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1、第七章外源基因的表达第1页，此课件共46页哦第一节第一节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达1.1.原核生物基因表达的特点原核生物基因表达的特点 与真核细胞相比，原核细胞的基因表达有以下特点：与真核细胞相比，原核细胞的基因表达有以下特点：（1 1）原核生物只有一种）原核生物只有一种RNARNA聚合酶（真核细胞有三种）识别聚合酶（真核细胞有三种）识别 原核细胞的原核细胞的启动子，催化所有启动子，催化所有RNARNA的合成。的合成。（2 2）原核生物的基因表达是以操纵子为单位的。）原核生物的基因表达是以操纵子为单位的。（3 3）由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是连续
2、进）由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。行的。（4 4）原核基因一般不含有内含子，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加）原核基因一般不含有内含子，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。工系统。（5 5）原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对）原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对第2页，此课件共46页哦基因产物的直接控制要慢。基因产物的直接控制要慢。（6 6）在大肠杆菌）在大肠杆菌mRNAmRNA的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子及的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子及16S16S核糖体核糖体RNA 3 RNA 3 末端碱基互补的序列
3、，即末端碱基互补的序列，即S-DS-D序列，而真核基因则缺序列，而真核基因则缺乏此序列。乏此序列。2.2.原核表达系统的注意事项原核表达系统的注意事项 从上述特点可以看出，欲将外源基因在原核细胞中表达，必须考虑从上述特点可以看出，欲将外源基因在原核细胞中表达，必须考虑表达载体、外源基因的性质、原核细胞的启动子和表达载体、外源基因的性质、原核细胞的启动子和S-DS-D序列、阅读框序列、阅读框架及宿主菌调控系统等基本条件，也就是说必须满足以下条件：架及宿主菌调控系统等基本条件，也就是说必须满足以下条件：（1 1）通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统）通过表达载体将外源基因导入宿主
4、菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白。合成外源蛋白。（2 2）外源基因不能带有内含子，因而必须用）外源基因不能带有内含子，因而必须用cDNAcDNA或化学合成或化学合成第3页，此课件共46页哦的基因，而不能用基因组的基因，而不能用基因组DNADNA。（3 3）必须利用原核细胞的强启动子和）必须利用原核细胞的强启动子和S-DS-D序列等调控元件控制外源基序列等调控元件控制外源基的表达。的表达。（4 4）外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架。）外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架。（5 5）利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基）利用宿主菌的调控系统，
5、调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的伤害。因的表达产物对宿主菌的伤害。3.3.原核生物基因表达的调控序列原核生物基因表达的调控序列 只有在了解了原核生物基因表达调控序列的基础上，只有在了解了原核生物基因表达调控序列的基础上，才能够构才能够构建高效的表达载体，使外源目的基因在原核细胞中得到高效率、建高效的表达载体，使外源目的基因在原核细胞中得到高效率、高水平地表达。对于原核细胞来讲，基因表达的调控序高水平地表达。对于原核细胞来讲，基因表达的调控序第4页，此课件共46页哦列主要涉及启动子、列主要涉及启动子、S-DS-D序列、终止子、增强子、衰减子等序列。序列、终止子、增强子、衰减子
