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1、实验一 水处理中生物相的观察与微生物测量一、实验目的和要求学习普通光学显微镜的使用和保养方法；学习观察活性污泥中生物相、要求辩认菌胶团、丝状菌、原生动物的形态，学会生物图的绘制；观察示范标本，辨认微生物的大类形态；学习测量微生物大小的方法和使用计数板测量微生物的生物量方法。验证性实验，实验时数可安排为4学时。二、实验设备与仪器1显微镜、生物摄影显微镜、计算机；2SBR生物反应器、曝气设备、活性污泥；3示范标本；4目测微计、物测微计、血球计数板；5擦镜纸、滤纸、烧杯、滴管、载玻片、盖玻片、酒精灯。三、实验前准备工作1. 预习实验指导书实验一的内容。2. 复习课堂教学有关活性污泥的组成、活性污泥在
2、水处理中的作用等内容。四、实验注意事项1. 本项实验主要内容是学会使用生物显微镜观察微生物。显微镜是精密仪器，尤其是显微镜镜头使用操作不当，容易损坏。上课前学生不要擅自使用显微镜，实验中应严格按照教师指导的方法操作。2. 学生在实验过程中应注意观察，随时记录，如，记录显微镜观察时的放大倍数，绘出微生物的形态等。3. 为了防止误食，严禁在实验室内吃东西或喝水。五、实验原理1显微镜的构造与光学原理（参见教材P144-145） 显微镜由机械装置和光学系统两部分组成。（1）机械装置镜筒：镜筒长度是160mm。镜筒上端装目镜，下端接转换器，转换器（回转板）上有35个孔，可安装物镜头。载物台：玻片和标本放
3、在载物平台上，两旁有弹簧夹，可固定玻片。载物台上自动推物器可使玻片上、下、左、右移动。调节器：可调节玻片与物镜之间的距离，大调节器又称粗调节器，升降幅度大，小细调节器属微调节器，升降幅度小，一般调焦距时才用。（2）光学部分目镜：安装在镜筒上，一般有3种规格，“5”、“10”、“15”，分别表示镜头放大倍数为5倍、10倍、15倍。一般常用10目镜。 物镜：安装在转换器上。物镜可分低倍镜（8、10、20）、，高倍镜（40、45、60）、油镜（100）三种。物镜的性能由数值孔径（numerical aperture, N.A.）决定，数值孔径（）。NA数值孔径越大，显微镜效能越大。n 折射率是影响数
4、值孔径的因素。空气折射率n=1，水的折射率n=1.33，香柏油折射率n=1.52，当光线入射角度，则，则以空气为介质时：以水为介质时：以香柏油为介质时： 显微镜的性能还依赖于物镜的分辨率，即能分辨两点之间的最小距离的能力。分辨率用表示。（为波长），一般可见光波长在0.380.7，是不能缩短的，所以只有通过增大N.A.来提高分辨率，（分辨率值越小越好）。物镜上标有N.A.1.25、100、“OL”、160/0.17、0.16等字样，其中N.A.1.25是数值孔径，100是放大倍数，“160/0.17”中160表示镜筒长，0.17表示要求盖片厚度为0.17mm。“OL”表示油镜。0.16是工作距离
5、。显微镜的总放大倍数为物镜放大倍数和目镜放大倍数的乘积。聚光器：安装在载物台下方。聚光器可集合反光镜反射率的光线，可上、下调整，调节光线强弱，光线过强时，将聚光器向下移动。反光镜：可反射光线到聚光器上。当光源为自然光时用平面镜，光源为灯光或使用油镜头时，用凹面镜。滤光片：可选用合适的滤光片，以提高分辨力，增加反差和清晰度。六、实验内容1观察活性污泥中生物相、辩认菌胶团、丝状菌、原生动物的形态，学会生物图的绘制； 2观察放线菌、真菌、藻类的形态；3学习测量微生物大小的方法；4学习使用计数板测量微生物的生物量方法。七、实验方法与步骤1显微镜的操作方法：（1）低倍镜的操作 1) 调光：旋动转换器，将
6、低倍镜移至镜筒正下方 转动反光镜对着光源处集光 眼睛对准目镜（10），转动反光镜使视野变亮。 2) 观察物体：将玻片放在载物台上 标本放在载物台上圆孔的正中央 眼睛从侧面注视物镜头 使用粗调节器使镜头下降，注意防止物镜与玻片相碰 眼睛对着目镜观察视野 使用粗调节器使镜筒上升（即使镜头与载物台分开） 注意观察图像 再用细调节器调整焦距，使图像清晰 观察生物相。 （2）高倍镜头使用： 用低倍镜找到所要观测的图像 慢慢旋转转换板将物镜转换成高倍镜头（40） 再用细调节器调清图像 观察生物相。 （3）显微镜使用注意事项与保护方法：1）当眼睛对准目镜头观察时，千万不能使用粗调节器使镜筒与载物台相碰撞（否
