸钠的烷基磺酸钠的200mg/kgCl-溶液中浸泡溶液中浸泡30min后方可破壳取蛋。后方可破壳取蛋。第23页，此课件共74页哦检测方法检测方法从食品中分离和鉴定沙门氏菌，当前通常采用的方法共分从食品中分离和鉴定沙门氏菌，当前通常采用的方法共分5个步骤：个步骤：前增菌：前增菌：食品样品在含有营养的非选择性培养基中增菌，使食品样品在含有营养的非选择性培养基中增菌，使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态。受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态。选择性增菌：选择性增菌：此培养基允许沙门氏菌持续增菌，同时阻止大此培养基允许沙门氏菌持续增菌，同时阻止大多数其他细菌的增殖。多数
25、其他细菌的增殖。选择性平板分离：选择性平板分离：采用固体选择培养基，抑制非沙门氏菌的采用固体选择培养基，抑制非沙门氏菌的生长，提供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别。生长，提供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别。生物化学筛选：生物化学筛选：排除大多数非沙门氏菌，也提供了沙门氏菌培养物排除大多数非沙门氏菌，也提供了沙门氏菌培养物菌属的初步鉴定。菌属的初步鉴定。血清学技术鉴定培养物菌种血清学技术鉴定培养物菌种。第24页，此课件共74页哦（1）沙门氏菌的增菌和分离）沙门氏菌的增菌和分离预增菌预增菌将制备好的预增菌试液于将制备好的预增菌试液于35培养培养24h后，轻轻振后，轻轻振摇培养液。摇培养液。选
26、择性增菌选择性增菌选择性平板分离选择性平板分离混匀培养物，用直径混匀培养物，用直径3mm的接种环，的接种环，1满环（满环（10ul）分别划线接种于亚硫酸铋（）分别划线接种于亚硫酸铋（BS）琼脂、）琼脂、木糖赖氨酸去氧胆酸盐（木糖赖氨酸去氧胆酸盐（XLD）琼脂和）琼脂和HEKTONE氏氏肠道菌（肠道菌（HE）琼脂平板上，于）琼脂平板上，于35培养培养24h后，根据后，根据沙门氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征挑取典沙门氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征挑取典型或可疑菌落。型或可疑菌落。第25页，此课件共74页哦（2）沙门氏菌的筛选和生化、血清学鉴定）沙门氏菌的筛选和生化、血清学鉴定筛选筛选用
27、灭菌接种针挑取每个典型或可疑菌落的中心部位，分别接用灭菌接种针挑取每个典型或可疑菌落的中心部位，分别接种三糖铁（种三糖铁（TSI）、赖氨酸铁琼脂斜面，于）、赖氨酸铁琼脂斜面，于35培养培养24h。在在TSI琼脂中，典型的沙门氏菌培养物可使斜面呈碱色（红色），琼脂中，典型的沙门氏菌培养物可使斜面呈碱色（红色），底层呈酸色（黄色），产生底层呈酸色（黄色），产生H2S（琼脂变为黑色）或不产生（琼脂变为黑色）或不产生H2S。生化学、血清学鉴定生化学、血清学鉴定混杂培养物混杂培养物对呈混杂的对呈混杂的TSI琼脂培养物，皆应划线于琼脂培养物，皆应划线于MC、HE或或XLD琼脂上，于琼脂上，于35培养培养2
