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1、第1页，此课件共61页哦第2页，此课件共61页哦 设计试验，请用生物工程学的原理和方法生设计试验，请用生物工程学的原理和方法生产治疗糖尿病的胰岛素？产治疗糖尿病的胰岛素？第3页，此课件共61页哦 分离胞内产物与胞外产物的差别是什么？分离胞内产物与胞外产物的差别是什么？v为回收和提纯胞内产品为回收和提纯胞内产品,必须先将它们从必须先将它们从胞内释放到胞外胞内释放到胞外,然后进行分离纯化。然后进行分离纯化。v可以采用分泌性宿主使胞内产物直接分可以采用分泌性宿主使胞内产物直接分泌到胞外泌到胞外;v也可用破碎细胞的方法使其释放出来。也可用破碎细胞的方法使其释放出来。第4页，此课件共61页哦v细胞与液体
2、物质的分离又称为固液分离，固细胞与液体物质的分离又称为固液分离，固液分离方法包括过滤与离心沉降。液分离方法包括过滤与离心沉降。一、过滤一、过滤 指利用多孔性介质截流固体悬浮液中的固指利用多孔性介质截流固体悬浮液中的固体颗粒，进行固液分离的方法。体颗粒，进行固液分离的方法。过滤不但是传统的化工单元，而且是目过滤不但是传统的化工单元，而且是目前工业生产中用于分离细胞和不溶性物质的前工业生产中用于分离细胞和不溶性物质的主要方法。主要方法。第5页，此课件共61页哦过过 滤滤一般过滤：微生物、动植物细胞一般过滤：微生物、动植物细胞膜过滤：膜过滤：蛋白质等物质的选择性分离蛋白质等物质的选择性分离一般过滤：
3、以压力差作为推动力。一般过滤：以压力差作为推动力。第6页，此课件共61页哦v沉降法沉降法：指固体颗粒在外力作用下与液体物质做：指固体颗粒在外力作用下与液体物质做相对运动最终实现固液分离的技术。相对运动最终实现固液分离的技术。v沉降法根据作用外力的不同，可分为沉降法根据作用外力的不同，可分为重力沉降重力沉降和和离心沉降离心沉降。第7页，此课件共61页哦v离心沉降是利用惯性离心力和物质的沉降系数离心沉降是利用惯性离心力和物质的沉降系数或浮力密度的不同而进行的一项分离、浓缩或或浮力密度的不同而进行的一项分离、浓缩或提取条件。提取条件。1）离心沉降的原理：）离心沉降的原理：固体和液体之间存在一定的固体
4、和液体之间存在一定的密度差密度差，且固体，且固体密度大于液体的密度。密度大于液体的密度。2）影响离心沉降速度的）影响离心沉降速度的因素因素密度差密度差、颗粒大小颗粒大小、液体粘度液体粘度、离心力大小离心力大小第8页，此课件共61页哦vu=d2(s)r2/18 1)密度差越大密度差越大(s)，离心沉降速度越快；，离心沉降速度越快；2)固体颗粒尺寸越大，越容易离心固体颗粒尺寸越大，越容易离心;3)液体粘度液体粘度越大，越不容易离心；越大，越不容易离心；4)离心力离心力r2的大小对固液分离影响很大。的大小对固液分离影响很大。第9页，此课件共61页哦v3）离心机的分类离心机的分类分离因数分离因数 Fr
5、 r2g分离因数分离因数 Fr 的大小分为的大小分为11)Fr3000 常速离心机常速离心机12)Fr 30005 000 中速离心机中速离心机13)Fr 5000 高速离心机高速离心机14)Fr=2104106 超速离心机超速离心机第10页，此课件共61页哦v离心分离法根据其操作方式的不同，又可分为离心分离法根据其操作方式的不同，又可分为差速差速离心离心和和密度梯度离心密度梯度离心。如果所要的蛋白质如果所要的蛋白质(或生物大分子或生物大分子)主要集中在某一细胞组主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性的细胞质等；分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性的细胞质等；则可利用则可利用
