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1、第8章 小RNA,发现RNA干扰,- 1) 植物转基因沉默 2) 线虫RNA注射实验 3) 线虫发育突变研究,植物转基因沉默,1989年Matzke等将控制紫色花的基因导入矮牵牛细胞, 获得再生植株。由 于 导入矮牵牛的转基因含有反向尾-尾重复的结构，产生正义和反义基因 转录产物，基因转录产物形成dsRNA, 导致转基因和内源基因的沉默,使原 本产生紫色花色的花瓣变成白色. 这是首次双链RNA导致基因沉默. 称之 为转录后基因沉默 (PTGS)。,Dr. Marjori Matzke Dr. Antonius Matzke,线虫双链RNA分子导致基因沉默,1995年Cornell大学的研究人员
2、Guo和Kemphues在研究阻断秀丽新小杆线虫中par-1基因时，发现反义RNA 和正义RNA都可阻断par-1 基因表达, 作者对此未给出合理解释。 Cell 81: 611620，1995 1998年2月Fire和Mello证实，Guo等报道的结果源于微量RNA双链污染所致。纯化的双链RNA阻断靶基因的表达效率高于单链反义RNA约2个数量级。 Fire等对dsRNA调控内源基因表达称之为: RNA interference, 简称RNAi, 即RNA 干扰. Nature 391:80611，1998,mex-3 RNA干扰对内源mRNA水平的影响,Fire等，Nature 391: 8
3、0611，1998,RNA干扰实验： a)负对照线虫胚 胎，未注射RNA ,无探针杂交。 b)未注射线虫胚 胎，探针杂交， 显示强杂交信 号内源mRNA。 c)单链反义RNA注 射线虫胚胎， 弱杂交信号。 d)纯化双链反义 RNA注射线虫 胚胎，内源目 标RNA完全降解。,线虫突变体研究发现microRNA,线虫发育,1）秀丽线虫是模 式生物。雌虫 含959个体细 胞，雄性成虫 只有1031个体 细胞。 2）线虫从一个受 精卵发育到成 虫需经历阶4个 幼虫阶段和一 个成虫阶段， 受基因调控。,线虫发育突变与小分子RNA,1988年夏Abros小组克隆影响线虫幼虫发育lin-4基因， lin-4
4、基因突变阻止线虫从L1期进入L2期。他们 发现lin-4可能转录非编码RNA。 Cell 57: 49-57，1989 1993年Ruvkun实验室克隆到线虫突变基因lin-14 ， lin-14突变使L4期线虫多蜕一次皮。lin-14基因3 末端与lin-4基因3末端有互补序列。 Cell 75:843-54，1993 2000年Ruvku G等采用定位克隆分离到let-7基因。 let-7基因编码小RNA，可使lin-41基因沉默，使幼虫过早进入成虫期。 这些小RNA现在被称为microRNA，即miRNA。Nature 403:901-905，2000,lin-4 和let-7RNA发育
5、调控,线虫的发育受时序调控基因控制： L1末期：lin-4表达上调，lin-14 mRNA水平降低，幼虫进 入L2 期。 L3/L4期：let-7表达上调使lin-41 mRNA水平降低，幼虫进 入成虫期。 Lin-14，Lin28, Lin-41和Lin-29，编码蛋白质基因。 Lin-4，Let-7，编码干扰RNA基因。,lin-4 miRNA和let-7 miRNA干扰靶mRMA,lin-4和let-7与靶mRNA之间有多种互作方式. Nature 403:901-905, 2000,let-7 miRNA打靶基因lin-14 mRNA,lin-4和let-7基因的转录产物为RNA，在细
6、胞中可形成茎环结构，并加工成22 nt 双链小RNA。上图显示let-7转录产物与被调控的lin-14基因3-端的7个重复序列互补。 Cell, 1993, 75:843-54,microRNA的命名,1）Ambros实验室利用分子杂交发现在线虫不同龄 期幼虫，存在两种大小的小RNA：22-nt和65- nt， 22-nt是功能小RNA终产物。 2）Bartel实验室在线虫，果蝇和人体细胞中发现 存在许多类似lin-4和let-7的保守的小RNA。 Ambros实验室以及Bartel实验室分别对上述长度为21-24 nt，具有干扰靶基因表达的小RNA取名为microRNA。Science 29