28、4h后，进行重新分离并至少挑后，进行重新分离并至少挑取取2个可疑菌落接种到斜面上进行鉴定。个可疑菌落接种到斜面上进行鉴定。第26页，此课件共74页哦纯培养物纯培养物将每个可疑阳性的将每个可疑阳性的TSI琼脂斜面培养物，分别接琼脂斜面培养物，分别接种于尿素肉汤中，种于尿素肉汤中，35培养培养24h，获取多量的琼脂斜面培养，获取多量的琼脂斜面培养物接种于快速尿素肉汤中，于物接种于快速尿素肉汤中，于37水浴培养水浴培养2h。弃去所有呈。弃去所有呈阳性结果的培养物，保留所有呈阴性反应的培养物作进一步阳性结果的培养物，保留所有呈阴性反应的培养物作进一步鉴定。鉴定。血清学多价鞭毛（血清学多价鞭毛（H）试验
29、）试验血清学多价菌体（血清学多价菌体（O）试验）试验菌体（菌体（O）群试验）群试验鞭毛（鞭毛（H）试验阴性培养物的诱导）试验阴性培养物的诱导（3）结果判定）结果判定第27页，此课件共74页哦8.3弯曲菌弯曲菌弯曲菌是一组人畜共患的病原微生物，能引起人的腹泻弯曲菌是一组人畜共患的病原微生物，能引起人的腹泻和食物中毒，在国外已被广泛的重视，同时也被公认为和食物中毒，在国外已被广泛的重视，同时也被公认为新发现的病原菌之一。新发现的病原菌之一。弯曲菌是革兰氏阴性菌，呈弧形和弯曲菌是革兰氏阴性菌，呈弧形和S型。型。弯曲菌以病原菌和共生菌广泛存在于动物中，家禽弯曲菌以病原菌和共生菌广泛存在于动物中，家禽家
30、畜是主要的贮存宿主和传染源，在传染或带菌动家畜是主要的贮存宿主和传染源，在传染或带菌动物的肠道和生殖道内容物中含有大量的弯曲菌。食物的肠道和生殖道内容物中含有大量的弯曲菌。食用被污染的食物、水，尤其是鸡、鸭、蛋，未消毒用被污染的食物、水，尤其是鸡、鸭、蛋，未消毒或消毒不完全的牛奶，均可致病。或消毒不完全的牛奶，均可致病。第28页，此课件共74页哦检验方法检验方法（1）常规方法）常规方法第29页，此课件共74页哦（2）现代检验技术）现代检验技术基因探针法基因探针法核酸杂交试验是以互补核酸链能够特异性结合并形成稳核酸杂交试验是以互补核酸链能够特异性结合并形成稳定的双链复合物为基础。基因探针系统采用
31、的是发光剂定的双链复合物为基础。基因探针系统采用的是发光剂标记的单链标记的单链DNA探针，该探针与核糖体探针，该探针与核糖体RNA结合形成结合形成稳定的稳定的DNA:RNA杂交体。选择试剂将未杂交和杂交探杂交体。选择试剂将未杂交和杂交探针分开。标记的针分开。标记的DNA:RNA杂交作用杂交作用GEN-PROBE发发光仪检测。发光仪读数大于或等于光仪检测。发光仪读数大于或等于CUT-OFF值的值的为阳性，低于为阳性，低于CUT-OFF值的为阴性。值的为阴性。第30页，此课件共74页哦PCR法法根据弯曲菌属根据弯曲菌属16sRNA高保守序列设计一对引物；在合高保守序列设计一对引物；在合适的反应条件
32、和反应体系下进行反应；最后利用电泳观适的反应条件和反应体系下进行反应；最后利用电泳观察结果。察结果。荧光酶标试剂盒荧光酶标试剂盒检测弯曲杆菌的探针是用非放射性物质标记的。标记物检测弯曲杆菌的探针是用非放射性物质标记的。标记物为发光素。靶顺序为为发光素。靶顺序为rRNA。近年来用碱性磷酸酶人工。近年来用碱性磷酸酶人工合成的寡核苷酸检测人工污染的粪便样品，检测量为一百合成的寡核苷酸检测人工污染的粪便样品，检测量为一百万个菌落形成单位（万个菌落形成单位（CFU)，敏感性和特异性达，敏感性和特异性达100。此方法只在临床检测中应用，尚未用于食品检测。此方法只在临床检测中应用，尚未用于食品检测。第31页