6、等序列。（1 1）启动子）启动子 启动子启动子(promoter)(promoter)是是DNADNA链上一段能与链上一段能与RNARNA聚合酶结合并能起始聚合酶结合并能起始mRNAmRNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。，基因就不能转录。原核生物的启动子是由两段彼此分开且高度保守的核苷酸序列原核生物的启动子是由两段彼此分开且高度保守的核苷酸序列组成。组成。-35-35区（区（TTGACATTGACA）：位于转录起始位点上游的：位于转录起始位点上游的-35bp-35bp附近，是附近，是RNAR
7、NA聚合聚合酶初始识别和结合位点。酶初始识别和结合位点。-10-10区（区（PribnowPribnow框，框，TATAATTATAAT）：RNARNA聚合酶结合于此处导致聚合酶结合于此处导致DNADNA双链双链形成单链。形成单链。第5页，此课件共46页哦 原核表达系统中通常使用的可调控的强启动子有原核表达系统中通常使用的可调控的强启动子有laclac（乳糖启动子）、（乳糖启动子）、trptrp（色氨酸启动子）、（色氨酸启动子）、PLPL及及PRPR（噬菌体左向和右向启动子）、噬菌体左向和右向启动子）、tactac（乳糖（乳糖和色氨酸的杂合启动子）等。和色氨酸的杂合启动子）等。（2 2）终止子
8、）终止子 在一个基因或一个操纵子的在一个基因或一个操纵子的33端往往有一个特定的核苷酸序列，它有端往往有一个特定的核苷酸序列，它有终止转录的功能，这一段终止转录的功能，这一段DNADNA序列称为终止子（序列称为终止子（terminator)terminator)。终止子在。终止子在结构上有一些共同的特点，即有一段富含结构上有一些共同的特点，即有一段富含A/TA/T的区域和一段富含的区域和一段富含G/CG/C的区域的区域，G/CG/C区域具有回文对称结构，使转录后的区域具有回文对称结构，使转录后的RNARNA具有茎环结构。具有茎环结构。根据转录终止作用类型，终止子可分为两种：依赖于根据转录终止作
9、用类型，终止子可分为两种：依赖于因子的转因子的转录终止子及不依赖于录终止子及不依赖于因子的转录终止子。因子的转录终止子。第6页，此课件共46页哦（3 3）S-DS-D序列序列 S-DS-D序列是位于起始密码子（序列是位于起始密码子（AUGAUG）上游）上游3 310bp10bp处的由处的由3 39bp9bp组成的组成的序列。这段序列正好与序列。这段序列正好与16S rRNA 316S rRNA 3端序列互补，是端序列互补，是rRNArRNA的识别和结的识别和结合位点。合位点。S-DS-D序列存在与否及序列存在与否及S-DS-D序列与起始密码子之间的距离，是影响序列与起始密码子之间的距离，是影响
10、mRNAmRNA翻翻译成蛋白质的主要因素之一。译成蛋白质的主要因素之一。（4 4）增强子）增强子 增强子（增强子（enhancer)enhancer)是能够增强启动子转录活性的是能够增强启动子转录活性的DNADNA顺式作用序列。顺式作用序列。第7页，此课件共46页哦4.4.几种类型的原核表达载体几种类型的原核表达载体 在原核细胞中表达外源基因时，由于实验设计的不同，总的来在原核细胞中表达外源基因时，由于实验设计的不同，总的来说可以产生融合型和非融合型表达蛋白。不与细菌的任何蛋白或说可以产生融合型和非融合型表达蛋白。不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表达蛋白称为多肽融合在一起的表达蛋白称为非融
11、合蛋白非融合蛋白。融合蛋白融合蛋白指蛋白质的指蛋白质的N N末端由原核末端由原核DNADNA序列或其它序列或其它DNADNA序列编码，序列编码，C C端由真核端由真核DNADNA的完整序列编码的完整序列编码。（1 1）非融合型表达蛋白载体）非融合型表达蛋白载体pKK223-3pKK223-3具有一个强的具有一个强的tactac（trp-lactrp-lac）启动子，这个启动子是由）启动子，这个启动子是由trptrp启动子的启动子的-3535区、区、lac UV5lac UV5启动子的启动子的-10-10区、操纵基因及区、操纵基因及S-DS-D序列组成。序列组成。紧接着紧接着tactac启动子的
