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1、项目8：外界因素对细菌的不利影响【目的要求】1.认识常用的消毒灭菌器和滤菌器。2. 掌握常用消毒灭菌方法。3. 初步掌握药敏试验纸片琼脂扩散法的操作。【实验材料】1. 高压蒸汽灭菌器、干烤箱、滤菌器等。2. 培养基 普通琼脂平板、肉汤培养基、M-H（水解酪蛋白琼脂）培养基、抗生素药敏纸片、常用化学消毒剂等。3. 菌种 枯草芽胞杆菌、大肠埃希菌肉汤培养物，金黄色葡萄球菌、痢疾志贺菌6h或1824h培养物等。4. 其他 紫外灯、黑纸片、无菌镊子、水浴箱、温度计、无菌棉签、酒精灯、接种环等。【实验内容与方法】微生物广泛存在于周围环境中，其中有些又是病原微生物，从预防感染出发，医务工作者必须严格执行无
2、菌操作，对所用的物品和工作环境进行消毒灭菌，确保医疗与科研正常进行。消毒灭菌主要是通过理化因素使微生物的主要代谢发生障碍，或菌体蛋白质变性凝固，或破坏其遗传物质，导致微生物死亡。这里主要介绍物理因素杀灭微生物的几种方法，以及相关器材的使用。（一） 常用消毒灭菌器和滤菌器的介绍（示教）1. 高压蒸气灭菌器 是目前医院常用的灭菌器，高压蒸气灭菌法是一种迅速而有效的灭菌方法。（1）种类：高压蒸气灭菌器是目前应用最广泛、灭菌效果最好的灭菌器具，其种类有手提式、直立式、横卧式等。它们的构造及灭菌原理基本相同。（2）构造及原理：高压蒸汽灭菌器是一个密闭的耐高温和耐高压的双层金属圆筒，两层之间盛水。外壁坚厚
3、，其上方或前方有金属厚盖，盖有螺栓，借以紧闭盖门，使蒸汽不能外溢。高压蒸汽灭菌器上还装有排气阀、安全阀、压力表及温度计。加热后，灭菌器内蒸汽压力升高，温度也随之升高，压力越大，温度越高。（3）用法与注意事项：使用高压蒸汽灭菌器时，需加一定容量的水于灭菌器内，放入待灭菌物品后，盖好器盖并将螺旋拧紧加热，待压力升至34.47kPa时，打开排气阀，排除器内冷空气，再关闭排气阀。待蒸汽压力升至所需压力(一般为103.43kPa)时，持续1520min即可达到灭菌目的。灭菌完毕，停止加热，缓缓排气，待其压力下降至零时，开盖取物。灭菌时必须加足量的水；盛物桶内的物品勿置过挤；冷空气必须排尽；切不可突然打开
4、排气阀门排气减压，以免因压力骤然下降而使器内液体外冲。（4）用途：高压蒸汽灭菌可用于耐高温、高压及不怕潮湿的物品，如普通培养基、生理盐水、纱布、敷料、手术器械、玻璃器材、隔离衣等的灭菌。2. 干烤箱 为干热灭菌器，干热的杀菌作用是通过脱水干燥和大分子变性完成的。（1）构造：干烤箱是中间夹着石棉的双层金属制成的方形或长方形箱，箱底装有热源，箱内有数层金属架，并附有温度计和自动温度调节器等装置。（2）用法：将需要灭菌的物品包装后放入箱内，闭门加热。温度升到160170 ，维持2h，可达到灭菌目的。灭菌后停止加热，待温度下降至40以下方可开门取物，否则其内物品(如玻璃器皿等)会因温度骤然下降而爆裂。
5、（3）用途：干热灭菌主要用于要求干燥的、耐高温的物品灭菌，如玻璃器材、凡士林、液体石蜡、药粉等的灭菌。注意事项： （1）温度不可超过180以免烧焦棉塞及包装纸。 （2）灭菌后须待温度下降至接近室温时方可打开箱门，否则冷空气骤进而使玻璃器皿破裂。（3）干烤灭菌主要应用于玻璃、陶瓷制品、凡士林、液体石蜡等的灭菌。3. 滤菌器 是一种用物理阻留的方法将液体中细菌除去达到无菌目的的仪器。常用于不耐热的培养基、血清、溶液及药品的除菌或分离细菌外毒素及病毒等。常用的滤菌器有两种：蔡氏滤菌器：为金属滤菌器。以石棉为滤板，每次用后换一石棉滤板。石棉滤板按孔径大小分为K号和EK号两种。前者可供滤清用，后者能阻止
6、细菌通过。玻璃滤菌器：由用玻璃粉制成，用时比较方便，但孔径易堵塞。孔径大小由0.15250m不等，一般分为GG，G和G号均可阻止细菌通过。滤菌器使用法：将清洁的滤液、滤瓶等分别用纸包装后，15磅高压蒸汽灭菌20分钟。以无菌操作将滤器与滤瓶装妥，并使滤瓶的侧管与抽气机的抽气橡皮管相连（或中间装压力计及缓冲空瓶）。倒入被滤液体，开动抽气机，使滤瓶中压力减少，滤液流入瓶中的试管内。滤毕，关闭抽气机，先将抽气橡皮管从滤瓶侧管处拔下，再启开橡皮塞，迅速以无菌操作方法取出瓶中滤液，移放于无菌玻璃器内。若滤瓶中原装有试管者，则将该盛有滤液的试管取出即可。 （二） 煮沸杀菌试验（操作）1. 取六支肉汤培养基，