33、，此课件共74页哦8.4金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌葡萄球菌是一类革兰氏阳性菌。它的致病力的强弱葡萄球菌是一类革兰氏阳性菌。它的致病力的强弱与其产生的毒素及酶类有关。人一旦感染该菌，当与其产生的毒素及酶类有关。人一旦感染该菌，当机体抵抗力减弱或皮肤受损时，易被感染，引起伤机体抵抗力减弱或皮肤受损时，易被感染，引起伤口化脓、中耳炎、毛囊炎等。产生葡萄球菌肠毒素口化脓、中耳炎、毛囊炎等。产生葡萄球菌肠毒素的还可引起食物中毒。的还可引起食物中毒。对人有致病性的葡萄球菌多产生对人有致病性的葡萄球菌多产生-溶血素；溶血素；对动对动物有致病性的葡萄球菌多物有致病性的葡萄球菌多产产生生-溶血毒素。溶血毒素。
34、第32页，此课件共74页哦金黄色葡萄球菌某些菌株能产生一种能引起急性肠胃金黄色葡萄球菌某些菌株能产生一种能引起急性肠胃炎的肠毒素，当这些菌株污染了食物，在温度条件适炎的肠毒素，当这些菌株污染了食物，在温度条件适宜时，即可产生相当数量的肠毒素，根据肠毒素的血宜时，即可产生相当数量的肠毒素，根据肠毒素的血清型别不同，分为清型别不同，分为A、B、C、D、E五型。其中以五型。其中以A型引起的食物中毒最多，型引起的食物中毒最多，B和和C型次之。肠毒素是一种型次之。肠毒素是一种可溶性蛋白质纯化的肠毒素，能耐高温。可溶性蛋白质纯化的肠毒素，能耐高温。第33页，此课件共74页哦血浆凝固酶是鉴别葡萄球菌有无致病
35、性血浆凝固酶是鉴别葡萄球菌有无致病性的重要指标。血浆凝固酶具有抗原性，的重要指标。血浆凝固酶具有抗原性，可分为可分为8型。大多数致病性葡萄球菌能产型。大多数致病性葡萄球菌能产生此酶，而非致病菌不产生。可应用生此酶，而非致病菌不产生。可应用8个个型的凝固酶抗血清进行分型试验，用来型的凝固酶抗血清进行分型试验，用来研究葡萄球菌的流行病学情况。研究葡萄球菌的流行病学情况。第34页，此课件共74页哦检验方法检验方法（1）常规检验方法）常规检验方法第35页，此课件共74页哦（2）现代检验技术）现代检验技术利用利用miniVidas全自动免疫分析仪，它是应用酶联免全自动免疫分析仪，它是应用酶联免疫技术，用
36、荧光分析技术通过固相吸附器，用已知抗体疫技术，用荧光分析技术通过固相吸附器，用已知抗体来捕捉目标生物体，然后以带荧光的酶联抗体再次结合，来捕捉目标生物体，然后以带荧光的酶联抗体再次结合，经充分冲洗，通过激发光源检测，即能自动读出发光的经充分冲洗，通过激发光源检测，即能自动读出发光的阳性标本，其优点是检测灵敏度高、速度快，可在阳性标本，其优点是检测灵敏度高、速度快，可在48h的时间内快速筛选鉴定出金黄色葡萄球菌及金黄色葡萄的时间内快速筛选鉴定出金黄色葡萄球菌及金黄色葡萄球菌肠毒素。球菌肠毒素。第36页，此课件共74页哦美国美国3M公司，利用耐热核酸酶特性，设计出纸片公司，利用耐热核酸酶特性，设计