12、是一个取自启动子的是一个取自pUC8pUC8的多位点接头，使之很容易把目的的多位点接头，使之很容易把目的基因定位在启动子和基因定位在启动子和S-DS-D序列之后。序列之后。第8页，此课件共46页哦在多位点下游的一段在多位点下游的一段DNADNA序列中，还包含一个很强的序列中，还包含一个很强的rrnBrrnB核糖体核糖体RNARNA的转的转录终止子。录终止子。载体的其余部分由载体的其余部分由pBR322pBR322组成。组成。（2 2）分泌型克隆表达载体）分泌型克隆表达载体pIN IIIpIN III系统系统 这个载体系统是由这个载体系统是由pBR322pBR322为基础构建的。为基础构建的。带
13、有大肠杆菌最强的启动子之一，即带有大肠杆菌最强的启动子之一，即IppIpp（脂蛋白基因）启动子。在启（脂蛋白基因）启动子。在启动子的下游装有动子的下游装有lac UV5lac UV5的启动子及其操纵基因，并把的启动子及其操纵基因，并把laclac阻遏子的阻遏子的基因（基因（lac Ilac I）也克隆到这个质粒上。这样目的基因的表达就成为可调）也克隆到这个质粒上。这样目的基因的表达就成为可调节的了。节的了。在转录控制的下游再装上人工合成的高效翻译起始序列（在转录控制的下游再装上人工合成的高效翻译起始序列（S-DS-D序列及序列及ATGATG）。）。信号肽序列取自于大肠杆菌中分泌蛋白的基因信号肽
14、序列取自于大肠杆菌中分泌蛋白的基因ompaompa（外膜蛋白基（外膜蛋白基因）。因）。第9页，此课件共46页哦在编码序列的下游紧接着一段人工合成的多克隆位点片断，包括三个单一在编码序列的下游紧接着一段人工合成的多克隆位点片断，包括三个单一酶切位点，酶切位点，Eco RIEco RI、Hind IIIHind III、Bam HIBam HI。（3 3）融合蛋白表达载体）融合蛋白表达载体pGEXpGEX系统系统 载体的组成成分基本上与其它表达载体相似，含有启动子载体的组成成分基本上与其它表达载体相似，含有启动子tactac及及laclac操纵基因、操纵基因、S-DS-D序列、序列、lacIlac
15、I阻遏蛋白基因等。阻遏蛋白基因等。这类载体与其它表达载体不同之处在于这类载体与其它表达载体不同之处在于S-DS-D序列下游是谷胱甘肽巯基序列下游是谷胱甘肽巯基转移酶基因，而克隆的外源基因则与谷胱甘肽巯基转移酶基因相连。当进行转移酶基因，而克隆的外源基因则与谷胱甘肽巯基转移酶基因相连。当进行基因表达时，表达产物为谷胱甘肽巯基转移酶和目的基因产物的融合蛋白。基因表达时，表达产物为谷胱甘肽巯基转移酶和目的基因产物的融合蛋白。第10页，此课件共46页哦5.5.外源基因在大肠杆菌中的表达部位外源基因在大肠杆菌中的表达部位（1 1）不同表达部位）不同表达部位 克隆在大肠杆菌中的外源基因，它们的编码产物蛋白
16、质，有的是在克隆在大肠杆菌中的外源基因，它们的编码产物蛋白质，有的是在细胞质中表达，有的是在细胞周质中表达，还有的则是以分泌到细胞细胞质中表达，有的是在细胞周质中表达，还有的则是以分泌到细胞外的方式表达。外的方式表达。细胞质中表达细胞质中表达 大肠杆菌细胞质中表达的外源蛋白，大多是以包含体的形式存大肠杆菌细胞质中表达的外源蛋白，大多是以包含体的形式存在的。包含体是存在于细胞质中的一种由不溶性蛋白质聚集折叠在的。包含体是存在于细胞质中的一种由不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构。而成的晶体结构。周质中表达周质中表达 周质是指在大肠杆菌一类格兰氏阴性细菌中，位于内膜和外膜周质是指在大肠杆菌一类格兰氏
17、阴性细菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。周质中表达的蛋白需要在信号肽的引之间的细胞结构部分。周质中表达的蛋白需要在信号肽的引第11页，此课件共46页哦导下才能穿越内膜，进入细胞周质。导下才能穿越内膜，进入细胞周质。细胞外表达细胞外表达 表达的外源蛋白分泌到胞外培养基中，同样需要信号肽序列的引导。表达的外源蛋白分泌到胞外培养基中，同样需要信号肽序列的引导。（2 2）不同部位表达外源蛋白的优缺点）不同部位表达外源蛋白的优缺点第12页，此课件共46页哦表达部位优点缺点细胞质1、形成包涵体（a）蛋白质易于以高纯度和高浓度的方式分离（b）蛋白质受保护而免受胞内酶的降解作用（c）蛋白质没有活性，因此
18、不会使寄主细胞受伤害2、蛋白质产量高3、表达的质粒载体构建比较简单1、形成包涵体（a）蛋白质折叠了，再折叠的蛋白质可能无法恢复其生物学活性（b）蛋白质的终产量偏低（c）蛋白质生产成本比较昂贵2、还原的环境不利于二硫键的形成3、由于N-末端存在甲硫氨酸，使蛋白质的真实性受到影响4、蛋白质会被降解5、蛋白质种类多，因此纯化比较复杂周质1、由于周质中蛋白种类比较少，因此目标蛋白质的纯化就比较简单2、蛋白质降解的程度不甚严重3、促进了二硫键的形成及蛋白质的折叠作用4、蛋白质的N-末端结构真实1、信号肽并非总是有助于蛋白质的转运2、有可能形成包涵体胞外1、蛋白质的降解作用程度最低2、由于分泌到胞外的蛋白