6、差速离心（差速离心（differential centrifugation）方法方法将将它们分开收集，该细胞组分作为下步纯化的材料。它们分开收集，该细胞组分作为下步纯化的材料。第11页，此课件共61页哦优点优点：可以一下子除去很多杂蛋白质，使纯化工：可以一下子除去很多杂蛋白质，使纯化工作容易得多。作容易得多。如果碰上所要蛋白质是与细胞膜或膜质细胞如果碰上所要蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当的介质提取。结构解聚，然后用适当的介质提取。第12页，此课件共61页哦差速离心是利用不同差速离心是利用不同离心速度离心
7、速度产生产生不同离不同离心力心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分，将各种亚细胞组分和各种颗粒分别分开。别分开。不同物质有不同的形状、大小、质量和密度不同物质有不同的形状、大小、质量和密度，当在介质中离心时，它们的，当在介质中离心时，它们的沉降速度沉降速度各有各有差异。差异。第13页，此课件共61页哦大的颗粒碎片在低速时很快沉降，被分离大的颗粒碎片在低速时很快沉降，被分离的物质留在上清液中的物质留在上清液中;逐步增加离心力，进一步离心上清液，逐步增加离心力，进一步离心上清液，使中等颗粒沉降，使中等颗粒沉降，最后是大小和密度最小的颗粒沉降。最后是大小和密度最小的颗粒沉降。1注意：每次得到的沉淀，必须
8、经过几次洗涤注意：每次得到的沉淀，必须经过几次洗涤后，反复悬浮和离心，才能得到比较纯的部后，反复悬浮和离心，才能得到比较纯的部分。分。第14页，此课件共61页哦第15页，此课件共61页哦为了将细胞中各种组分纯化分离，首先要在为了将细胞中各种组分纯化分离，首先要在等渗缓冲液中把细胞破碎匀浆等渗缓冲液中把细胞破碎匀浆;然后用差速离心的方法，把匀浆液中的各种然后用差速离心的方法，把匀浆液中的各种组分分离组分分离;在离心场中，不同大小的颗粒沉向离心管底在离心场中，不同大小的颗粒沉向离心管底部的速率不同。部的速率不同。第16页，此课件共61页哦1当离心力低，离心时间短时，当离心力低，离心时间短时，细胞核
9、细胞核即可沉到管底；即可沉到管底；1加大离心力后，又可分离出加大离心力后，又可分离出线粒体线粒体；1离心力再加大，才能分离出离心力再加大，才能分离出微粒体微粒体和和核糖体核糖体。1最后几步的超离心力，可超过地心引力的最后几步的超离心力，可超过地心引力的10万倍以上，万倍以上，悬液经离心分离出核糖体以后所剩的上清液，则是由悬液经离心分离出核糖体以后所剩的上清液，则是由细胞细胞原生质的可溶性部分原生质的可溶性部分和和极微小的颗粒极微小的颗粒所组成，这些组分则所组成，这些组分则需要更严格的离心方法才能分离出来需要更严格的离心方法才能分离出来 第17页，此课件共61页哦v也称分级区带离心，有：也称分级
10、区带离心，有：1）蔗糖密度梯度离心）蔗糖密度梯度离心2）氯化铯密度梯度离心）氯化铯密度梯度离心1用于用于RNA-DNA混合物、核蛋白体亚单位混合物、核蛋白体亚单位和其他细胞成分的分离和其他细胞成分的分离第18页，此课件共61页哦v一般密度梯度离心法一般密度梯度离心法：把样品铺放在一：把样品铺放在一个个连续连续的液体密度梯度上，然后进行离的液体密度梯度上，然后进行离心，并控制离心分离的时间，使得粒子心，并控制离心分离的时间，使得粒子完全沉降之前，在液体梯度中移动而形完全沉降之前，在液体梯度中移动而形成成不连续不连续的分离区带。的分离区带。第19页，此课件共61页哦第20页，此课件共61页哦v等密
