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1、用HPLC DAD ESI MS/MS 方法对黄芪抗病毒活性部位进行植物化学研究Li Tang?Ying Liu?Yeing Wang?Chunlin Lon 摘要：黄芪在中国是一种用来治疗疾病的常用中草药。为了弄清黄芪的抗病毒成分，我们用 HPLC DAD ESI MS/MS 分离和鉴定了黄芪提取物的几种抗病毒的活性成分。通过比较已发表文献的保留时间和MS 数据，共鉴定出 18个化合物，包括 11个黄酮和 7个皂苷类化合物。这个研究为快速鉴别传统中药的生物活性成分提供了一种途径。关键词：黄芪 抗病毒的活性 黄酮 皂苷前言：中药广泛用于疾病的治疗，为中华民族的繁荣和发展做出了重要贡献。然而，它
2、的治疗机制却没有弄清。现在中药的复杂成分和它的有效性相关的提法被广泛接受。因此，为了保证中药在临床上的可靠性，更好的弄清药物活性的基础并且提高产品的质量，阐明和分析中药的活性成分是很有必要的。由于中药成分的复杂性使这一领域的研究有很大挑战性。因此，鉴别有效成分是很重要的。现在，HPLC MSn已经被证明是中药提取鉴定的一个有力工具。这个方法在灵敏度和特异性方面有优势。黄芪，是荚膜黄芪的干燥根，在中国叫做黄芪，是广为人知的一种补气药。黄芪拥有许多生物学功能，包括保肝，抗氧化，抗病毒，抗高血压和刺激免疫应答等。根据报道黄芪含有三萜皂苷，异黄酮类和多糖等类成分。在这个研究研究中，我们对黄芪的有抗炎活
3、性的部分进行了植物化学成分的研究。采用 HPLC DAD ESI MS/MS 技术，比对已有化合物的 UV 光谱和 MS 数据共鉴别出18个化合物，包括 11个黄酮类化合物和 7个皂苷类化合物。这个结果有助于人们对黄芪的临床用药有更好的理解，并且有利于为这个传统中草药提供更好的质量控制方法。材料和方法：化学制品和试剂：毛蕊异黄酮-7-O-D-吡喃葡萄糖苷,毛蕊异黄酮，7-羟基-4-甲氧异黄酮都名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 1 页，共 9 页 -已经从荚膜黄芪中分离得到。标准品保存在我们实验室，结构已经经氢谱和碳谱阐明(一瓦里安 Mercury-Vx BB 器材,帕洛阿尔托,
4、美国,300 MHz 下测得氢谱,75 MHz 下获得13C谱)。通过HPLC 检测纯度高于 95%。黄芪甲甙 IV买自国家药品生物制品检定所（北京，中华人民共和国）。HPLC 用乙腈从默克公司购买。分析用乙醇和乙酸购自北京试剂有限公司。D101大孔树脂购自中国天津树脂厂。材料和样品准备：黄芪在 2007年12月北京同仁堂中药有限公司购得并且经作者进行了形态学鉴定。植物经乙醇冷凝回流提取三次（每次两个小时）。过滤和浓缩后，干浸膏用水再次溶解并且过D101大孔树脂柱。用水和30%乙醇洗脱后用 70%乙醇再次洗脱。三次提取物用旋转蒸发仪减压浓缩。和最开始的乙醇提取物一起，准备做抗病毒实验。HPLC
5、 MS 工具和条件：分析用安捷伦 1100系列MSD Trap system（安捷伦科技，帕洛阿尔托，加利福尼亚州，美国），此系统装备了真空除气器，四元泵，自动采样器，柱温箱，二极管阵列检测器，电喷射离子化接口的离子阱质谱仪，用安捷伦LC/MSD Trap软 件控 制，Zorbax SB-C18(150 mm4.6 mm i.d.,5 m)和 一个 Zorbax ODS-C18 预柱(12.5 mm 4.6 mm i.d.,5m)用来分离。流动相为水-0.3%乙酸（A）和乙腈（B）.梯度洗脱：0 30分，线性梯度20 60%B；30 35分，线性梯度 60 20%B。流速 0.8 ml/min
6、，柱温 25 C。峰用DAD 检测器，在阳离子模式下检测。质谱在质核比 100到1500范围扫描。为得到每个分析物的最大信号峰，MS 条件选择如下：干燥氮气，8l/min，毛细管温度 325 C，喷雾器压力 30psi，毛细管电压，15 V；离子喷射电压 3.5kV，待测物溶于甲醇中配制成5mg/ml溶剂，在 12000 rpm条件下离心 15min，在进样前去除颗粒状物。细胞和病毒:Hep-2细胞在达尔伯克改良伊格尔培养基中培养。该培养基中含2mmol/L的谷氨酰胺，100U/ml的青霉素，链霉素，另添加10%胎牛血清(中美合资生物技术公司)。培养基放在 37 C，5%CO2条件的培养箱中。