19、质种类少，因此目标蛋白质容易纯化3、增进了蛋白质的折叠作用4、蛋白质的N-末端结构真实1、在大肠杆菌中表达的外源真核蛋白质，通常是不会分泌到胞外培养基中去的2、由于分泌在胞外培养基中的蛋白质相当稀释，因此目标蛋白质的纯化过程比较复杂表表7.1 7.1 不同部位表达外源蛋白的优缺点不同部位表达外源蛋白的优缺点第13页，此课件共46页哦6.6.影响外源基因表达效率的因素及提高表达水平常用的方影响外源基因表达效率的因素及提高表达水平常用的方法法（1 1）启动子结构对表达效率的影响）启动子结构对表达效率的影响 原核生物启动子有两种保守序列，即原核生物启动子有两种保守序列，即-35-35区的区的TTGA
20、CATTGACA序列和序列和-10-10区的区的TATAATTATAAT序列。研究发现，启动子的强度与一致序列的相似程度成正序列。研究发现，启动子的强度与一致序列的相似程度成正比。进一步的研究表明，比。进一步的研究表明，-35-35和和-10-10区的距离也是一个重要因素。如区的距离也是一个重要因素。如果间隔为果间隔为1717个碱基对，启动子表现很强，如果大于个碱基对，启动子表现很强，如果大于1717个碱基对，启个碱基对，启动子表现较弱。动子表现较弱。根据这些原理，根据这些原理，AmannAmann等克隆了等克隆了tactac启动子（启动子（lac-trplac-trp），促进了克隆），促进了
21、克隆基因的表达。基因的表达。（2 2）转译起始序列对表达效率的影响）转译起始序列对表达效率的影响第14页，此课件共46页哦 S-D S-D序列的保守性、序列的保守性、S-DS-D序列后面的序列后面的4 4个碱基成分以及起始密码子个碱基成分以及起始密码子AUGAUG左左侧的密码三联体的碱基组成都会影响到外源基因的表达效率。侧的密码三联体的碱基组成都会影响到外源基因的表达效率。如：如：UAAGGAGGUAAGGAGG比比GGAGGGGAGG高高3 36 6倍（表达水平倍（表达水平)SD SD与与AUGAUG间富含间富含ATAT有利于翻译有利于翻译 AUGAUG左侧的密码三联体为左侧的密码三联体为U
22、AUUAU或或CUUCUU时，转译最为有效；如果是时，转译最为有效；如果是UUCUUC、UCAUCA或或AGGAGG时，转译水平将下降时，转译水平将下降2020倍。倍。（3 3）启动子同克隆基因间的距离对表达效率的影响）启动子同克隆基因间的距离对表达效率的影响 启动子同克隆基因间的距离对表达效率的影响，主要是由于启动子同克隆基因间的距离对表达效率的影响，主要是由于mRNAmRNA的的55末端形成不同的二级结构，从而影响末端形成不同的二级结构，从而影响mRNAmRNA的翻译效率。的翻译效率。根据上述原理，要提高克隆基因的表达效率，可采用构建克根据上述原理，要提高克隆基因的表达效率，可采用构建克第
23、15页，此课件共46页哦隆库的办法。在库中，将外源基因分别放置在离启动子远近不同隆库的办法。在库中，将外源基因分别放置在离启动子远近不同的地方。转化后，筛选重组克隆，从中筛选出外源基因表达最强的地方。转化后，筛选重组克隆，从中筛选出外源基因表达最强的克隆。的克隆。（4 4）转录终止区对克隆基因表达效率的影响）转录终止区对克隆基因表达效率的影响 克隆基因的末端是否存在转录终止区也会影响到克隆基因的表克隆基因的末端是否存在转录终止区也会影响到克隆基因的表达效率。其原因可能为：达效率。其原因可能为：若干非必须的转录本的合成，会使细胞消耗巨大的能量用于制造大量非必若干非必须的转录本的合成，会使细胞消耗
24、巨大的能量用于制造大量非必须的蛋白质。须的蛋白质。在转录本上有可能出现一些不期望出现的二级结构，从而降低了转译在转录本上有可能出现一些不期望出现的二级结构，从而降低了转译的效率。的效率。偶尔会出现启动子阻塞现象。偶尔会出现启动子阻塞现象。因此，在构建表达载体时，在克隆基因后面安装一个强转录因此，在构建表达载体时，在克隆基因后面安装一个强转录第16页，此课件共46页哦终止子（如终止子（如rrnB rrnB 终止子）对完全终止转录是必要的，可以阻止通读，终止子）对完全终止转录是必要的，可以阻止通读，增加基因表达。增加基因表达。（5 5）质粒的拷贝数及稳定性对表达效率的影响）质粒的拷贝数及稳定性对表
