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1、关于核酸的研究方法第1页，此课件共31页哦一一.核酸的分离，提纯和定量测定核酸的分离，提纯和定量测定 （一）一）DNA的分离提纯的分离提纯真核生物真核生物DNA与蛋白质的复合物（与蛋白质的复合物（DNP）溶于水溶于水和浓盐溶液，但不溶于和浓盐溶液，但不溶于0.14mol/L盐溶液，用苯酚或盐溶液，用苯酚或氯仿使蛋白质变性，氯仿使蛋白质变性，DNA溶于上清液。溶于上清液。在十二烷基硫酸钠（在十二烷基硫酸钠（SDS）存在下用蛋白酶消化细存在下用蛋白酶消化细胞，再用苯酚和氯仿除去蛋白酶，用胞，再用苯酚和氯仿除去蛋白酶，用RNase除去除去RNA，操作在低温下进行，防止过酸，过碱，或机操作在低温下进行
2、，防止过酸，过碱，或机械振荡，可得高质量的械振荡，可得高质量的DNA。第2页，此课件共31页哦 （二）（二）RNA的分离提纯的分离提纯RNA易被广泛存在的易被广泛存在的RNase水解，所有器皿与溶液水解，所有器皿与溶液都要经过处理除去都要经过处理除去RNase，在破碎细胞的同时应使在破碎细胞的同时应使RNaes失活，在实验反应体系中要加失活，在实验反应体系中要加RNaes的抑制的抑制剂。剂。目前常用的分离方法目前常用的分离方法为为釽釽盐盐/氯化铯密度梯度离氯化铯密度梯度离心心（RNA密度密度1.89，DNA密度密度-1.71，蛋白质密度，蛋白质密度 超螺旋超螺旋DNA 解链环状解链环状DNA
3、松弛环状松弛环状DNA 线形线形DNA也就是在离心管中最上层是线形也就是在离心管中最上层是线形DNA，最下面最下面是是RNA。第11页，此课件共31页哦三三.核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳（一）琼脂糖凝胶电泳一）琼脂糖凝胶电泳 以琼脂糖为支持物。电泳的迁移率决定于以下因素：以琼脂糖为支持物。电泳的迁移率决定于以下因素：（1）核酸分子大小）核酸分子大小 应用凝胶电泳可正确地测定应用凝胶电泳可正确地测定DNA片段的分片段的分子大小。在同一胶上加一已知其相对分子质量的样品。电泳完毕子大小。在同一胶上加一已知其相对分子质量的样品。电泳完毕后，经溴化乙锭染色，照相，从照片上比较待测样品中的后，经溴化乙锭染
4、色，照相，从照片上比较待测样品中的DNA片片段与标准样品中的哪一条带最接近，即可推算出未知样品中各片段与标准样品中的哪一条带最接近，即可推算出未知样品中各片段的大小。段的大小。（2）胶浓度）胶浓度（3）DNA的构象的构象（4）电压）电压（5）碱基组成）碱基组成（6）温度）温度（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳 以聚丙烯酰胺作支持物。以聚丙烯酰胺作支持物。第12页，此课件共31页哦核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳第13页，此课件共31页哦 （一）（一）DNA的酶法测序的酶法测序四四.核酸的核苷酸序列测定核酸的核苷酸序列测定第14页，此课件共31页哦DNA的酶法测序的酶法测序第15页，此
5、课件共31页哦DNA的酶法测序的酶法测序第16页，此课件共31页哦DNA的酶法测序的酶法测序第17页，此课件共31页哦Sanger法法第18页，此课件共31页哦Sanger法法第19页，此课件共31页哦第20页，此课件共31页哦 （二）（二）DNA的化学法测序的化学法测序 Maxam和和Gilbert于于1977年发明年发明1）用特异的化学试剂作用于不同的碱基进行修饰用特异的化学试剂作用于不同的碱基进行修饰2）然后用哌啶切除碱基，然后用哌啶切除碱基，DNA链断裂成片段，末端为特异链断裂成片段，末端为特异碱基碱基3）变性胶电泳分离，放射自显影得到测序图谱变性胶电泳分离，放射自显影得到测序图谱4）
6、判断方法同判断方法同Sanger终止法终止法（三）三）RNA测序测序 1）用特异酶切断特异碱基位置的核酸链。电泳分离得到测）用特异酶切断特异碱基位置的核酸链。电泳分离得到测序图谱，同序图谱，同Sanger终止法。终止法。2）化学试剂断裂化学试剂断裂RNA，电泳得到测序图谱电泳得到测序图谱 3）逆转录生成逆转录生成DNA，然后用然后用DNA测序法。测序法。第21页，此课件共31页哦 五五.DNA聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）PCR,polymerase chain reaction 是是80年代发展起来的年代发展起来的新技术，广泛应用于分新技术，广泛应用于分 子生物学子生物学(mole
7、cular biology)和基因工程和基因工程(gene engineer-ing)及其它与及其它与DNA鉴定相关的其它领鉴定相关的其它领 域，如疾病检域，如疾病检测、临床应用、商品检疫、法测、临床应用、商品检疫、法 医鉴定和新药品的开医鉴定和新药品的开发等。发等。PCR是指那些模拟体内是指那些模拟体内DNA复制的方式在体外选复制的方式在体外选 择择性地扩增性地扩增(amplify)DNA某个特殊区域的技术某个特殊区域的技术 第22页，此课件共31页哦PCR过程在自然界是不存在的，它是人们对过程在自然界是不存在的，它是人们对DNA 复复制的深刻理解而带来的产物。制的深刻理解而带来的产物。现代