11、度梯度离心法等密度梯度离心法：不同粒子存在：不同粒子存在密度差密度差时时，在离心力场作用下，粒子或向下沉降，或向，在离心力场作用下，粒子或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们密度恰好相等的位上浮起，一直移动到与它们密度恰好相等的位置上（即置上（即等密度点等密度点）并形成区带，此即）并形成区带，此即等密等密度梯度离心法度梯度离心法。第21页，此课件共61页哦第22页，此课件共61页哦v1 1）离心过滤的原理）离心过滤的原理以以离心力离心力作为推动力完成作为推动力完成过滤操作过滤操作,具有具有离心离心和和过滤过滤的双重作用。的双重作用。2 2）影响离心过滤速度的因素）影响离心过滤速度的因素 过滤
12、面积和离心力过滤面积和离心力第23页，此课件共61页哦v离心过滤机可分离固体密度大于或离心过滤机可分离固体密度大于或小于液体密度的悬浮液。小于液体密度的悬浮液。v可分为可分为:连续式离心机连续式离心机和和间歇式离间歇式离心机心机。第24页，此课件共61页哦v细胞破碎细胞破碎：指选用指选用物理物理，化学化学，酶酶或或机械机械的方法来的方法来破坏细胞壁或细胞膜。破坏细胞壁或细胞膜。第25页，此课件共61页哦细胞壁化学组成非常复杂细胞壁化学组成非常复杂,取决于取决于1微生物类型微生物类型1细胞的年龄细胞的年龄1细胞的生长生理学细胞的生长生理学1多糖，脂质，蛋白质在三维结构上的排列方多糖，脂质，蛋白质
13、在三维结构上的排列方式式第26页，此课件共61页哦第27页，此课件共61页哦v破碎率：破碎率：被破碎细胞的数量占原始细胞数量的被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分数。百分数。1）直接记数法）直接记数法2）间接记数法）间接记数法第28页，此课件共61页哦v平板计数技术平板计数技术需时长；只有活细胞才能计数；会产生需时长；只有活细胞才能计数；会产生误差误差v血球细胞器上用显微镜计数血球细胞器上用显微镜计数快速而简单，但细胞小计数困难快速而简单，但细胞小计数困难第29页，此课件共61页哦在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量（如可溶性蛋白，酶等）。的
14、化合物的量（如可溶性蛋白，酶等）。将破碎后的细胞悬液离心去掉固体（完整细将破碎后的细胞悬液离心去掉固体（完整细胞和碎片），然后对上清液进行含量或活性胞和碎片），然后对上清液进行含量或活性分析。分析。酶活性是破碎程度的很好指示参数。酶活性是破碎程度的很好指示参数。第30页，此课件共61页哦破碎方法破碎方法机械法机械法非机械法非机械法固体剪固体剪切作用切作用液体剪液体剪切作用切作用珠珠磨磨法法压压榨榨法法高高压压匀匀浆浆超超声声破破碎碎酶酶溶溶法法化化学学法法物物理理法法第31页，此课件共61页哦作用机理：作用机理：微生物细胞微生物细胞悬浮液悬浮液与极细的与极细的研磨研磨剂剂在搅拌浆作用下充分混匀
15、，珠子之在搅拌浆作用下充分混匀，珠子之间及珠子与细胞之间相互间及珠子与细胞之间相互剪切剪切、碰撞碰撞，促使细胞壁破裂，释放出内含物。促使细胞壁破裂，释放出内含物。第32页，此课件共61页哦影响因素：影响因素：1转盘转速转盘转速：破碎比速度与转盘速度成正比。：破碎比速度与转盘速度成正比。1细胞浓度细胞浓度：最佳浓度应由实验确定。浓度大，：最佳浓度应由实验确定。浓度大，产生的热量大，但单位细胞重量所消耗的功率小。产生的热量大，但单位细胞重量所消耗的功率小。1珠粒大小珠粒大小：在一定范围内，磨珠越小，破碎：在一定范围内，磨珠越小，破碎速度越快，但也不能过小。速度越快，但也不能过小。第33页，此课件共
