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1、2019年动物源细菌耐药性监测计划根据兽药管理条例规定，为做好2019年动物源细菌耐药性监测工作，充分发挥监测工作的支撑作用，促进养殖环节科学合理用药，制定本计划。一、 监测范围北京、天津、河北、山西、内蒙古、辽宁、吉林、黑龙江、上海、江苏、浙江、安徽、福建、江西、山东、河南、湖北、湖南、广东、广西、海南、重庆、四川、贵州、云南、陕西、甘肃、青海、宁夏、新疆等30个省（区、市）和新疆生产建设兵团。二、 监测对象实行定点监测与随机监测相结合的原则。从2019年开始将“全国兽用抗菌药使用减量化行动试点养殖场”（养殖场名录见附件1）作为长期定点监测场；除对长期定点监测场进行跟踪监测外，每个监测省份还
2、须随机监测至少3个地市，每个地市随机监测至少3家养殖场或屠宰场开展监测。三、职责任务（一）农业农村部畜牧兽医局负责组织开展全国动物源细菌耐药性监测工作，制定发布监测计划，分析和应用监测结果。（二）中国兽医药品监察所（以下简称“中监所”）负责全国动物源细菌耐药性监测的技术指导、数据库建设与维护工作，药敏试验板的设计与质量控制、监测结果的汇总分析。（三）省级畜牧兽医行政管理部门负责协助完成国家监测计划相关任务，协助监测任务承担单位做好采样工作。有条件的省份应积极争取财政支持，制定并组织实施本辖区动物源细菌耐药性监测计划。（四）监测任务承担单位农业农村部部属有关单位，可承接政府购买服务的高等院校、科
3、研院所、省级兽药检验机构和第三方检测机构等，共同承担动物源细菌耐药性监测任务，负责实施耐药性监测工作。监测省份和监测数量见附件2。（五）菌株保藏与鉴定单位中监所负责对各地耐药性监测实验室分离的大肠杆菌和人畜共患病原菌（沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和弯曲杆菌）菌种的保存，并指导各任务承担单位进行沙门氏菌血清分型，承担沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和弯曲杆菌罕见耐药表型菌株的确认、收集和保存以及耐药机制的鉴定。有关高等院校负责肠球菌、大肠杆菌、副猪嗜血杆菌、魏氏梭菌、伪结核棒状杆菌罕见耐药表型菌株的确认、收集和保存以及耐药机制的鉴定。四、监测内容（一）监测大肠杆菌、沙门氏菌和副猪嗜血杆菌等3种细菌对氨苄西林
4、、阿莫西林/克拉维酸、庆大霉素、大观霉素、四环素、氟苯尼考、磺胺异噁唑、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑、头孢噻呋、头孢他啶、恩诺沙星、氧氟沙星、美罗培南、安普霉素、黏菌素、乙酰甲喹等16种抗菌药的耐药性。（二）监测肠球菌、金黄色葡萄球菌、魏氏梭菌和伪结核棒状杆菌等4种细菌对青霉素、阿莫西林/克拉维酸、红霉素、克林霉素、恩诺沙星、氧氟沙星、头孢噻呋、头孢西丁、磺胺异噁唑、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑、万古霉素、多西环素、氟苯尼考、苯唑西林、庆大霉素、泰妙菌素、替米考星、利柰唑胺等18种抗菌药的耐药性。（三）监测弯曲杆菌对阿奇霉素、环丙沙星、红霉素、庆大霉素、四环素、氟苯尼考、萘啶酸、泰利霉素、克林霉素等9种抗菌药
