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1、RNA的提取与含量测定学号：200900140157 班级：09 生科 3 班姓名：俞华军时间：2011/03/22 一实验目的1.掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法。2.掌握紫外分光光度计的使用。3.了解和掌握紫外吸收法测定RNA浓度的原理。二实验原理酵母核酸中 RNA含量较多，DNA则少于 2%。RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使其沉淀，由此即可得到 RNA制品。但是用碱液提取的RNA有不同的降解。核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在 260nm左右，且 一定浓 度范围 内 其浓 度与 吸 光度 成正 比（浓 度 为5g/ml 45g/ml
2、吸光度与浓度成正比），利用此性质，可用 RNA标准液绘制 RNA吸光标准曲线(标准曲线的斜率为0.022-0.024左右)，测定样品 RNA浓度。由于蛋白质在 280nm 的光吸收，对核酸测定有一定的干扰作用，最大吸收峰在 280nm处，原因是蛋白质组成中常含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸。所以如果有蛋白质的干扰必须得先测260nm 处的吸光度，再测 280nm 处的吸光度，通过计算消除其对核酸的影响。三实验器材试剂：0.2%氢氧化钠溶液、95%酸性乙醇、无水乙醚、氨水（A.R.）、10%硫酸溶液、5%硝酸银溶液、RNA标准蛋白溶液（100g/ml）用品：干酵母粉、鲜酵母、pH 试纸（pH1-
3、14）、电子天平、烧杯 100ml（x1）、量筒 50ml（x1）、10ml（x1）、离心机、容量瓶 100ml（x4）、液枪 1.0（x1）、0.5ml（x1）、722 型分光光度计、磁力搅拌器、离心机、离心管（x2）、试管 1.5 15cm（x15）、锥形瓶 200ml（x1）、100 水浴锅四实验步骤1.RNA的提取（1）称取 4g 干酵母粉，放入200ml 锥形瓶中，加入40ml0.2%的氢氧化钠溶液，在沸水浴中煮沸30min 中并冷却；（2）冷却后，把液体倒入离心管中，在4000r/min 的条件下离心 5min；（3）离心后留上清液加入95%的酸性乙醇40ml，边加边搅拌，静置51
4、0min，再 4000r/min 的条件下离心 5min；（4）离心后保留沉淀，再每次用10ml95%乙醇洗涤沉淀，在3000r/min 的条件下离心 5min，洗涤两次；（5）离心后的沉淀再用无水乙醇10ml 洗涤两次，每次用3000r/min 离心5min；（6）离心结束后，收集沉淀与滤纸上，称重备用。名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 1 页，共 3 页 -2.RNA样液的配制（1）取粗 RNA0.2-0.25g 与烧杯中，加入 5mlNaOH 溶液，搅拌，溶解，调成糊状。（2）再加入蒸馏水 40ml，搅拌混匀，调 PH 至 7.0 后，放入 100ml 容量瓶中定容。（3
5、）再分 3-4 次分别取 2ml 定容后溶液于100ml 容量瓶中继续定容待测,并且把容量瓶依次编号为A、B、C、D。3.RNA标准曲线的绘制（1）取 12 个洁净的试管，依次标号为1-8、A、B、C、D后，按照下表分别往各试管中加所需液体，并用磁力搅拌器混匀表一紫外光测样品 RNA浓度溶液配制表项目1 2 3 4 5 6 7 8 A B C D 标准 RNA/ml 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.4 2.8 0 0 0 0 蒸馏水/ml 8 7.6 7.2 6.8 6.4 6.0 5.6 5.2 0 0 0 0 RNA样品/ml 0 0 0 0 0 0 0 0 8.0 8.0
6、 8.0 8.0 RNA浓度 g/ml 0 5 10 15 20 25 30 35 待测待测待测待测260nm（A）（2）混匀后以 1 号试管为参比液，在260nm下测各试管的吸光度A，并根据 1-8 试管的吸光值绘制出RNA标准曲线，并最终得出样品的浓度。五实验结果记录与处理1.RNA的提取称重结果：滤纸：1.08g滤纸+RNA粗样品：2.33g样品质量：1.25g2.RNA样液的配制称取 RNA样品的质量：0.2246g 3.RNA标准曲线的绘制表二各个试管在 260nm处吸光度结果记录项目1 2 3 4 5 6 7 8 A B C D 样品均值260nm（A）0.000 0.068 0.
7、160 0.223 0.397 0.497 0.607 0.633 0.401 0.469 0.489 0.476 0.478 名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 2 页，共 3 页 -RNA标准曲线样品 RNA的含量：由图中矩形点可知，稀释后粗制RNA溶液浓度为 25.1ug/ml,乘以稀释倍数可得，RNA含量为：25.1g/ml 50 100=0.1225g，RNA 纯度为：0.1225/0.2246=55.9%六实验分析1提取的 RNA干后，最终得到是浅黄色的块状固体，而纯度较高的 RNA干燥后应为白色，根据其颜色可分析出其纯度较低，含有杂质较多，原因为洗涤时为洗干净。2.在称重时由于沉淀未完全干燥，所以导致RNA样品的质量偏高一些。3.在测定 RNA样液时，一定要避免假重复，不是取二次定容后的样液连测三次，而是取第一次定容后的样液取三次，分别再定容一次，分别测定，这样可以消除定容误差、移取溶液时的误差，如果分别测定的结果相差较大，可以再取第一次定容后的溶液继续定容，测第四次（我们发现A、B、C偏差较大，就再多做了一组），取最接近的三组。4.由图一可知，本次实验的数据基本在一条直线上，说明实验结果叫准确。名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 3 页，共 3 页 -