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1、 福建森宝食品集团股份有限公司企业标准 Q/JCWI 02172013 动物性食品中替米考星药物残留检测动物性食品中替米考星药物残留检测 酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法 2013-08-01 发布 2013-08-01 实施 福建森宝食品集团股份有限公司 发 布 Q/JCWI 02172013 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出的规则起草 本标准由公司检测中心提出并审核 本标准起草单位：检测中心 本标准起草人：张丽丽 本标准批准人：黄金兰 本标准于2013年8月1日首次发布。Q/JCWI 02172013 II 修改履历表修改履历表 版本版本 章
2、节章节 条款条款 修改内容或记录号修改内容或记录号 修改人修改人 （起草人）（起草人）批准人批准人 修改日期修改日期 （发布日期）（发布日期）实施日期实施日期 A/0 全新发布 张丽丽 黄金兰 2013.8.1 2013.8.1 Q/JCWI 02172013 1 动物性食品中动物性食品中替米考星替米考星药物残留检测药物残留检测 酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法 1 范围 本标准规定了动物可食性组织中替米考星药物残留量，酶联免疫检测方法的制样和检测方法.本标准适用于猪肌肉、鸡肌肉替米考星药物残留量的测定。2 试验原理 本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的替米考
3、星与微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗替米考星抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含替米考星的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中替米考星的残留量。3 交叉反应率 替米考星 100%泰乐菌素小于0.1%4 设备及试剂 以下所用材料，除特别注明者外，均为分析纯；水为符合以下所用材料，除特别注明者外，均为分析纯；水为符合GB/T 6682GB/T 6682规定的二级水。规定的二级水。4.1 设备 微孔板酶标仪450/630nm 旋转蒸发仪/氮气吹干装置 均质器 振荡器 涡旋仪 离心机 天平：感量0.01g 刻度移液管：10ml 洗耳球 容量瓶：100
4、ml、500ml 玻璃试管：15ml 聚苯乙烯离心管：50ml Q/JCWI 02172013 2 微量移液器：单道 20200l、1001000l 多道 250l 4.2 试剂 无水碳酸钠（分析纯）碳酸氢钠（分析纯）甲醇（分析纯）乙酸乙酯（分析纯）去离子水 5 试剂盒提供的材料与试剂 96孔酶标板 1块（包被有偶联抗原）标准品 6瓶：（1ml/瓶）0ppb，0.5ppb，1.5ppb，4.5ppb，13.5ppb，40.5ppb 高浓度标准品：（1ml/瓶）1ppm 酶标二抗 7ml 抗体工作液 7ml 底物液 A液 7ml 底物液 B液 7ml 终止液 7ml 20 浓缩洗涤液 40ml
5、14 浓缩复溶液 50ml 6 溶液的配制 配液1:0.1M(PH=10.6)CB缓冲液 称取0.932g无水碳酸钠、0.1g碳酸氢钠加100ml去离子水溶解混匀。配液2:复溶工作液 用去离子水将4 浓缩复溶液按1：3体积比进行稀释（1份4 浓缩复溶液+3份去离子水）用于样本的复溶，复溶工作液在4环境可保存一个月。配液3:洗涤工作液 用去离子水将20 浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释（1份20 浓缩洗涤液+19份去离子水）用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4环境可保存一个月。7 样本前处理步骤 7.1 处理任何样本时，都必须注意：a)实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。b）实
6、验之前须检查各种实验器具是否洁净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。7.2 样本前处理方法 Q/JCWI 02172013 3 称取2.00.05g样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入2ml 0.1M（PH=10.6）CB(见配液1)，再加入8ml乙酸乙酯，用涡动仪涡动3-5min，3000g以上，室温（20-25 oC/68-77）离心5min；取 4ml 上层有机相至 10ml 洁净干燥玻璃试管中，于 50-60（122-140）水浴氮气流下吹干；加入 1ml 正已烷，用涡旋仪涡动 30s，再加入 1ml 复溶工作液(见配液 2)，用涡旋仪涡动 30s，3000g以上，室温（2
7、0-25 oC/68-77）离心 5min；除去上层，取下层 50 l 用于分析。8 检测步骤 8.1 测定前应须知：测定前应须知：1、使用之前将所有试剂和需用板条的温度回升至室温（20-25/68-77）。2、使用之后立即将所有试剂放回2-8（36-46）。3、在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。4、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。8.2 操作步骤：8.2.1 将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20-25/68-77）平衡 30min 以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。8.2.2 取出需要数量的