7、4：862，2001 Science 294：858, 2001,miRNA转录与加工,miRNA基因首先转录成 pri-miRNA，在细胞核内形成茎环结构。 茎环结构被DGCR8识别，在基部切离并释放pre-miRNA。 c，d) pre-miRNA进入细胞质与RNaseIII酶Dicer结合，酶切产生22nt双链RNA。 e) 双链RNA中有一条单链miRNA与RISC结合，随后与靶mRNA互作，打靶mRNA。,miRNA如何调控基因表达,miRNA主要调控mRNA的 翻译： 1）抑制Cap-40S翻译起始 装置的组装； 2）抑制核糖体大亚基60S 组装成核糖体； 3）抑制翻译延伸； 4）
8、将核糖体驱逐脱离翻译 模板； 5）使翻译的新肽链降解； 6）将mRNA拘留在P-小体 中； 7) 促使mRNA 降解； 8) 切割mRNA; 9) 介导染色质重排抑制转 录。,https:/de.wikipedia.org/wiki/MicroRNA,动物miRNA基因的结构与分布,动物miRNA基因属于 PolII基因,加帽与加 尾,有三种分布方式: 1)独立基因结构 2)内含子中(mirTron) 3)外显子中 4)3UTR 人类基因组约50% miRNA 基因成簇状排列。1/4人类 miRNA位于内含子中.,人类基因组中miRNA基因的组成,根据结构特征在人类基因组中已经注释的miRNA
9、基因为328个, 估计可能多于1000, 占总基因数1%. 推测人类基因组中约60%的基因受miRNA调控。 约40%的miRNA基因为PolII转录. 绝大多数miRNA与靶标mRNA结合的位点在3UTR区, 其中miRNA 的5端2-7nt最重要， 5端2-7nt为种子序列。,miRNA的抑制效果比较温和,1）研究发现，每个特异miRNA均可抑制多个靶mRNA。在脊椎动物miRNA 抑制效果表明，平均每个miRNA可抑制约400个保守的靶基因。 2）实验证实，单个miRNA虽可抑制数百个不同蛋白质的翻译，但就抑制效果而言，干扰程度微弱，处在温和水平，低于两倍数量。 因此，虽然miRNA是一
10、种保守的起源古老而且分布广泛的转录后调控基因表达的方式，但只是在精细调控上发挥作用。因而有人将其称之为是一种基因调控中的“消震”措施。 Genome Res. 19: 92105，2009,植物miRNA,植物miRNADCL1类,植物miRNA与动物 miRNA的区别: 1)成熟miRNA在细胞 核内完成. 2)植物miRNA的两个3 末端有2nt突出,被 甲基化。防止被尿 嘧啶化，阻止降解。 3)植物miRNA与靶 mRNA互补程度高, 主要引起mRNA降 解.,植物miRNA的产生及其打靶机制,a）DICER加工双链RNA产生 miRNA。植物的DICER称 为DCL,有4类（DCL1-
11、 DCL4），具dsRNA内切 核酸酶活性。DCL1与 miRNA加工有关。 b) 植物miRNA的3端有两 个碱基突出，甲基转移 酶HEN1在miRNA 3端 添加甲基。 c) miRNA 在AGO蛋白的协 助下打靶切割目标mRNA Trends in Plant Science 15：337-345 ， 2010,动物和植物miRNA的区别,1) 序列组成及靶标: 植物miRNA序列与靶mRNA序列互补程度高，导致靶mRNA降解。动物miRNA序列与靶mRNA序列互补程度略低, 抑制靶mRNA翻译。 2) 作用位点: 动物中miRNA的作用位置主要在靶mRNA的3-UTR。 植物中miRNA的作用位置可在靶mRNA的3-UTR, 但更多在编码区. 3) 加工场所：植物成熟miRNA在细胞核内完成,动物成熟miRNA在细胞质内完成。 4) 植物miRNA的两个3末端-OH被甲基化。,谢谢!,Thanks!,