25、达效率的影响 由于细胞中的核糖体数量，与任何一种由于细胞中的核糖体数量，与任何一种mRNAmRNA分子数目相比，都是分子数目相比，都是大大超量的，因此，提高克隆基因表达效率的途径之一，是增加相应大大超量的，因此，提高克隆基因表达效率的途径之一，是增加相应的的mRNAmRNA分子数量。为此，须增加质粒的拷贝数及其稳定性。分子数量。为此，须增加质粒的拷贝数及其稳定性。一般采用松弛型质粒构建外源基因的表达载体，从而达到增加一般采用松弛型质粒构建外源基因的表达载体，从而达到增加质粒及外源基因拷贝数的目的。质粒及外源基因拷贝数的目的。质粒载体中含有分配功能区质粒载体中含有分配功能区parpar，能保证质
26、粒分子在每次细胞周期中都，能保证质粒分子在每次细胞周期中都能准确地进行分离，并均等地分配到子代细胞中去，从而达到稳定质粒拷贝能准确地进行分离，并均等地分配到子代细胞中去，从而达到稳定质粒拷贝数的作用。数的作用。第17页，此课件共46页哦（6 6）mRNAmRNA的稳定性对表达效率的影响的稳定性对表达效率的影响 原核生物的原核生物的mRNAmRNA分子的降解速度很快，一般在几秒分子的降解速度很快，一般在几秒几分之间。因此几分之间。因此，维持外源基因，维持外源基因mRNAmRNA的稳定性可提高其表达效率。的稳定性可提高其表达效率。一般的作法是给外源基因一般的作法是给外源基因mRNAmRNA的的55
27、及及33端安装端安装某些结构序列，保某些结构序列，保护护mRNAmRNA不能被降解。如：不能被降解。如：33端茎环结构、转录终止子结构；端茎环结构、转录终止子结构；E.coli E.coli ompAompA转录物的转录物的55非翻译部分可作为非翻译部分可作为mRNAmRNA的稳定剂。的稳定剂。（7 7）遗传密码子的使用对表达效率的影响）遗传密码子的使用对表达效率的影响 无论是真核基因还是原核基因，一种特定的氨基酸并不是以等同的无论是真核基因还是原核基因，一种特定的氨基酸并不是以等同的频率使用所有的同义密码子，而是使用其中的某一两种。我们将这种频率使用所有的同义密码子，而是使用其中的某一两种。
28、我们将这种遗传密码子使用的非随机性现象，称为密码子使用偏爱性，简称密码遗传密码子使用的非随机性现象，称为密码子使用偏爱性，简称密码子偏爱性。子偏爱性。第18页，此课件共46页哦 选择和使用大肠杆菌偏爱密码子有利于增加外源基因在大肠杆菌中的选择和使用大肠杆菌偏爱密码子有利于增加外源基因在大肠杆菌中的翻译效率，从而提高外源基因的表达效率。翻译效率，从而提高外源基因的表达效率。（8 8）寄主细胞的生理状态对基因表达效率的影响）寄主细胞的生理状态对基因表达效率的影响 大肠肝菌寄主细胞的生理状态，会或多或少地影响外源基因的表达效率，大肠肝菌寄主细胞的生理状态，会或多或少地影响外源基因的表达效率，诸如：培
29、养基营养成分的选择、细胞培养的方式，以及培养的温度和培养基诸如：培养基营养成分的选择、细胞培养的方式，以及培养的温度和培养基中所溶解的氧的数量等环境参数。中所溶解的氧的数量等环境参数。不过，有关处于不同生理状态下的大肠杆菌寄主细胞，究竟是怎样影响外不过，有关处于不同生理状态下的大肠杆菌寄主细胞，究竟是怎样影响外源基因的细胞效率的，人们在这方面的知识还是相当贫乏的。源基因的细胞效率的，人们在这方面的知识还是相当贫乏的。第19页，此课件共46页哦图图7.1 7.1 原核细胞的启动子序列原核细胞的启动子序列 第20页，此课件共46页哦图图7.2 7.2 原核基因转录的起始原核基因转录的起始 第21页
30、，此课件共46页哦图图7.3 7.3 原核基因终止子序列及其结构原核基因终止子序列及其结构 第22页，此课件共46页哦图图7.4 7.4 非融合型表达蛋白载体非融合型表达蛋白载体pKK223-3pKK223-3第23页，此课件共46页哦图图7.5 7.5 分泌型克隆表达载体分泌型克隆表达载体pIN IIIpIN III系统系统第24页，此课件共46页哦图图7.6 7.6 融合蛋白表达载体融合蛋白表达载体pGEXpGEX系统系统第25页，此课件共46页哦图图7.7 47.7 4个天然启动子和两个人造启动子的个天然启动子和两个人造启动子的-35-35区和区和-10-10区的碱基序列区的碱基序列第2
31、6页，此课件共46页哦图图7.8 7.8 三个重组质粒的三个重组质粒的cro mRNAcro mRNA二级结构二级结构第27页，此课件共46页哦图图7.9 7.9 改变改变Lac Lac 启动子和克隆基因间启动子和克隆基因间距离的一般方法距离的一般方法第28页，此课件共46页哦第二节第二节 外源基因在真核细胞中的表达外源基因在真核细胞中的表达1.1.酵母表达系统酵母表达系统 酵母（酵母（yeastyeast）是一类以芽殖或裂殖进行无性繁殖的单细胞真核生物）是一类以芽殖或裂殖进行无性繁殖的单细胞真核生物，是最理想的真核生物基因表达系统。，是最理想的真核生物基因表达系统。（1 1）酵母表达系统的优