37、出纸片法，能在法，能在24h快速检测出金黄色葡萄球菌。快速检测出金黄色葡萄球菌。大多数检测葡萄球菌的探针是针对肠毒素的。它们能同大多数检测葡萄球菌的探针是针对肠毒素的。它们能同编码肠毒素有关的基因序列杂交，这类探针能检测肠毒编码肠毒素有关的基因序列杂交，这类探针能检测肠毒素素A、B、C和和E。PCR法：设计特异性引物根据产生肠毒素法：设计特异性引物根据产生肠毒素A-E基因基因（entA,entB,entC,entD和和entE),检测葡萄球菌检测葡萄球菌exfoliative基因，检测中毒休克毒素基因基因，检测中毒休克毒素基因(tst)。第37页，此课件共74页哦8.5 8.5 肉毒梭菌肉毒梭
38、菌肉毒梭菌是严重食物中毒的病原菌之一，肉毒梭菌是严重食物中毒的病原菌之一，在厌氧的环境下能产生强烈的外毒素。这在厌氧的环境下能产生强烈的外毒素。这种毒素毒性强烈，是一种独特的神经麻痹种毒素毒性强烈，是一种独特的神经麻痹毒素，即肉毒毒素。该毒素性质稳定，是毒素，即肉毒毒素。该毒素性质稳定，是目前已知化学毒物和生物毒素中毒性最强目前已知化学毒物和生物毒素中毒性最强烈者，对人的致死剂量为烈者，对人的致死剂量为0.1ug。第38页，此课件共74页哦肉毒梭菌在自然界的分布具有某种区域性差异，显肉毒梭菌在自然界的分布具有某种区域性差异，显示出生态上的差异倾向。根据抗原特异性，可分为示出生态上的差异倾向。根
39、据抗原特异性，可分为A、B、C、D、E、F、G七个型别。七个型别。肉毒梭菌一年四季均可发生，发病主要与饮食习惯有密肉毒梭菌一年四季均可发生，发病主要与饮食习惯有密切的关系。切的关系。欧美国家：肉类食品、罐头食品；欧美国家：肉类食品、罐头食品；日本等沿海国家：进食水产品；日本等沿海国家：进食水产品；我国内地：进食发酵食品（如臭豆腐、豆瓣酱、豆豉等）。我国内地：进食发酵食品（如臭豆腐、豆瓣酱、豆豉等）。第39页，此课件共74页哦检验方法检验方法1）常规肉毒梭）常规肉毒梭菌的检出菌的检出GB/T4789.12-20032）PCR法法报告（一）：检样含某型肉毒毒素报告（一）：检样含某型肉毒毒素报告（二
40、）：检样含某型肉毒梭菌报告（二）：检样含某型肉毒梭菌报告（三）：由样品分离的菌株为某型肉毒梭菌报告（三）：由样品分离的菌株为某型肉毒梭菌第40页，此课件共74页哦8.6 8.6 致病性弧菌致病性弧菌 弧菌属共有弧菌属共有3737个种（变种），其中已明确又个种（变种），其中已明确又1212个种对人类有个种对人类有致病作用。在这致病作用。在这1212种致病菌种，最重要的，也是问题最多的是种致病菌种，最重要的，也是问题最多的是O1O1型霍乱弧菌、非型霍乱弧菌、非O1O1型霍乱弧菌、副溶血性弧菌和创伤弧菌。型霍乱弧菌、副溶血性弧菌和创伤弧菌。霍乱弧菌霍乱弧菌(Vibrionaceae cholerae
41、)(Vibrionaceae cholerae)霍乱弧菌是由霍乱弧菌是由O1O1血清群和血清群和O139O139血清群引起的烈性消化道传染病。血清群引起的烈性消化道传染病。该病传播快该病传播快,波及面广，是属于国际检疫的传染病。波及面广，是属于国际检疫的传染病。水是传播霍乱的主要媒介。水是传播霍乱的主要媒介。与霍乱有关的食品主要是海产品、有壳的水生动物和甲壳与霍乱有关的食品主要是海产品、有壳的水生动物和甲壳动物，主要有鱼、虾、贝类、甲鱼、牛蛙、蟹等。动物，主要有鱼、虾、贝类、甲鱼、牛蛙、蟹等。第41页，此课件共74页哦霍乱弧菌引起的疾病叫霍乱。霍乱弧菌引起的疾病叫霍乱。由霍乱弧菌由霍乱弧菌E1