5、的耐药性。（四）监测肠球菌和魏氏梭菌对四环素、吉他霉素、黄霉素、恩拉霉素、喹烯酮、那西肽、阿维拉霉素、维吉尼亚霉素、杆菌肽等9种抗菌药的耐药性。五、监测要求（一）各监测任务承担单位要按照2019年度动物源细菌耐药性监测采样和检测技术要点（见附件2）开展采样、细菌分离和鉴定、耐药性检测和结果上报等工作。（二）样品应从养殖场（包括养鸡场、养鸭场、养猪场、养羊场、奶牛场）或屠宰场抽取。其中，规模化养殖场和小型养殖场应各占50%。（三）采样时应做好养殖场用药情况和饲料来源调查，认真填写采样记录表（见附件3）。对同一养殖场用药情况不同的动物群，应分别填写采样表。（四）细菌的分离和鉴定按照动物源细菌分离和
6、鉴定方法（见附件4）执行。（五）各任务承担单位进行药敏试验时应使用经过质量认证的检测板。2019年继续监测肠球菌和魏氏梭菌对促生长用抗菌药物的耐药性。药敏试验检测试剂盒（MIC测定）使用方法见附件5。六、结果报送（一）各监测任务承担单位登录中国兽药信息网（），在中国兽药数据库下选择“兽药耐药性监测数据库系统”，输入本单位用户名和密码，上传耐药性监测数据，经实验室相关负责人审核通过后进入数据分析库，并进行总结分析。（二）按照任务分工，各监测任务承担单位的电子版总结在11月25日前报中监所。12月31日前，中监所完成汇总报我部畜牧兽医局。联 系 人：农业农村部畜牧兽医局 冯梁中国兽医药品监察所 宋
7、立联系电话：010-59191430 010-62103679附件：1.2019年度动物源细菌耐药性监测采样和检测技术要点2.2019年动物源细菌耐药性监测数量3.采样记录表4.动物源细菌分离和鉴定方法5.药敏试验检测试剂盒（MIC测定）使用方法6.敏感性检测结果统计表14附件22019年动物源细菌耐药性监测数量样品来源养殖场要求采样部位细菌种类与数量要求辽宁、海南、甘肃养殖场或屠宰厂20个，奶牛场3个，屠宰厂为鸡、猪源样品。泄殖腔拭子或动物盲肠，牛奶大肠杆菌200株，肠球菌200株，沙门氏菌、金葡菌、弯曲杆菌各60株上海养殖场或屠宰厂10个，奶牛场3个，屠宰厂为鸡、猪源样品。泄殖腔拭子或动物
8、盲肠，牛奶大肠杆菌100株，肠球菌100株，弯曲杆菌50株，沙门氏菌或金葡菌50株四川养殖场或屠宰厂20个，奶牛场3个，屠宰厂为鸡、猪源样品。泄殖腔拭子或动物盲肠，牛奶大肠杆菌200株，肠球菌200株，沙门氏菌、金葡菌、弯曲杆菌各50株广东养殖场或屠宰厂20个，奶牛场3个，屠宰厂为鸡、猪源样品。泄殖腔拭子或动物盲肠，牛奶大肠杆菌200株，肠球菌200株，沙门氏菌、金葡菌、弯曲杆菌各50株安徽、黑龙江、广西养殖场或屠宰厂20个，奶牛场3个，屠宰厂为鸡、猪源样品。泄殖腔拭子或动物盲肠，牛奶大肠杆菌200株，肠球菌200株，沙门氏菌、金葡菌、弯曲杆菌各50株天津、青海养殖场或屠宰厂20个，奶牛场3个
9、，屠宰厂为鸡、猪源样品。泄殖腔拭子或动物盲肠，牛奶大肠杆菌200株，肠球菌200株，沙门氏菌、金葡菌、弯曲杆菌各50株河南、贵州养殖场或屠宰厂20个，奶牛场3个，屠宰厂为鸡、猪源样品。泄殖腔拭子或动物盲肠，牛奶大肠杆菌200株，肠球菌200株，沙门氏菌、金葡菌、弯曲杆菌各50株湖南养殖场或屠宰厂20个，奶牛场3个，屠宰厂为鸡、猪源样品。泄殖腔拭子或动物盲肠，牛奶大肠杆菌200株，肠球菌200株，沙门氏菌、金葡菌和弯曲杆菌合计100株陕西养殖场或屠宰厂20个，奶牛场3个，屠宰厂为鸡、猪源样品。泄殖腔拭子或动物盲肠，牛奶大肠杆菌200株，肠球菌200株，沙门氏菌、金葡菌各50株山东、山西养殖场或屠
10、宰厂10个，奶牛场3个，屠宰厂为鸡、鸭、猪源样品。泄殖腔拭子或动物盲肠，牛奶沙门氏菌、金葡菌、弯曲杆菌各100株浙江、福建养殖场或屠宰厂10个，奶牛场3个，屠宰厂为鸡、鸭、猪源样品。泄殖腔拭子或动物盲肠，牛奶沙门氏菌、金葡菌、弯曲杆菌各100株北京、山西及其他省份养殖场或屠宰厂20个，屠宰厂为肉鸡和猪源样品。动物肠道或拭子魏氏梭菌200株广东和邻近3个省份，其他省份养殖场或屠宰厂20个，屠宰厂为肉鸡和猪源样品。动物肠道或拭子魏氏梭菌200株湖北和邻近3个省份，其他省份养殖场或屠宰厂20个，屠宰厂为肉鸡和猪源样品。动物肠道或拭子，鼻拭子魏氏梭菌100株，副猪嗜血杆菌30株甘肃和邻近3个省份，其他