32、点）酵母表达系统的优点基因表达调控的机制比较清楚，遗传操作相对简便。基因表达调控的机制比较清楚，遗传操作相对简便。具有原核生物所不具备的蛋白质翻译后的加工和修饰系统。具有原核生物所不具备的蛋白质翻译后的加工和修饰系统。可将外源基因表达产物分泌到培养基中。可将外源基因表达产物分泌到培养基中。对人体和环境安全，不含毒素和特异性病毒。对人体和环境安全，不含毒素和特异性病毒。可进行大规模的发酵，工艺简单而成熟，成本低廉。可进行大规模的发酵，工艺简单而成熟，成本低廉。第29页，此课件共46页哦（2 2）酵母基因表达载体）酵母基因表达载体 酵母克隆和表达载体是由酵母野生型质粒、原核生物质粒载体上的酵母克隆
33、和表达载体是由酵母野生型质粒、原核生物质粒载体上的功能基因（如抗性基因、复制子等）和宿主染色体功能基因（如抗性基因、复制子等）和宿主染色体DNADNA上的自主复制子上的自主复制子结构（结构（ARSARS）、中心粒序列（）、中心粒序列（CENCEN）、端粒序列（）、端粒序列（LELLEL）等一起构建而成）等一起构建而成。酵母基因表达系统的载体一般是一种穿梭质粒，它既能够在原核细胞酵母基因表达系统的载体一般是一种穿梭质粒，它既能够在原核细胞（大肠杆菌）中复制，又能在真核细胞（酵母）中复制。（大肠杆菌）中复制，又能在真核细胞（酵母）中复制。DNADNA复制起始区复制起始区a a：大肠杆菌源质粒的复制
34、起始序列：使其能在大肠杆菌中复制。：大肠杆菌源质粒的复制起始序列：使其能在大肠杆菌中复制。b b：酵母菌的天然：酵母菌的天然2 2质粒的复制起始序列或酵母基因组中的自主复制序列质粒的复制起始序列或酵母基因组中的自主复制序列，使其能在酵母菌中复制。，使其能在酵母菌中复制。第30页，此课件共46页哦选择标记基因选择标记基因a a：营养缺陷型选择标记，宿主菌为相应的营养缺陷型。：营养缺陷型选择标记，宿主菌为相应的营养缺陷型。b b：显性选择标记（：显性选择标记（G418G418等），可采用各种类型酵母细胞作为宿主细等），可采用各种类型酵母细胞作为宿主细胞。胞。有丝分裂稳定区有丝分裂稳定区 来源于酵母
35、染色体着丝粒（来源于酵母染色体着丝粒（centromerecentromere）片断，能保证表达载体在酵母细）片断，能保证表达载体在酵母细胞分裂时，能平均地分配到子代细胞中去。胞分裂时，能平均地分配到子代细胞中去。表达盒表达盒 表达盒是酵母表达载体的重要元件，包括启动子、分泌信号肽序列、多克表达盒是酵母表达载体的重要元件，包括启动子、分泌信号肽序列、多克隆位点及终止子序列。隆位点及终止子序列。启动子：启动子：保证转录的起始。保证转录的起始。分泌信号肽序列：分泌信号肽序列：引导目的基因蛋白分泌到细胞外。引导目的基因蛋白分泌到细胞外。第31页，此课件共46页哦多克隆位点：多克隆位点：供外源基因插入
36、。供外源基因插入。终止子：终止子：保证转录在适当位置停止。保证转录在适当位置停止。（3 3）酵母基因表达载体的种类）酵母基因表达载体的种类自主复制型质粒载体自主复制型质粒载体 该质粒含有酵母基因组的该质粒含有酵母基因组的DNADNA复制起始区、选择标记、基因克隆位点等关复制起始区、选择标记、基因克隆位点等关键元件。键元件。酵母基因组酵母基因组DNADNA复制起始区：复制起始区：能够在酵母细胞中自主复制。能够在酵母细胞中自主复制。基因克隆位点：基因克隆位点：来源于大肠杆菌源质粒，如来源于大肠杆菌源质粒，如pBR322pBR322。这类载体的这类载体的优点优点在于：在酵母细胞中的转化率高，每个细胞
37、拷贝数在于：在酵母细胞中的转化率高，每个细胞拷贝数可达可达200200个个缺点缺点在于：由于缺乏在于：由于缺乏酵母染色体着丝粒片断，在细胞分裂过程中不能均匀酵母染色体着丝粒片断，在细胞分裂过程中不能均匀的分配到子细胞中去，因而经过多代培养后，子细的分配到子细胞中去，因而经过多代培养后，子细第32页，此课件共46页哦胞中质粒载体的拷贝数迅速减少。胞中质粒载体的拷贝数迅速减少。整合型质粒载体整合型质粒载体 该质粒载体不含有酵母该质粒载体不含有酵母DNADNA复制起始区，不能在酵母中进行自主复制，复制起始区，不能在酵母中进行自主复制，但该质粒含有整合介导区，可以通过但该质粒含有整合介导区，可以通过D