16、61页哦1温度温度：将温度控制在：将温度控制在540对破碎物影对破碎物影响较小。响较小。1流量流量：流量大，加工单位质量细胞消耗的：流量大，加工单位质量细胞消耗的能量减小，但细胞的破碎程度和蛋白质的释放能量减小，但细胞的破碎程度和蛋白质的释放量会降低。量会降低。第34页，此课件共61页哦v珠磨机是采用珠磨机是采用夹套冷却夹套冷却的方式实现温的方式实现温度控制的，一般情况下能将温度控制度控制的，一般情况下能将温度控制在要求的范围内；在要求的范围内；v珠磨机的能耗与细胞破碎率成正比；珠磨机的能耗与细胞破碎率成正比；v高的破碎率会提高分离的成本。高的破碎率会提高分离的成本。第35页，此课件共61页哦
17、作用机理作用机理 从高压室压出的细胞悬浮液，经过阀从高压室压出的细胞悬浮液，经过阀座的中心孔道从座的中心孔道从阀座阀座和和阀杆阀杆之间的小环隙之间的小环隙中喷出，速度可达几百米每秒。这种高速中喷出，速度可达几百米每秒。这种高速喷出的悬液又射击到静止的喷出的悬液又射击到静止的碰撞环碰撞环上，被上，被迫改变方向从出口管流出。迫改变方向从出口管流出。第36页，此课件共61页哦v活性物质在破碎过程中的失活问题。活性物质在破碎过程中的失活问题。v 蛋白质和酶的失活主要由蛋白质和酶的失活主要由匀浆过程中产生的匀浆过程中产生的热热引起。如果能将温度控制在引起。如果能将温度控制在35C以下，酶失以下，酶失活的
18、损失可以忽略。提高压力有利于细胞破碎，活的损失可以忽略。提高压力有利于细胞破碎，但需增加能耗。但需增加能耗。v 机械破碎的能耗主要包括机械破碎的能耗主要包括提供动力提供动力消耗的能消耗的能量及量及低温操作低温操作消耗的能量。消耗的能量。第37页，此课件共61页哦v作用机理作用机理 声频高于声频高于1520KHz的超声波在高强度声的超声波在高强度声能输入可以引起能输入可以引起空化现象空化现象，使气泡形成、，使气泡形成、胀大和破碎的现象。胀大和破碎的现象。第38页，此课件共61页哦此法多适用于微生物材料、细胞培养材此法多适用于微生物材料、细胞培养材料的破碎；料的破碎；因超声波处理时产热较多，故应用
19、此法因超声波处理时产热较多，故应用此法时，需要采取降温措施；时，需要采取降温措施；另外，某些核酸及酶对超声波敏感，慎另外，某些核酸及酶对超声波敏感，慎用此法。用此法。第39页，此课件共61页哦超声波破碎过程效率的影响因素：超声波破碎过程效率的影响因素：1声频声频1声能声能1处理时间处理时间1细胞浓度细胞浓度1菌种类型菌种类型第40页，此课件共61页哦v 用用化学药品化学药品改变细胞壁或膜的通透性，从而改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含使内含 物有选择地渗透出来，这种处理方式称为物有选择地渗透出来，这种处理方式称为化学渗透法化学渗透法。作用机理作用机理 化学渗透取决于化学渗透取决于化学试剂化学试
20、剂的类型及的类型及细胞壁细胞壁和和膜膜的结构与组成。不同试剂对各种微生物细胞作用的的结构与组成。不同试剂对各种微生物细胞作用的部位和方式有所差异。部位和方式有所差异。第41页，此课件共61页哦v有机溶剂（苯、甲苯）有机溶剂（苯、甲苯）v表面活性剂表面活性剂有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（烷基磺酸钠（SDS）表面活性剂处理法使细表面活性剂处理法使细胞膜破坏。胞膜破坏。v 金属螯合剂（金属螯合剂（EDTA）v变性剂（盐酸胍、脲）变性剂（盐酸胍、脲）第42页，此课件共61页哦v 用用生物酶生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。