11、省份养殖场或屠宰厂20个，屠宰厂为肉鸡和猪源样品。动物肠道或拭子魏氏梭菌100株青海、宁夏及其他省份养殖场或屠宰厂10个，屠宰厂为羊源样品。动物肠道或拭子、体表淋巴结大肠杆菌100株，伪结核棒状杆菌100株，魏氏梭菌100株北京养殖场或屠宰厂20个，屠宰厂为鸡、猪源样品。泄殖腔拭子或动物盲肠 大肠杆菌200株，肠球菌200株 江苏养殖场或屠宰厂20个，屠宰厂为鸡、猪源样品。泄殖腔拭子或动物盲肠大肠杆菌200株，肠球菌200株江西、安徽养殖场或屠宰厂20个屠宰厂为鸡、猪源样品。泄殖腔拭子或动物盲肠大肠杆菌200株，肠球菌200株江苏养殖场或屠宰厂10个屠宰厂为鸡、猪源样品。泄殖腔拭子或动物盲肠弯
12、曲杆菌100株，河北养殖场或屠宰厂20个屠宰厂为鸡、猪源样品。泄殖腔拭子或动物盲肠大肠杆菌200株，肠球菌200株重庆养殖场或屠宰厂20个屠宰厂为鸡、猪源样品。泄殖腔拭子或动物盲肠大肠杆菌200株，肠球菌200株新疆养殖场或屠宰厂20个屠宰厂为鸡、猪源样品。泄殖腔拭子或动物盲肠大肠杆菌200株，肠球菌200株注：总体采样要求：根据采样地区和不同动物尽量确保菌株数量均衡。采样时，大型、中小型养殖场各半；主要采出栏前动物、鲜牛奶；分离大肠杆菌和肠球菌，每个养殖场采样3050份，分离其他细菌，根据分离率确定样品数量。屠宰厂采样时，应采集动物的盲肠样品。分离金黄色葡萄球菌要求采集新鲜牛奶。采样必须覆盖
13、农业农村部示范点。附件12019年度动物源细菌耐药性监测采样和检测技术要点一、 采样安排（一）采样地点各监测任务承担单位按照本监测计划进行选场、采样和分离细菌。同时，负责对本省内设立的全国定点监测场（见下表），长期跟踪监测大肠杆菌和肠球菌耐药性变化趋势。全国定点跟踪监测养殖场名录（首批全国兽用抗菌药使用减量化行动试点养殖场名单）序号省份（数量）养殖场通讯地址动物种类1北京市（2）北京金星鸭业有限公司中辛庄养殖基地北京市通州区漷县镇中辛庄村西肉鸭2北京众乐河畔养殖专业合作社北京平谷区南独乐河镇南独乐河村北果园1号蛋鸡3天津市（2）天津市宁河原种猪场天津市宁河区东棘坨镇艾林村南生猪4天津市广源畜禽
14、养殖有限公司天津市宝坻区大钟庄农场蛋鸡5河北省（5）石家庄双鸽润农养殖有限公司石家庄市无极县大陈镇西郎村生猪6平山县西柏坡五丰蛋鸡养殖合作社石家庄平山县南甸镇东杨庄村蛋鸡7河北滦平华都食品有限公司承德市滦平县河滨路9号肉鸡8河北乐源牧业有限公司石家庄市鹿泉区铜冶镇西任村奶牛9河北恩康牧业有限公司保定市易县独乐乡中独乐村肉鸡10山西省（3）山西桦桂农业科技有限公司阳曲县城晋驿原国营良种场肉羊11晋中市金粮农业科技开发有限公司晋中市榆次区东赵乡李焉村肉鸡12山西南山百世食安农牧业有限公司吕梁市交口县石口乡南山村生猪13内蒙古自治区（3）鄂尔多斯市赛科星养殖有限责任公司内蒙古鄂尔多斯市达拉牧旗昭君镇
15、二狗湾村奶牛14内蒙古赛诺种羊科技有限公司内蒙古乌兰察布市四子五旗乌兰花镇肉羊15内蒙古富川养殖科技股份有限公司内蒙古马彦淖尔市临河区乌兰图克镇新民五社肉羊16辽宁省（3）东官营肉鸡养殖扶贫农场北票市东官营镇皇古屯村肉鸡17瓦房店市红沿河镇忠华养殖场辽宁大连瓦房店市红沿河镇梁西村小王屯东山肉鸡18大连韩伟养鸡有限公司旅顺分公司大连市旅顺口区三涧堡待道东安路3-8号蛋鸡19吉林省（3）吉林省天惠牧业有限公司长春市绿园区合心镇东安村生猪20长春市宏大种鸡场长春市绿园区合心镇东安村蛋鸡21九台区东湖街道办事处隆达兴养殖农民专业合作社吉林省长春市九台区东湖镇腰站村八社肉牛22黑龙江省（3）杜尔伯特蒙古