38、NADNA的同源重组将外源基因整合到酵母的同源重组将外源基因整合到酵母染色体上，随染色体一起进行复制。染色体上，随染色体一起进行复制。着丝粒型质粒载体着丝粒型质粒载体 该质粒载体是在自主复制型质粒载体的基础上构建而成的，增加了酵该质粒载体是在自主复制型质粒载体的基础上构建而成的，增加了酵母染色体有丝分裂稳定序列元件（着丝粒），因而能保证质粒载体在细母染色体有丝分裂稳定序列元件（着丝粒），因而能保证质粒载体在细胞分裂时平均地分配到子细胞中去，同时提高了质粒在宿主细胞中的稳胞分裂时平均地分配到子细胞中去，同时提高了质粒在宿主细胞中的稳定性。定性。酵母人工染色体酵母人工染色体第33页，此课件共46页
39、哦（4 4）酵母基因表达系统宿主菌）酵母基因表达系统宿主菌 目前，作为外源基因表达的宿主酵母菌主要包括：目前，作为外源基因表达的宿主酵母菌主要包括：酿酒酵母、巴酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、乳酸克努维酵母和多形汉森酵母斯德毕赤酵母、乳酸克努维酵母和多形汉森酵母。（5 5）在酵母中高效表达外源基因的策略）在酵母中高效表达外源基因的策略提高表达载体在细胞中的拷贝数提高表达载体在细胞中的拷贝数 以多拷贝酵母内源性质粒为基础构建的多拷贝表达载体，是提高表以多拷贝酵母内源性质粒为基础构建的多拷贝表达载体，是提高表达载体在酵母中拷贝数的一个途径。但以上的多拷贝载体在没有选择达载体在酵母中拷贝数的一个途径。但以
40、上的多拷贝载体在没有选择压力的情况下，可能难以保持其高拷贝数。压力的情况下，可能难以保持其高拷贝数。将外源基因整合到染色体上可维持外源基因在细胞中的稳定性，然而在多将外源基因整合到染色体上可维持外源基因在细胞中的稳定性，然而在多数情况下会因为在细胞中的拷贝数较低而影响其表达。数情况下会因为在细胞中的拷贝数较低而影响其表达。第34页，此课件共46页哦提高外源基因的转录水平提高外源基因的转录水平 在构建表达载体时组入强启动子，如：酵母磷酸甘油酯激酶基因启在构建表达载体时组入强启动子，如：酵母磷酸甘油酯激酶基因启动子、甘油醛磷酸脱氢酶基因启动子，可提高外源基因的转录水平。动子、甘油醛磷酸脱氢酶基因启
41、动子，可提高外源基因的转录水平。但外源基因表达的产物量过高也会对细胞形成伤害。但外源基因表达的产物量过高也会对细胞形成伤害。选择合适的受体细胞系统选择合适的受体细胞系统 根据表达载体特性，选择合适的酵母受体系统。根据表达载体特性，选择合适的酵母受体系统。第35页，此课件共46页哦2.2.植物细胞基因表达系统植物细胞基因表达系统（1 1）植物基因表达载体的组成特性）植物基因表达载体的组成特性 大多数植物基因表达载体是以大多数植物基因表达载体是以TiTi质粒为基础构建而成的，其组成包括质粒为基础构建而成的，其组成包括启动子、启动子、T-DNAT-DNA、终止子、内含子及选择标记基因和报告基因。、终
42、止子、内含子及选择标记基因和报告基因。植物基因表达载体的启动子植物基因表达载体的启动子 根据启动子的功能和作用方式，可分为根据启动子的功能和作用方式，可分为组成型启动子组成型启动子、诱导型启动子诱导型启动子和和组织特异性启动子组织特异性启动子等几类。等几类。组成型启动子：组成型启动子：外源基因的表达大体恒定在一定水平，在不同组织外源基因的表达大体恒定在一定水平，在不同组织部位没有明显差异，没有时空特异性。一般采用花椰菜花叶病病部位没有明显差异，没有时空特异性。一般采用花椰菜花叶病病毒（毒（CaMVCaMV）35S RNA35S RNA的启动子、的启动子、TiTi质粒的胭脂碱合成酶基因质粒的胭脂
43、碱合成酶基因(nos)(nos)或或章鱼碱合成酶基因章鱼碱合成酶基因(ocs)(ocs)的启动子。的启动子。第36页，此课件共46页哦诱导型启动子：诱导型启动子：在某些特定的物理或化学信号刺激下，可大幅度提高外在某些特定的物理或化学信号刺激下，可大幅度提高外源基因的转录水平。源基因的转录水平。组织特异型启动子：组织特异型启动子：外源基因只能在特定的组织细胞中表达。如：采外源基因只能在特定的组织细胞中表达。如：采用马铃薯块茎蛋白基因的启动子、花粉特异表达基因启动子等。用马铃薯块茎蛋白基因的启动子、花粉特异表达基因启动子等。植物基因表达载体的终止子植物基因表达载体的终止子 不同来源的终止子对外源基