21、解的方法。v 溶菌酶、溶菌酶、-1，3-葡聚糖酶、葡聚糖酶、-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽链内切酶等。苷酶、肽链内切酶等。第43页，此课件共61页哦v作用机理作用机理 溶酶具有高度溶酶具有高度专一性专一性，蛋白酶只，蛋白酶只能水解蛋白质，葡聚糖酶只能水解葡能水解蛋白质，葡聚糖酶只能水解葡聚糖，因此，利用溶酶系统处理细胞聚糖，因此，利用溶酶系统处理细胞必须根据细胞的结构和化学组成选择必须根据细胞的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的使用次序。适当的酶，并确定相应的使用次序。第44页，此课件共61页哦v酶溶法的优点：酶溶法的优点：产品释放的选择性
22、高产品释放的选择性高抽提的速率和收率高抽提的速率和收率高产品的破坏最少产品的破坏最少对对pH和温度等外界条件要求低和温度等外界条件要求低不残留细胞碎片不残留细胞碎片第45页，此课件共61页哦渗透压冲击法渗透压冲击法反复冻融法反复冻融法1多用于动物细胞。多用于动物细胞。1将细胞在将细胞在-20以下冰冻，室温融解，反复几次，以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。引起溶胀，使细胞结构破碎。低温玻璃化法低温玻璃化法 指从超微结构上损伤细胞，使细胞壁、细胞膜等指从超微结构上损伤细胞，使细胞壁、细胞膜等成
23、分遭受破坏。成分遭受破坏。第46页，此课件共61页哦分类分类具体方法具体方法优缺点及适用范围优缺点及适用范围机械破碎法机械破碎法珠磨法珠磨法破碎率高，适用范围广，但后处理复杂破碎率高，适用范围广，但后处理复杂高压均浆法高压均浆法 破碎率高，可大规模操作，适用范围小破碎率高，可大规模操作，适用范围小超声波破碎超声波破碎 适用于实验室小规模操作适用于实验室小规模操作物理破碎法物理破碎法冻融法冻融法操作简便，但不适用于对冷冻敏感的细胞操作简便，但不适用于对冷冻敏感的细胞低温玻璃化低温玻璃化 成本高，适用于实验室小规模生产成本高，适用于实验室小规模生产化学渗透法化学渗透法加入特定化加入特定化学试剂学试
24、剂选择性高，细胞碎片大，后处理容易；但选择性高，细胞碎片大，后处理容易；但作用时间长，适用范围小作用时间长，适用范围小酶溶法酶溶法加入酶加入酶选择性高，细胞碎片大，后处理容易；但选择性高，细胞碎片大，后处理容易；但成本高，适用范围小成本高，适用范围小第47页，此课件共61页哦v多种破碎方法相结合多种破碎方法相结合v与下游过程相结合与下游过程相结合破碎过程要易于细胞碎片的除净。破碎过程要易于细胞碎片的除净。v与上游过程相结合与上游过程相结合培养基、生长期、操作参数等。培养基、生长期、操作参数等。第48页，此课件共61页哦一、包含体及其形成一、包含体及其形成二、包含体的分离和溶解二、包含体的分离和
25、溶解三、蛋白质复性三、蛋白质复性第49页，此课件共61页哦 1)包含体的概念包含体的概念 在基因在基因工程菌工程菌细胞内表达的细胞内表达的重组蛋重组蛋白白，常常互相交联在一起，形成不溶，常常互相交联在一起，形成不溶性的性的聚积物聚积物，通常称为，通常称为包含体包含体。第50页，此课件共61页哦1包含体在相差显微镜下呈现为许多个高度折光包含体在相差显微镜下呈现为许多个高度折光的的颗粒颗粒，含有这些包含体的大肠杆菌的菌体，含有这些包含体的大肠杆菌的菌体变大变大，并出现，并出现突起突起部分。部分。1在电镜下，包含体是无明显的膜存在，大致在电镜下，包含体是无明显的膜存在，大致为为圆形圆形，直径可达，直