42、Tor生物型引起的症状较轻，病程也生物型引起的症状较轻，病程也短。短。霍乱弧菌肠毒素会引起机体严重的呕吐、腹泻等霍乱弧菌肠毒素会引起机体严重的呕吐、腹泻等临床症状。临床症状。霍乱弧菌的检测方法霍乱弧菌的检测方法生物学检测方法，作霍乱弧菌生物学检测方法，作霍乱弧菌O1+O139多价血清多价血清凝集试验（水、食品）。凝集试验（水、食品）。PCR（对毒力基因（对毒力基因ctxAB、tcpA进行扩增）。进行扩增）。第42页，此课件共74页哦致病性弧菌的检测方法致病性弧菌的检测方法1、具有代表性检验方法简介、具有代表性检验方法简介（1）FDA的细菌学分析手册的细菌学分析手册霍乱、付弧、创伤弧菌和其他弧菌
43、（霍乱、付弧、创伤弧菌和其他弧菌（19951998修订）分别着重修订）分别着重介绍了霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌的方法。介绍了霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌的方法。用用PCR方法检测产肠毒素的霍乱弧菌叙述了霍乱肠毒素方法检测产肠毒素的霍乱弧菌叙述了霍乱肠毒素choleraToxin(T)基因基因（2）AOAC官方分析方法官方分析方法牡蛎中的霍乱弧菌：升温富集法（牡蛎中的霍乱弧菌：升温富集法（1995.a）创伤弧菌的脂肪酸气相色谱鉴定法创伤弧菌的脂肪酸气相色谱鉴定法AOAC.(1995.b）美国美国midi公司生产的公司生产的shelock微生物鉴定系统。微生物鉴定系统。第43页，此课件共74
44、页哦（3）ISO方法方法副溶血弧菌的检测方法（副溶血弧菌的检测方法（ISO8914：1990E）（4）NMKL食品中致病性弧菌的检测和计数（食品中致病性弧菌的检测和计数（NMKLN0156）介绍了霍乱弧）介绍了霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌的检测程序。菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌的检测程序。（5）不同国家的方法不同国家的方法日本、瑞士等国均有相应检验方法。日本、瑞士等国均有相应检验方法。2、致病性弧菌的检测方法、致病性弧菌的检测方法以上介绍的方法均是以单一或少数目标菌（以上介绍的方法均是以单一或少数目标菌（NMKL为四种）为目的的为四种）为目的的设计的程序。鉴于国外对出口食品中
45、多种致病性弧菌的要求和重视，有设计的程序。鉴于国外对出口食品中多种致病性弧菌的要求和重视，有必要探讨必要探讨“同一程序同时检测多种弧菌同一程序同时检测多种弧菌”方法。方法。第44页，此课件共74页哦检验程序检验程序25g样品样品+225mLAPW(1%NaClpH9.0)增菌增菌378-16h取取10mL加入双倍加入双倍APW376-8h选择选择选择培养基选择培养基TCBS（霍利斯用非选择性的羊血球琼脂）（霍利斯用非选择性的羊血球琼脂）3724h定弧菌定弧菌取黄色或绿色菌落做取黄色或绿色菌落做G染色、氧化酶、动力染色、氧化酶、动力O/129(150ug)、D-甘露糖甘露糖分组分组初步鉴定初步鉴