16、族自治县谷实牧业有限公司哈尔滨高新技术产业开发区迎宾路集中区洪湖路28号生猪23哈尔滨市信生家禽养殖有限公司哈尔滨市呼兰区长岭街道平坊村蛋鸡24牡丹江市双利牧业有限公司牡丹江市阳明区磨刀石镇大甸子村蛋鸡25上海市（2）光明牧业有限公司新东奶牛场上海市崇明区新海镇北沿公路3126号奶牛26光明牧业有限公司金山种奶牛场上海市金山区廊下镇永光路1588号奶牛27江苏省（5）江苏立华牧业股份有限公司江苏省常州市武进区牛塘镇卢西村委河西村500号肉鸡28南通天成现代农业科技有限公司江苏省南通市海安县老坝港滨海新区滩涂垦区蛋鸡29光明食品集团上海海丰大丰禽业有限公司江苏省盐城市大丰区海丰农场蛋鸡30江苏洋
17、宇生态农业有限公司江苏省泰州市新街镇李荡村7组生猪31江苏加华种猪有限公司江苏省宿迁市泗阳县南刘集花井村生猪32浙江省（4）浙江开盛生态农业发展有限公司浙江省江山市大桥镇陈家村马车岙生猪33慈溪市新浦益大养鸡场浙江省慈溪市新浦镇腰塘村蛋鸡34浙江美保龙种猪育种有限公司浙江省金华市婺城区白龙桥镇古方二村生猪35嘉兴嘉华牧业有限公司浙江省嘉兴市桐乡市洲泉镇湘溪村周家浜北生猪36安徽省（4）安徽张晓毛食品有限公司安徽省安庆市怀宁县公岭镇三铺村蛋鸡37安徽省顺安农产品销售有限公司安徽省宁国市津河西路110号肉鸡38嘉吉动物蛋白（安徽）有限公司安徽省来安县经济开发区中央大道33号肉鸡39界首市洪理养殖专
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25、集泄殖腔或盲肠拭子分离大肠杆菌、肠球菌、沙门氏菌和弯曲杆菌；采集新鲜牛奶分离金黄色葡萄球菌。根据养殖场规模，每个场采样3050份。（三）监测细菌种类包括大肠杆菌、肠球菌（分为屎肠球菌和粪肠球菌）、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、弯曲杆菌（分为空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌）、魏氏梭菌、伪结核棒状杆菌、副猪嗜血杆菌等。沙门氏菌和金黄色葡萄球菌可根据各地分离情况进行监测。二、 调查和记录各监测任务承担单位要认真做好饲料和药物饲料添加剂来源与种类调查、采样前动物使用抗菌药物情况调查（预防用药和治疗用药）和采集样品的统计，据实填写采样记录表。三、 细菌分离与鉴定采用选择性培养基，定向做大肠杆菌、肠球菌、沙门氏菌
26、、金黄色葡萄球菌和弯曲杆菌分离，用生化试验、PCR技术或血清学方法对分离物进行鉴定。本年度分离监测的细菌种类与数量要求见附件1。分离到的菌株在-20以下加甘油保护剂冷冻保存或用其它合适方法自行保存，沙门氏菌和弯曲杆菌送中国兽医药品监察所进行血清型鉴定后保存。四、 药物敏感性测定用经中国兽医药品监察所质量认定的药敏试验板进行药物敏感性检测。检测用质控菌株由中国兽医药品监察所统一供应。五、 结果报送各单位需在11月25日前完成动物源细菌耐药性监测年度总结，并将电子版总结报送中国兽医药品监察所。中国兽医药品监察所汇总后，在12月31日前报送农业农村部畜牧兽医局。附件3采样记录表采 样 地： 养 殖
27、场： 采样时间： 联系人姓名、电话： 样品来源： 样品数量： 猪 日龄 _ 鸡 日龄 _ 牛 日龄 _其他_日龄 _ 消化道 呼吸道 泌尿生殖道 肝胆 脑 淋巴结 关节 奶样 皮肤 粪便 其他_ 采样动物健康状况 养殖量 健康 发病及症状： 。采样养殖场使用抗菌药情况饲料来源与添加抗菌药种类治疗用抗菌药种类与使用方式生产厂名称饲料添加的药物名称剂量使用时间药物名称使用方式剂量 单个动物剂量饮水添加剂量 饲料添加剂量用药天数样品分离菌株 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 肠球菌 沙门氏菌 空肠弯曲杆菌其他_菌株编号：注：菌株编号按照“菌种、来源-采样地、采样年月-菌株编号”的格式进行。如EB-L0701