7、副流感病毒，呼吸道合胞体病毒，单纯疱疹病毒-1，单纯疱疹病毒-2，腺病毒-3和腺病毒-7 由中国中药研究所，中名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 2 页，共 9 页 -药研究会提供。病毒在单层Hep-2细胞中繁殖并储存在-70 C 的冰箱中。体外测定抗病毒活性：被测成分用 DMSO溶解并浓缩到 10mg/ml。工作溶液通过用 MEM 双重连续稀释的方法准备好并加入到四个孔中，200l/well。正常细胞做对照。四天的培养过程中，通过光学显微镜观察致细胞病变效应。通过Reed Muench 方法，黄芪的浓缩物的CC50 被测定出来。Hep-2细胞生长至汇合，在滴度 100CCID5
8、0 下被病毒感染。在 1.5 小时长的病毒吸收期后，含病毒的介质换成新鲜介质，被测部位经过一系列的稀释同时加入到培养基中。感染细胞不接受控制病毒的药物治疗。当传染病后48-96小时百分百的细胞病变效应被检测到后，能获得百分之五十的抑制CPE 的药物浓度称为半抑制浓度，通过三次独立测定得到。选择性指数，或者CC50 和IC50的比也能计算被测部分的抗病毒活性。利巴韦林用做阳性对照。抗病毒活性的生物测定方法：抗副流感病毒活性测试用黄芪乙醇提取物和过大孔树脂后的水，30%乙醇和 70%乙醇的洗脱部分。四部分的半抑制浓度分别为20.7 5.2,135.2 4.6,48.4 3.9,和15.8 1.2
9、g/ml。相应的四部分的选择性指数分别为5.8 0.6,1.5 0.4,3.1 0.3 和 8.5 0.6。这表明 70%乙醇从 D101 上的洗脱的部位是黄芪最有抗病毒活性的部分。百分之七十部分的一系列的抗病毒活性列在表一中。结果表明百分之七十的部位对呼吸道病毒，单纯疱疹病毒-1，单纯疱疹病毒-2有适度的活性。对腺病毒-3，腺病毒-7和副流感病毒有重要的抑制活性。结果表明百分之七十的部分是黄芪的抗病毒活性的基础。表1 百分之七十部位在 Hep-2细胞中的抗病毒活性。Virus 70%F Ribavirin IC50(tg/ml)SI IC50(tg/ml)SI Parainfluenza v
10、irus14.1 1.1 8.5 0.6 77.3 5.8 9.4 0.7 Respiratory syncytial virus 57.1 5.6 2.1 0.2 113.7 8.5 6.4 0.4 Herpes simplex virus-1 41.4 4.7 2.9 0.3 143.3 5.8 5.1 0.2 Herpes simplex virus-2 42.8 4.1 2.8 0.3 128.3 4.5 5.7 0.2 Adenovirus-3 22.6 0.8 5.3 0.2 95.3 10.5 7.7 0.7 Adenovirus-7 15.7 0.9 7.6 0.5 85.7
11、4.0 8.5 0.4 SI selectivity index n=3名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 3 页，共 9 页 -N=3 Fig.1 70%F 的化合物结构HPLC DAD ESI MS/MS 对百分之七十部分的研究：HPLC DAD ESI MS/MS 方法可以用来鉴定百分之七十部分的植化成分。如Fig.2a所示，高效液相色谱的紫外检测器在280nm 条件下，总共有十二个重要的峰分离开。MS 在阳离子模式下的总离子流色谱图如Fig.2b所示。并不是所有的化合物在紫外检测器 280nm 条件下都能检测到。例如在提取物中一些皂苷在共轭体系缺失的情况下就不能检测到。在
12、总离子流色谱中，检测到19个重要的峰。通过和已知化合物作比较可以明确的鉴别出化合物一，八，十一，十三分别为毛蕊异黄酮-7-O-吡喃葡萄糖苷，毛蕊异黄酮，黄芪甲甙IV，7-羟基-4-甲氧异黄酮。化名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 4 页，共 9 页 -合物2由于在提取物中量比较少而且和其他化合物分的不是很开，所以被认为是一种量比较少的未鉴定出的黄酮类化合物。其他化合物通过和已发表的一些数据的紫外吸收，质核比，MSMS 特征和保留时间等的比对来完成鉴别。化合物3和6是一对同分异构体。它们都在 463处有M+H+离子，它们的MS2谱同样有 m/z在301处的离子，这证明了分子量 16
13、2的葡萄糖的出现。这两个化合物同样在280nm 处有最大的紫外吸收，证明由紫檀烷结构组成。通过检测已知的黄芪中的紫檀烷葡萄糖苷，仅 9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-D-吡喃葡萄糖苷和 3,9-二甲氧基紫檀烷-10-O-D-吡喃葡萄糖苷被发现含有以上的数据。根据含量的不同和以前报道的HPLC 保留时间的不同，化合物三和六因此暂时性的鉴定为3,9-二甲氧基紫檀烷-10-O-D-吡喃葡萄糖苷和 9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-D-吡喃葡萄糖苷。化合物4在质核比 489处有M+H+离子，即比化合物 1多42个单位，它的 MS/MS 谱显示在M/Z285处有一重要的离子，这是毛蕊异黄酮的特征离子。另