7、编为1、2、3、4、5、6号，1、2、3三管接种大肠埃希菌(无芽胞菌)，4、5、6三管接种枯草芽胞杆菌(有芽胞菌)。2. 将1、4两管同时放入100水浴内煮沸5min，取出置37温箱培养1824h观察细菌生长情况。3. 将2、5两管同时放入100水浴内煮沸1h, 取出置37温箱培养1824h观察细菌生长情况。3、6两管不加热作对照，置37温箱培养1824h观察细菌生长情况。结果：3、6两对照管有细菌生长；1、2、5管无细菌生长；4号管有细菌生长。（三） 紫外线杀菌试验（操作）紫外线中波长为200300nm者具有杀菌能力，其中265266nm的杀菌作用最强。日光中含有一部分紫外线，而医学上使用的
8、常以人工紫外线灯产生。常用的是水银灯，灯管由石英制成，管内充满压强为2mmHg的氩和几滴水银。封入两端的电极是螺旋形的钨丝，其表面涂碱土族元素的氧化物。当电极被烧热时，钨丝上氧化物就放出大量电子。因而交流电流，故两端灯丝交互成为阴极，使用时按上电键，先将钨丝烧红，这时在钨丝附近形成很多电子。经23秒钟后，打开电键，截断电路（有的水银灯装有起动器（Star），以替代电键的开关），此时由于扼流圈的存在，发生脉冲高电压；同时在管内的氩气开始辉光放电，使管略发热，水银蒸汽压变为0.lmmHg时，即在其蒸汽内产生电弧，而这种电弧里含有大量的紫外线。原理 其杀菌作用主要是因为DNA吸收了紫外线引起胸腺嘧啶
9、形成二聚体，从而干扰了DNA的复制，轻则发生突变，重则导致死亡。紫外线杀菌力强而稳定，但穿透力弱，不能透过普通玻璃和有色纸张，因此，只适用于直接照射的物体表面消毒或空气消毒。 使用方法 将涂有细菌的平皿放置在距紫外线60100cm处，直接受紫外线照射30min后，37孵育24h后观察生长情况。1. 用无菌接种环取大肠埃希菌肉汤培养物，密集划线接种于普通琼脂平板。2. 用无菌镊子把经灭菌的黑色纸片贴于平板表面中央部分。3. 打开皿盖的2/3，置于紫外灯下距离约2030cm处照射30min。4. 除去纸片，盖好平皿盖，置37温箱培养1824h观察细菌生长情况。结果：纸片及平皿盖遮盖处有细菌生长，未
10、遮盖处无细菌生长。（四） 细菌对药物的敏感试验-纸片琼脂扩散法（亦称K-B法）(操作) 【材 料】 普通琼脂平板、葡萄球菌培养液、大肠杆菌培养液、灭菌棉签、灭菌滤纸片、琼脂平板、尖头镊子、青、氯霉素纸片。【方 法】1. 取M-H琼脂平板一个，用蜡笔在平皿底部标出贴药敏纸片的位置。各纸片中心距离应大于24mm，纸片中心距平板边缘距离应大于15mm。2. 用无菌棉拭子蘸取6h的大肠杆菌或葡萄球菌培养物(菌液)，在管内壁旋转挤去多余菌液，均匀涂布在M-H培养基表面，反复涂布3次，每次旋转平板60度角度，最后沿平板内缘涂抹一周。3. 待稍干后，用无菌镊子取药敏纸片，按标记位置贴于培养基表面。4. 将贴
11、上纸片的平板置37温箱培养1824h后观察结果。结果：对抗生素敏感的细菌在药敏纸片的周围形成抑菌环，抑菌环直径标准判断因抗生素及细菌种类不同而异，根据抑菌环直径的大小，结合药物的性质，报告细菌对药物的敏感性。一般以敏感、中度敏感、耐药来判定药敏实验结果。判定标准：实验条件不同判定标准可有所不同。一般抑菌环直径在15mm以上者为高度敏感，1015mm为中度敏感，10mm以下为低度敏感，无抑菌环者为耐药。附：抑菌环解释标准及相应的最低抑菌浓度抗生素纸片含量(g/片)抑菌环直径解释标准(mm)耐药中介敏感青霉素102829氨苄青霉素20/101314-1718先锋霉素301415-1718链霉素10
12、1112-1415庆大霉素101213-1415红霉素151314-2223卡那霉素301314-1718丁氨卡那301415-1617磺胺嘧啶2501213-1617头孢菌素类301415-1718阿莫西林20/101314-1718环丙沙星51516-2021诺氟沙星101213-1617利福平51617-1920万古霉素30910-1112【附录】 药物纸片的制备：取普通滤纸用打洞机打成直径6mm的圆形纸片，浸于一定浓度的抗生素中，每枚纸片的药物含量：青霉素1u，其它抗生素10g，磺胺100g。（五） 皮肤消毒试验(操作)【材 料】 无菌棉签、镊子、2%碘酒、75%酒精、普通琼脂平板【方 法】1将普通琼脂平板底部用记号笔分成二等分，分别注明“消毒前”与“消毒后”。2将一手指，在注明“消毒前”的平板表面，轻轻地来回涂抹；然后将此手指用2%碘酒消毒，再用75%的酒精脱碘，待干后，再在注明“消毒后“的平板表面轻轻涂抹。将琼脂平板置37孵箱中培养24小时，观察结果。【实验报告】1. 列出常用消毒灭菌器和滤菌器的种类，说明其使用方法、用途及注意事项。2.记录并分析煮沸杀菌试验的实验结果。3.记录并分析紫外线杀菌试验的实验结果。4. 记录药物敏感试验的方法及结果，分析其实际意义。5. 记录皮肤消毒试验的实验结果。