28、-0001，其中：E（大肠杆菌）B（牛）L（鲁）07（年）01（月）-0001（菌株编号）。菌种简写建议为：E（大肠杆菌）、S（沙门氏菌）、SA（金黄色葡萄球菌）、ECi（肠球菌）、CJ（空肠弯曲杆菌）、CC（结肠弯曲杆菌）动物简写建议为：B（牛）、P（猪）、C（鸡）、D（鸭）注：a为喂奶猪或保温鸡，b为保育猪或生长鸡，c为育成猪或鸡，d为种母猪或产蛋鸡。附件4动物源细菌分离和鉴定方法一、动物源大肠杆菌的分离与鉴定方法1 范围本方法规定了用于动物源大肠杆菌分离与鉴定的方法。本方法适用于各种动物中大肠杆菌的分离与鉴定。2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其它设备和材料如下。2.1
29、冰箱：24和-20。2.2 恒温培养箱：361。2.3 电子天平：感量0.1g。2.4 显微镜：10100。2.5 生物安全柜。2.6 生化鉴定卡或商品化试纸条。2.7 采样管或商品化采样棉拭子。2.8 微量加样器：1L1000L。2.9 吸头（与微量加样器匹配）。3 培养基和试剂3.1 运送培养基。3.2 麦康凯琼脂。3.3 大肠杆菌阳性血清。4 大肠杆菌分离与鉴定程序 大肠杆菌分离与鉴定程序见图1。动物肛门或泄殖腔拭子运送培养基接种于麦康凯琼脂平板，361，培养1824h；挑取大肠杆菌可疑菌落纯化生化鉴定大肠杆菌图1：大肠杆菌分离与鉴定程序5.操作步骤5.1 采样 选择养殖场或屠宰场，灭菌
30、棉拭子采集动物肛门或泄殖腔样品，置入运送培养基中，保存时间不超过48小时。5.2 大肠杆菌的分离5.2.1 拭子接种于麦康凯琼脂平板，361培养1824h；5.2.2 挑取粉红色、边缘光滑的可疑菌落，麦康凯琼脂纯化一代，5.2.3 纯化后可疑菌落接种营养琼脂平板纯化，361培养1618h，待进一步细菌鉴定。5.3 大肠杆菌的鉴定对于已纯化的菌落，可使用微生物生化鉴定系统或者生化拭条进行生化鉴定。必要时，采用大肠杆菌标准血清进行血清型鉴定。二、动物源沙门氏菌的分离与鉴定方法1范围本方法规定了用于动物源沙门氏菌分离与鉴定的方法。本方法适用于各种动物中沙门氏菌的分离与鉴定。2 设备和材料除微生物实验
31、室常规灭菌及培养设备外，其它设备和材料如下。2.1 冰箱：24和-20。2.2 恒温培养箱：361和421。2.3 电子天平：感量0.1g。2.4 显微镜：10100。2.5 生物安全柜。2.6 恒温水浴锅：37100。2.7 PCR仪。2.8 电泳仪。2.9 电泳凝胶成像分析系统（或紫外透射仪）。2.10 冷冻离心机。2.11 采样管或商品化采样拭子。2.12 小型离心管。2.13 微量加样器：1L1000L。2.14 吸头（与微量加样器匹配）。2.15 漩涡仪。2.16 微波炉。3 培养基和试剂3.1 标准菌株：沙门氏菌CVCC 5413.2 DNA Maker3.3 Taq DNA 聚合
32、酶3.4 dNTP3.5 琼脂糖3.6 5TBE缓冲液三羟甲基氨基甲烷（Tris） 54.0g硼酸 27.5g0.5M EDTA（pH8.0） 20mL加纯净水至 1000mL3.7 50TAEbuffer三羟甲基氨基甲烷（Tris）242gNA2EDTA.2H2O 37.2g醋酸 57.1ml加纯净水至 1000mL3.8 invA基因引物上游为5-GTG AAA TTA TCG CCA CGT TCG GGC AA-3下游为5-TCA TCG CAC CGT CAA AGG AAC C -3 3.9 运送培养基。3.11 沙门氏菌显色琼脂。3.12 沙门氏菌阳性血清。3.13 亚硒酸盐胱氨