44、因的表达有很大影响，它不仅决定外源基因的不同来源的终止子对外源基因的表达有很大影响，它不仅决定外源基因的转录活性，也决定转录活性，也决定mRNAmRNA在细胞中的稳定性，从而影响在细胞中的稳定性，从而影响mRNAmRNA的翻译。研究的翻译。研究表明，采用相同的启动子及外源基因，而采用不同的终止子序列表明，采用相同的启动子及外源基因，而采用不同的终止子序列 ，外源基，外源基因的表达水平有很大差异（差异可达因的表达水平有很大差异（差异可达6060倍）。倍）。T-DNAT-DNA（transfer DNAtransfer DNA）第37页，此课件共46页哦 可将外源基因连入可将外源基因连入T-DNA
45、T-DNA区域，随区域，随T-DNAT-DNA随机整合进入植物细胞的染色随机整合进入植物细胞的染色体基因组中，从而使外源基因得到稳定维持和表达。但必须注意保留体基因组中，从而使外源基因得到稳定维持和表达。但必须注意保留T-DNAT-DNA序列的左右边界序列，因为左右边界序列是外源序列的左右边界序列，因为左右边界序列是外源DNADNA转移和整合不转移和整合不可缺少的元件。可缺少的元件。内含子序列内含子序列 研究表明，内含子与基因表达水平有很大关系。因而在构建植研究表明，内含子与基因表达水平有很大关系。因而在构建植物基因表达载体时，可根据不同基因的类型，有选择性的插入内物基因表达载体时，可根据不同
46、基因的类型，有选择性的插入内含子序列。含子序列。选择标记基因和报告基因选择标记基因和报告基因 选择标记基因和报告基因的作用在于筛选转化体，检测外源基因的转选择标记基因和报告基因的作用在于筛选转化体，检测外源基因的转译水平。常用的选择标基因有新霉素磷酸转移酶基因、二氢叶酸还原酶译水平。常用的选择标基因有新霉素磷酸转移酶基因、二氢叶酸还原酶基因、潮霉素磷酸转移酶基因等；报告基因有冠瘿碱基因、氯霉素乙酰基因、潮霉素磷酸转移酶基因等；报告基因有冠瘿碱基因、氯霉素乙酰转移酶基因等。转移酶基因等。第38页，此课件共46页哦（2 2）植物基因表达的受体系统）植物基因表达的受体系统 植物基因表达的受体系统是指
47、用于转化的植物细胞，主要包括以下植物基因表达的受体系统是指用于转化的植物细胞，主要包括以下五类：五类：愈伤组织再生系统愈伤组织再生系统 它是外植体经脱分化培养、诱导愈伤组织并通过分化培养获得再生植它是外植体经脱分化培养、诱导愈伤组织并通过分化培养获得再生植株的受体系统。株的受体系统。特点：易于接受外源基因，转化效率高；扩繁量大，可获得大特点：易于接受外源基因，转化效率高；扩繁量大，可获得大量的转化植株；但获得的再生植株无性系变异较大；外源基因的量的转化植株；但获得的再生植株无性系变异较大；外源基因的稳定性差。稳定性差。直接分化再生系统直接分化再生系统 它是指外植体细胞不经脱分化阶段而直接分化出
48、不定芽而获得它是指外植体细胞不经脱分化阶段而直接分化出不定芽而获得再生株。再生株。第39页，此课件共46页哦 特点：获得再生植株的周期短，细胞无性系变异小，能较好地保持特点：获得再生植株的周期短，细胞无性系变异小，能较好地保持受体细胞的遗传稳定性；但转化率相对较低，存在较多的嵌合株。受体细胞的遗传稳定性；但转化率相对较低，存在较多的嵌合株。原生质体再生系统原生质体再生系统 特点：转化率高，可形成基因型一致的细胞克隆；但原生质体培养周特点：转化率高，可形成基因型一致的细胞克隆；但原生质体培养周期较长、难度大、再生频率较低，在原生质体的培养过程中易造成变异期较长、难度大、再生频率较低，在原生质体的
49、培养过程中易造成变异。胚状体再生系统胚状体再生系统 它是指体细胞或单倍体细胞在组织培养条件下诱导成为形态结构和它是指体细胞或单倍体细胞在组织培养条件下诱导成为形态结构和功能上类似于有性胚的胚状体，是一种最理想的转化受体系统。功能上类似于有性胚的胚状体，是一种最理想的转化受体系统。特点：转化率高；获得嵌合体少；可生产人工种子。特点：转化率高；获得嵌合体少；可生产人工种子。第40页，此课件共46页哦生殖细胞受体系统生殖细胞受体系统 以生殖细胞如花粉、卵细胞等作为基因转化的受体细胞，通过组织培养技以生殖细胞如花粉、卵细胞等作为基因转化的受体细胞，通过组织培养技术将生殖细胞诱导成为胚性细胞或愈伤组织，
50、或直接利用花粉和卵子受精过术将生殖细胞诱导成为胚性细胞或愈伤组织，或直接利用花粉和卵子受精过程进行基因转化。程进行基因转化。特点：转化率高；易于获得稳定的遗传，并且通过加倍后成为纯合特点：转化率高；易于获得稳定的遗传，并且通过加倍后成为纯合的二倍体。的二倍体。（3 3）提高外源基因在植物细胞中的表达效率的策略）提高外源基因在植物细胞中的表达效率的策略构建高效表达的转化载体构建高效表达的转化载体防止外源基因失活防止外源基因失活优化先导序列，提高翻译效率优化先导序列，提高翻译效率第41页，此课件共46页哦3.3.哺乳动物细胞基因表达系统哺乳动物细胞基因表达系统（1 1）哺乳动物基因表达载体的组成特