7、则将会损坏镜头），即观察时应该使物镜头与载物台分离，防止物镜压碎载玻片。2）镜头应用擦镜纸擦试。3）用完显微镜后，应将载物台上载玻片取下，擦试镜头，镜筒下落盖上布罩防止污染。4）显微镜应放在干燥处，避免碰撞和日光照射。2. 压滴法观察活性污泥中生物相 (1) 取1滴活性污泥放到载玻片上 加盖一片盖玻片 放到载物台 用低倍镜观察 用粗调节器调图像 细调节器调清图像 用左眼看视野 右眼绘图 记录放大倍数。(2) 绘出菌胶，丝状菌，原生动物等形态草图。3. 示范标本的观察 （1）用低倍镜观察酵母菌、霉菌、放线菌、藻类等，示范玻片。观察各类微生物形态特征。 （2）在低倍镜下将图像调至视野中心 直接慢慢
8、转动转换板 将高倍镜头放在镜筒下方用细调节器调清图像 绘出你所观察的生物的形态草图，注明放大倍数和微生物名称。4. 微生物的测量 （1）目尺和物尺的使用方法 1）目尺：是圆形玻片，中央刻有100个等分刻度，刻度大小随镜头放大倍数和镜筒长度而变，使用前应该用物尺进行标定。目尺是安装在目镜头中使用的。 2）物尺：物尺刻在载玻片上，有100等分刻度，每等分长度为10 m。 3）物尺标定目尺 目尺放入目镜中 物尺放在载物台上 用低倍镜调物尺图像 移动载物台上自动推动器 使目尺与物尺的第一条线重合 观察两个尺子的第二条重合线的位置 记录重合部分中的物尺格数和目尺格数， 计算一格目尺代表的距离数。 （1.
9、1）记录放大倍数。 4）细胞大小的测量： 将镜筒上升 取下物尺 将待测量标本玻片放在载物台视野下方 用低倍镜找图像 使用目尺测量，记录所观察标本占有目尺的格数 记录放大倍数 计算微生物尺寸大小。5. 微生物细胞的计数（1）血球计数板的结构与使用方法血球计数板玻片中央刻有四条槽，中央两条槽之间的平面比其他平面略低，中央有一小槽，槽的上、下方两边的平面上各刻有方格，中间的大方格是计数室，其长=宽=1 mm，深度= 0.1 mm，则方格中的体积=0.1 mm3。计数室有两种规格：一种是大方格分为16中格，每中格分成25小格，共1625=400格；另一种是大方格分为25中格，每中格分为16小格，其总格
10、数为2516=400格。计数方法 1）1625计数板计算公式 细胞数/ （1.2） 2）2516计数板计算公式 细胞数/ （1.3） （2）血球计数板计数操作步骤1）取干净血球计数板 用盖玻片盖住中央计数室 用滴管取少许摇匀菌悬液于盖玻片边缘菌液渗入计数室 静置5-10 min。2）将计表板置于载物台 用低倍镜找方格网 换高倍镜观察计数 用细调节器上下旋动，可看到计数器不同深度菌体，记数。3）如计数板是1625规格，数大方格中四个角的四个中格（100小格）内的细胞数目 用公式（1.2）计数。如计数板是2516规格 数大方格中四个角上四个中格，和大方格正中的一个中格（即80小格）中细胞数目 用公
11、式（1.3）计数。4）注意：如细胞位于大格线上，只计格线的上方和左方线上细胞数。5）每个样品重复计数3次，取平均值，再按公式计算每ml菌液中所含的酵母菌数。八、实验数据整理1压滴法观察活性污泥生物相记录（1）绘出活性污泥中生物相种类的形态草图。（2）注明观察微生物时显微镜放大倍数。记录格式如表1.1。表1.1 活性污泥生物相记录序号生物相名称放大倍数形态草图122示范标本的观察（1）绘出藻类形态草图，注明菌种名称和放大倍数。（2） 绘出真菌形态草图，注明菌种名称和放大倍数。（3） 绘出放线菌形态草图，注明菌种名称和放大倍数。 3微生物大小的测量（1）目尺与物尺的校正记录，记录格式如表1.2。表
12、1.2 目尺与物尺的校正记录显微镜放大倍数目尺格数物尺格数m /格目尺计算公式：（2）生物细胞大小的测量表1.3 微生物大小的测量记录生物名称放大倍数m/格目尺测量细胞时目尺格数生物尺寸 4微生物细胞数的测量 （1）记录血球计数板中每小格中细胞个数，见表1.4。表1.4 微生物细胞数量测量记录序号细胞所在位置细胞数1左上格中细胞数2左下格中细胞数3右上格中细胞数4右下格中细胞数5正中格中的细胞数取样稀释倍数 （2）用公式计算每mL菌液中含细胞数目。5. 实验结果与思考（1）压滴法观察的生物是活体的还是死亡的？（2）举例说明如何计算显微镜放大倍数。（3）活性污泥中生物有哪几个种类组成，它们在水处理中有何作用？（4）说明目尺在测量微生物大小时为何要校正。