26、径可达1微米。微米。第51页，此课件共61页哦1存在于包含体内的重组蛋白通常存在于包含体内的重组蛋白通常无无生物活性，其生物活性，其形成与否取决于蛋白质的类型。形成与否取决于蛋白质的类型。1含有含有二硫键二硫键的真核生物蛋白质，在原核生物中进的真核生物蛋白质，在原核生物中进行表达，常常因重组蛋白内及分子间二硫键的错行表达，常常因重组蛋白内及分子间二硫键的错配，而产生无活性的蛋白质，成为不溶性的物质。配，而产生无活性的蛋白质，成为不溶性的物质。第52页，此课件共61页哦产生少量蛋白时，可溶，量过多时，产生少量蛋白时，可溶，量过多时，在细胞内超过其在细胞内超过其溶解度溶解度而沉淀；而沉淀；蛋白质合
27、成蛋白质合成速度太快速度太快，肽链来不及形，肽链来不及形成正常的折叠构象，导致分子间因疏水成正常的折叠构象，导致分子间因疏水作用聚合而不溶，生物活性受影响；作用聚合而不溶，生物活性受影响；第53页，此课件共61页哦高表达的蛋白没有形成高表达的蛋白没有形成正常的二硫键正常的二硫键，或，或宿主细胞内氧化还原等条件不同而生成不同宿主细胞内氧化还原等条件不同而生成不同的的-S-S-；蛋白的溶解需要与其他成分蛋白的溶解需要与其他成分结合结合或经其他或经其他成分成分诱导诱导形成适当的形成适当的可溶性构象可溶性构象，当产生的，当产生的蛋白量过多，所需其他成分相对不足，如折蛋白量过多，所需其他成分相对不足，如
28、折叠酶，分子伴侣等。叠酶，分子伴侣等。第54页，此课件共61页哦包含体的形成亦与蛋白质自身稳定包含体的形成亦与蛋白质自身稳定性有关。性有关。第55页，此课件共61页哦v包含体存在于细胞质中，其分离：包含体存在于细胞质中，其分离：破碎细胞（如高压匀浆，或超声波处理，破碎细胞（如高压匀浆，或超声波处理，或溶菌酶等）或溶菌酶等）离心（离心（5000-20 000 r/min，15min）得到包含体沉淀得到包含体沉淀第56页，此课件共61页哦1)溶解常用试剂溶解常用试剂:尿素尿素盐酸胍盐酸胍去污剂去污剂SDS2)二硫键的还原剂二硫键的还原剂:二硫基苏糖醇二硫基苏糖醇(DTT)2-巯基已醇巯基已醇破坏蛋
29、白质的高级结构破坏蛋白质的高级结构破坏肽链之间的疏水作用破坏肽链之间的疏水作用使二硫键处于可逆断裂状态使二硫键处于可逆断裂状态第57页，此课件共61页哦v正确构象的形成需要进行变性和复性正确构象的形成需要进行变性和复性 在在结构上：结构上：使伸展的肽链成为特定的三维使伸展的肽链成为特定的三维结构；结构；在在功能上：功能上：使无活性的分子成为具有特定功使无活性的分子成为具有特定功能的分子。能的分子。第58页，此课件共61页哦 高表达的不溶性蛋白重折叠成为可高表达的不溶性蛋白重折叠成为可溶性蛋白的难易与溶性蛋白的难易与蛋白质种类蛋白质种类有关。有关。小分子蛋白易复性，如干扰素，肿小分子蛋白易复性，
30、如干扰素，肿瘤坏死因子等；而大分子蛋白以及二硫瘤坏死因子等；而大分子蛋白以及二硫键较多的分子，重折叠就较困难。键较多的分子，重折叠就较困难。第59页，此课件共61页哦包含体的分离包含体的分离;用变性剂溶解包含体中的蛋白用变性剂溶解包含体中的蛋白;变性蛋白的复性和重新氧化变性蛋白的复性和重新氧化(包括除去过剩的变性剂和还原剂包括除去过剩的变性剂和还原剂)第60页，此课件共61页哦v1、稀释与透析复性法、稀释与透析复性法 稀释复性是将变性蛋白质溶液直接稀释复性是将变性蛋白质溶液直接加入到复性缓冲液中，蛋白质周围变加入到复性缓冲液中，蛋白质周围变性剂浓度降低，从而使蛋白质折叠成性剂浓度降低，从而使蛋白质折叠成天然构象。天然构象。第61页，此课件共61页哦