33、酸增菌液（SC）。3.14 四硫磺酸盐增菌液（TTB）。3.15 核酸染料。3.16 氯化钠。4 沙门氏菌分离与鉴定程序沙门氏菌分离与鉴定程序见图2。动物肠道或其他拭子运送培养基接种SC增菌液，361，培养1824h；或TTB增菌液，421，培养2224h接种沙门氏菌显色培养基挑取沙门氏菌可疑菌落纯化生化鉴定PCR鉴定沙门氏菌沙门氏菌图2 沙门氏菌的分离和鉴定程序5.操作步骤5.1 采样 选择养殖场或屠宰场，用灭菌棉拭子采集动物肠道或泄殖腔（肛门）样品，置入运送培养基中，保存时间不超过48小时。5.2 沙门氏菌的分离5.2.1 将拭子置于SC增菌液，361培养1824h 或TTB增菌液，421
34、培养2224h。5.2.2 将菌液混匀，接种沙门氏菌显色培养基，361培养2224h。5.2.3 挑取沙门氏菌显色培养基上紫色可疑菌落，接种营养琼脂平板，361培养1624h，待进一步细菌鉴定。5.3 沙门氏菌的鉴定5.3.1 生化鉴定 对于已纯化的菌落，可使用微生物生化鉴定系统或者生化拭条进行生化鉴定，或者通过5.3.2的方法进行分子生物学（PCR）鉴定。必要时，用沙门氏菌标准血清进行血清型鉴定。5.3.2 PCR法鉴定5.3.2.1 PCR模板的制备用接种环从营养琼脂上挑选1624h的纯培养物，置于0.5mL灭菌生理盐水中，12000r/min离心2min，弃上清。再加0.5mL灭菌水，悬
35、浮并涡旋混匀，100沸水中煮沸10min后，移至冰上，冷却后以12000r/min离心2min，取上清液为PCR模板。5.3.2.2 PCR反应体系的配制 根据不同厂家PCR试剂用量，配制PCR反应体系，扩增片段长度约284 bp。5.3.2.3 PCR反应条件95预变性5min，94变性30s, 64退火30s，72延伸30s, 30个循环，最后72延伸10min，同时设立阴性和阳性对照。 5.3.2.4 电泳5.3.2.4.1 1.2%琼脂糖凝胶板的制备称取1.2g琼脂糖，加入100mL0.5TBE（或1TAE）缓冲液中，加入核酸染料，依据样品数选用适宜的梳子，琼脂糖溶化后混匀倒入在水平台
36、面上的凝胶盘中，胶板厚5mm左右。待凝胶冷却凝固后拔出梳子，取出胶块放入电泳槽中，加0.5TBE（或1TAE）缓冲液淹没胶面。5.3.2.4.2 加样取10LPCR扩增产物和3L上样缓冲液混匀后加入加样孔，每次电泳时，各做一个阳性对照和阴性对照。5.3.2.4.3 电泳条件电压110V，电泳时间30min。5.3.2.5 结果判定电泳结束后，取出胶块置于紫外投射仪上打开紫外灯观察或用凝胶成像仪进行成像分析。如果某一待检样品扩增产物的条带与沙门氏菌阳性对照的条带在一条直线上，即条带与加样孔的距离相同，而阴性对照无此条带，则该样品分离到的菌株可初步判定为沙门氏菌，必要时可通过测序来进一步确证。三、
37、动物源金黄色葡萄球菌的分离与鉴定方法1 范围本标准规定了用于耐药性测定的动物源金黄色葡萄球菌的分离和鉴定方法。本标准适用于牛奶、动物组织和上呼吸道中金黄色葡萄球菌的分离和鉴定。2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1 冰箱：04和-20。2.2 恒温培养箱：361和42。2.3 显微镜：10100。2.4 商品化或自制采样管。2.5 无菌离心管2.6 离心机。2.8 商品化拭条或微生物鉴定仪。3 培养基和试剂3.1 标准菌株：金黄色葡萄球菌ATCC292133.2 显色培养基3.3 7.5%氯化钠肉汤10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤3.4 营养肉汤或BHI肉汤