8、微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于 2-8（36-46）。8.2.3 浓缩复溶液和浓缩洗涤液在使用前也需回温。8.2.4 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做 2 孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。8.2.5 加标准品/样本、酶标二抗和抗体工作液：加标准品/样本 50l 到对应的微孔中，再加入酶标二抗 50l/孔，最后加入抗体工作液 50l/孔轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置 25（77.0）避光环境中反应 30min。8.2.6 洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液（见配液 3）250l/孔，充分洗涤45 次，每次间隔 10s，用吸水纸拍干（拍干
9、后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。8.2.7 显色：加入底物液 A 液 50l/孔，再加底物液 B 液 50l/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置 25（77.0）避光环境中反应 15min。8.2.8 测定：加入终止液 50l/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于 450nm 处（建议用双波长 450/630nm检测，请在 5min 内读完数据），测定每孔 OD 值。(若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定)。9 结果判定 结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光度值与其所含替米考星量的含量成负相关。Q/JCWI 02172013 4 9.1 用样
10、本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ppb)。假设样本1的吸光度值为0.113，样本 2 的吸光度值为 0.554，标准品吸光度值分别是：0 ppb 为 1.787；0.5 ppb 为 1.215；1.5ppb 为0.682；4.5 ppb 为 0.332；13.5ppb 为 0.132；40.5 ppb 为 0.056。则样本 1 的浓度范围是 13.5ppb-40.5 ppb 再再乘以其对应的稀释倍数乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中替米考星残留的浓度范围即可得出样本中替米考星残留的浓度范围；样本 2 的浓度范围是1.5ppb-4.5ppb 再再乘以其对应的稀释倍数乘以其对应的
11、稀释倍数即可得出样本中替米考星残留的浓度范围。即可得出样本中替米考星残留的浓度范围。9.2 定量测定 9.2.1 百分吸光率的计算,标准品或样本的百分吸光率等于 标准品或样本的平均吸光度值（双孔）除以第一个标准（0 标准）的平均吸光度值,再乘以 100%，即 百分吸光率（%）=B 100%B0 B标准品或样本溶液的平均吸光度值 B00ppb标准溶液的平均吸光度值 9.2.2 标准曲线的绘制与计算 以标准品百分吸光率为纵坐标，以替米考星标准品浓度（ppb）的对数为横坐标,绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即乘以其对应的稀释倍数
12、即为样本中为样本中替米考星替米考星实际浓度。实际浓度。样本稀释倍数样本稀释倍数 猪肉、鸡肉、牛肉、羊肉、鱼、虾样本稀释倍数：1倍 检测方法灵敏度、准确度、精密度检测方法灵敏度、准确度、精密度 试剂盒灵敏度：试剂盒灵敏度：0.50.5ppbppb 10 检测方法灵敏度、准确度、精密度 样本最低检测限：样本最低检测限：猪肉、鸡肉、牛肉、羊肉 0.5ppb 准确度：准确度：猪肉、鸡肉、牛肉、羊肉80%15%试剂盒的板内、板间变异系数均小于10%。11 注意事项 11.1 室温低于 20（68）或试剂及样本没有回到室温（20-25/68-77）会导致所有标准的 OD值偏低。11.2 在洗板过程中如果出
13、现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。11.3 每加一种试剂前需要将其摇匀。11.4 反应终止液为 2M 硫酸，避免接触皮肤。11.5 不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。Q/JCWI 02172013 5 11.6 储存条件 11.7 保存试剂盒于 2-8（36-46），不要冷冻，将不用的微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。11.8 试剂变质的迹象 11.9 发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0 标准的吸光度（450/630nm）值小于 0.5（A450nm0.5）时，表示试剂可能变质。11.10 在加入底物液 A 液和底物液 B 液后，一般显色 15min 即可。若颜色较浅，可延长反应时间到 20min（或更长），但不得超过 25min。反之，则减短反应时间。11.11 该试剂盒最佳反应温度为 25，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化会直接影响检测结果。12 贮藏条件及保存期 贮藏条件：保存试剂盒于2-8(36-46)环境中。保存期：该产品有效期为12个月。_