46、定：0%NaCl,1%NaCl、硝酸盐还原、精氨酸双水、硝酸盐还原、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧、鸟氨酸脱羧、解酶、赖氨酸脱羧、鸟氨酸脱羧、(氧化酶氧化酶)分成分成5组组确证确证最后鉴定最后鉴定第45页，此课件共74页哦8.7 8.7 病毒病毒8.7.1诺瓦科病毒（诺瓦科病毒（Norwalkvirus）1972年首次发现。年首次发现。诺瓦科病毒是直径诺瓦科病毒是直径27nm的圆形结构的病毒，无包的圆形结构的病毒，无包膜，尚不能在实验室培养。膜，尚不能在实验室培养。Norwalk病毒是最重要的引起腹泻的肠道病毒。食病毒是最重要的引起腹泻的肠道病毒。食品（包括水）被诺瓦科病毒感染后，出现以急性肠品（
47、包括水）被诺瓦科病毒感染后，出现以急性肠胃炎为主的临床症状。目前，这类病毒尚无特效治胃炎为主的临床症状。目前，这类病毒尚无特效治疗药物。疗药物。第46页，此课件共74页哦20世纪世纪70年代在澳大利亚爆发了有年代在澳大利亚爆发了有2000多人感染诺瓦科病毒。多人感染诺瓦科病毒。另一起病例原因是运垃圾船将垃圾倒在正在捕捞贝类的区域。另一起病例原因是运垃圾船将垃圾倒在正在捕捞贝类的区域。2006年年11月，美国一艘名为月，美国一艘名为“海洋自由海洋自由”号的豪华邮轮，遭号的豪华邮轮，遭到了诺瓦克病毒的袭击，在为期一周的航行中，到了诺瓦克病毒的袭击，在为期一周的航行中，300多名乘多名乘客和船员感染
48、了诺瓦克病毒，受感染的人数是这艘船搭载的客和船员感染了诺瓦克病毒，受感染的人数是这艘船搭载的总人数的总人数的7%。诺瓦科病毒的毒力较强，发病有明显的季节性（秋冬季），诺瓦科病毒的毒力较强，发病有明显的季节性（秋冬季），一般不造成爆发流行。一般不造成爆发流行。第47页，此课件共74页哦在在2006年底的一周内，日本各地小儿科医疗机构上年底的一周内，日本各地小儿科医疗机构上报的诺瓦克病毒腹泻人数，达到了报的诺瓦克病毒腹泻人数，达到了6万多人，发病万多人，发病率超过了有相关率超过了有相关统计统计25年来的历年最高纪录。根据年来的历年最高纪录。根据推算，日本境内已经有超过推算，日本境内已经有超过300
49、万人感染诺瓦克病毒。万人感染诺瓦克病毒。自自2002年以来，日本每年冬季都会爆发诺瓦克病毒，年以来，日本每年冬季都会爆发诺瓦克病毒，其中一些和牡蛎其中一些和牡蛎(生蚝生蚝)和生海鲜有关。和生海鲜有关。2006年，日年，日本媒体关注诺瓦克病毒和感染者在疗养院死亡的本媒体关注诺瓦克病毒和感染者在疗养院死亡的情况。情况。2006年到年到2007年，诺瓦克感染例子几乎是年，诺瓦克感染例子几乎是之前的之前的3倍。倍。第48页，此课件共74页哦检测方法（1）免疫电镜法（）免疫电镜法（IEM）NV被发现后很长一段时间内，电镜一直是检测的主要被发现后很长一段时间内，电镜一直是检测的主要手段，具有直接、可靠的优
50、点。电镜观察需要的样品量手段，具有直接、可靠的优点。电镜观察需要的样品量为为106107个病毒颗粒个病毒颗粒/mL排泄物。这个技术仅在发病排泄物。这个技术仅在发病早期适用。早期适用。免疫电镜能使电镜的灵敏度提高免疫电镜能使电镜的灵敏度提高10-100倍。在显微倍。在显微镜下包被康复病人的血清。血清抗体玉同源病毒相镜下包被康复病人的血清。血清抗体玉同源病毒相结合，因此提高了诊断效率。但结合，因此提高了诊断效率。但IEM不适合大规模流不适合大规模流行病学调查。行病学调查。第49页，此课件共74页哦（2）放射免疫和生物素亲和素法（）放射免疫和生物素亲和素法（RIA法）法）检测抗原与检测抗原与IEM法