8、现代PCR概念是概念是KaryMullis于于20世纪世纪80年代早期年代早期 发明的。经过与发明的。经过与Cetus公司的同事合作，最终导致公司的同事合作，最终导致 现在广泛使用的现在广泛使用的PCR技术的诞生。技术的诞生。Mullis的创新点在于使用两个与的创新点在于使用两个与DNA的两条不同链的两条不同链 互补的寡核苷酸作为引物特异性地扩增两个引物之互补的寡核苷酸作为引物特异性地扩增两个引物之 间的间的DNA区域，并且重复进行。在此同时，得到区域，并且重复进行。在此同时，得到的的 扩增产物又可作为下一轮扩增的模板扩增产物又可作为下一轮扩增的模板(template)，从而使得扩增产物按几何
9、级数递增。从而使得扩增产物按几何级数递增。特别重要的是，从嗜热细菌中分离的耐热特别重要的是，从嗜热细菌中分离的耐热DAN聚合聚合 酶使酶使PCR从概念成为真正适用的技术。从概念成为真正适用的技术。第23页，此课件共31页哦 1.基本要素基本要素 Template:ssDNA or dsDNA Primers:oligo-nucleotides 等等 substrates:dNTP DNA polymerase:Taq poly 2.反应过程反应过程 denature dsDNA ssDNA 92-96 C annealing 37-72 C 50-58 C extension 72 C 这三个
10、热反应过程的重复称为一个循环这三个热反应过程的重复称为一个循环(cycle)第24页，此课件共31页哦 PCR主要由主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成环构成：即在高温（即在高温（95）下，待扩增的靶）下，待扩增的靶DNA双链受热双链受热变性成为两条单链变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（模板；而后在低温（3755）情况下，）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成模板结合，形成部分双链；在部分双链；在Taq酶的最适温（酶的最适温（72）下，以引物）下，以引物
11、3端为合成的起端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以点，以单核苷酸为原料，沿模板以53方向延伸，合成方向延伸，合成DNA新新链。这样，每一双链的链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次模板，经过一次解链、退火、延伸解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，分子。如此反复进行，每一次循环所产生的每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以产物得以2n的批数形式迅速
12、扩增，经过的批数形式迅速扩增，经过2530个循环后，理个循环后，理论上可使基因扩增论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达倍以上，实际上一般可达106107倍。倍。第25页，此课件共31页哦聚合酶链式反应聚合酶链式反应第26页，此课件共31页哦假设扩增效率为假设扩增效率为“X”，循环数为循环数为“n”，则则二者与扩增倍数二者与扩增倍数“y”的关系式可表示为：的关系式可表示为：y=(1+X)n。扩增扩增30个循环即个循环即n=30时，若时，若X=100%，则则y=230=1073741824(109)；而若而若X=80%时，则时，则y=1.830=45517159.6 (107)。由此可见，
13、其扩增的倍数是巨大的，。由此可见，其扩增的倍数是巨大的，将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭染色，在将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭染色，在紫外线照射下（紫外线照射下（254nm）一般都可见到一般都可见到DNA的的特异扩增区带。特异扩增区带。第27页，此课件共31页哦六六.DNA的化学合成的化学合成将待活化的核苷酸上的某些游离基团保护将待活化的核苷酸上的某些游离基团保护（封闭）起来，使反应按设计的方向进行。（封闭）起来，使反应按设计的方向进行。5-OH用二对甲氧三苯甲基（用二对甲氧三苯甲基（DMT）保护，保护，碱基上的氨基用苯甲酸保护。碱基上的氨基用苯甲酸保护。对对3 -OH用氨基亚磷酸化合物进行活化
14、。用氨基亚磷酸化合物进行活化。第28页，此课件共31页哦A 第一个核苷酸的第一个核苷酸的3 -OH与固相（树脂）结合在一起，它的与固相（树脂）结合在一起，它的5-OH与活化的单体之间形成一个亚磷酸三酯，活化单体上的与活化的单体之间形成一个亚磷酸三酯，活化单体上的5-OH及碱环上的氨基等由于受到保护而不会参与反应。及碱环上的氨基等由于受到保护而不会参与反应。B 亚磷酸三酯经碘氧化形成磷酸三酯亚磷酸三酯经碘氧化形成磷酸三酯C 加入二氯乙酸除去生长链中的加入二氯乙酸除去生长链中的5-OH上的保护剂上的保护剂DMT，至此至此DNA链已延伸了一个核苷酸单位，并可投入下一轮反应。链已延伸了一个核苷酸单位，并可投入下一轮反应。D 整个整个DNA片段合成完毕后，用苯硫酚除去片段合成完毕后，用苯硫酚除去5-OH上的保护剂上的保护剂DMT，用浓氢氧化铵将用浓氢氧化铵将DNA片段与固相树脂断开，使片段与固相树脂断开，使DNA得得以洗脱下来。再用浓氢氧化铵在加热条件下使碱基上的保护以洗脱下来。再用浓氢氧化铵在加热条件下使碱基上的保护剂除去。最后除去氢氧化铵，在真空中抽干。剂除去。最后除去氢氧化铵，在真空中抽干。第29页，此课件共31页哦DNA的化学合成的化学合成第30页，此课件共31页哦感谢大家观看感谢大家观看第31页，此课件共31页哦