38、3.5 营养琼脂 3.6 新鲜兔血浆或商品用凝固酶试验兔血浆 3.7 0.3%过氧化氢液 3.8 0.85%无菌生理盐水 4 金黄色葡萄球菌分离和鉴定程序金黄色葡萄球菌分离和鉴定程序见图3。金黄色葡萄球菌显色培养基可疑菌落营养琼脂生化鉴定1mL牛奶+9mL 7.5 %氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤，上呼吸道拭子直接放入肉汤中，混匀血浆凝固酶试验触酶试验阳性扁桃体、动物组织 金黄色葡萄球菌图3 金黄色葡萄球菌分离和鉴定程序5 操作步骤5.1 采样5.1.1 牛奶样品：到已选定的奶牛养殖场，现场采牛奶置入灭菌试管中，04保存，不超过48h。5.1.2 扁桃体、发病动物组织和上呼吸道拭子：
39、无菌操作取发病动物组织和上呼吸道拭子，上呼吸道拭子置入灭菌试管中，04保存不超过48h。5.1.3 吸取1mL牛奶样品或将上呼吸道拭子至盛有10mL 7.5%氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤中，振荡混匀。5.2 增菌和分离培养5.2.1 将上述样品匀液于361培养1824 h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长。5.2.2 将上述培养物，分别划线接种到显色培养基平板上，无菌操作将发病动物组织直接划线， 361培养2448h。5.2.3 挑取可疑菌落。用营养琼脂纯化一代，待进一步细菌鉴定。5.3 金黄色葡萄球菌的鉴定5.3.1生化鉴定 将在营养琼脂上培养24小时以内的待鉴定细
40、菌，首先进行触酶试验，应为阳性。将新鲜纯化、经触酶试验阳性待检细菌单个菌落，悬浮于5mL灭菌生理盐水，按照生化鉴定试条使用说明书操作， 37培养1824h后判读结果。5.3.2 血浆凝固酶试验法 挑取显色平板上可疑菌落1个或以上，分别接种到5mL BHI和营养琼脂平板，361培养1824h。将在营养琼脂上培养24h以内的待鉴定细菌，首先进行触酶试验，应为阳性。 新鲜兔血浆制备：称取柠檬酸钠3.8g，加蒸馏水100mL,溶解后过滤，装瓶，121高压灭菌15min。取3.8%柠檬酸钠溶液一份，加兔全血四份，混好静置 (或以3000r/min 离心30 min)，使血液细胞下降，即可得血浆。 取新鲜
41、配置兔血浆0.5 mL，放入小试管中，再加入BHI 培养物0.20.3 mL，振荡摇匀，置361温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6 h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。 四、动物源弯曲杆菌的分离与鉴定方法1 范围本标准规定了动物源空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的分离鉴定方法。本标准适用于粪便拭子和盲肠内容物中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的分离与鉴定。2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌与培养设备外，其他设备和材料如下。2.1 采样管2.2 采样棉拭子2.3 生物安全柜2.4 恒温培养箱: 251，361，421。2.5 恒温水浴锅：37100。2.6 微需氧条件：5