14、外，和化合物一一样，化合物 4在260纳米和 290纳米处有最大的紫外吸收。基于这些数据，化合物四被认为是 6-O-乙酰基毛蕊异黄酮-7-O-D-吡喃葡萄糖苷。化合物五产生的M+H+离子在431出，它的 MS/MS 波谱图显示一个重要的离子M+H-Glu+在269处。它是7-羟基-4-甲氧异黄酮的特征离子。另外化合物 5和化合物 13一样在紫外 250纳米和 301纳米处有最大的紫外吸收。根据这些数据，化合物5被鉴定为芒柄花苷。化合物 7显示了一个 M+NH4+离子在 482处，它的 MS/MS 谱显示在303处有一个重要的离子，这是M+H-Glu+，是7,2-二羟基-3,4-二甲氧基异黄烷的
15、重要特征离子。因此根据已有的数据鉴定为2-甲氧基-3,4-二甲氧基异黄烷-7-O-D-吡喃葡萄糖苷。化合物 9在473处有M+H+离子，即比化合物5多出42个单位。它的 ms/ms 谱显示了在 269处有一个重要的离子。它是7-羟基-4-甲氧异黄酮,的一个重要的特征离子。另外，化合物 9和化合物 5一样，在250nm 和301nm 处有最大的紫外吸收。因此，化合物 9被鉴定为 6-O-乙酰基芒柄花苷。化合物 10在质核比 301处有M+H+离子，在 280纳米处有最大的紫外吸收。这和紫檀烷一致。因此化合物10的结构鉴定为 3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷。化合物 12和14是一对同分异构体。
16、它们都在849处有M+Na+离子。它们的 MS/MS 谱显示在 669处有重要的的离子 M+Na-Glu-H2O，和其他的离子，789处有 M+Na-CH3COOH+离子，在 609处有M+Na 名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 5 页，共 9 页 -Glu-H2O-CH3COOH+离子，在 477处有M+Na-Glu-H2O-acetylxyl+离子。这些碎片支持了木糖部分连接乙酰基和葡萄糖碎片的存在。通过检测在黄芪中已知的皂苷类，发现黄芪苷 II 和异黄芪苷 II 含有以上数据。由于含量不同和在 HPLC 上的保留时间不同，化合物 12和化合物 14分别鉴定为黄芪苷 II
17、和异黄芪苷 II。化合物 15在303处有M+H+离子，在 282纳米处有最大的紫外吸收。和已发现的文献比较，化合物 15的结构被鉴定为 7,2-二羟基-3,4-二甲氧基异黄烷.化合物 16在645处有M+Na+离子，它的 MS2光谱显示了在 513处有一个重要的离子 M+Na+。通过检验黄芪中已知的皂苷类，仅仅膜荚黄芪苷由以上的数据组成。化合物16被鉴定为膜荚黄芪苷。化合物 17和化合物 18是一对异构体。它们在 891处有M+Na+离子，它们的 MS/MS 谱在711处有一个重要的离子 M+Na-Glu-H2O+，也有其他的离子。在 831处是M+Na-CH3COOH+离子，在 771处是
18、M+Na-2CH3COOH+离子，在651处是M+Na-CH3COOH-Glu-H2O+离子，在591处是M+Na-2CH3COOH-Glu-H2O+，在477处是M+Na-Glu-H2O-2acetylxyl+这些碎片证明了木糖部分连接两个乙酰基和一个葡萄糖残基。通过查看黄芪中的已知皂苷，黄芪皂苷I 和异黄芪皂苷 I 的数据和以上相符。根据含量不同和HPLC 的保留时间不同，化合物17和化合物 18被鉴定为黄芪苷 I 和异黄芪皂苷 I。化合物 19在933处有M+Na+离子，它的MS/MS 谱显示在 753处有M+Na-Glu-H2O+重要离子，通过查看黄芪中的已知皂苷，只有乙酰黄芪苷 I
19、由以上数据组成。因此化合物19鉴定为乙酰黄芪苷 I。名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 6 页，共 9 页 -Fig.2 HPLC DAD ESI MS 分析70%F.a HPLC UV 谱,检测在280nm 处。b LC 阳离子 ESI MS 总离子流(TIC)分布。讨论：尽管质量控制往往成为阻碍中药发展的障碍，近来也依然提出了一些方法并且取得了一些成绩。现在HPLC DAD ESI MS/MS 分析方法已成功的应用于分离和鉴定复杂成分中的不同种类的化合物。在已鉴定的化合物中毛蕊异黄酮-7-O-D-吡喃葡萄糖苷和黄芪甲甙 IV曾报道有生物学活性。我们的研究证明黄芪的抗病毒活性归
20、因于复杂的生物活性成分并且为黄芪提供了一个可靠的质量控制方法。另外，生物测定和 HPLC DAD ESI MS/MS 分析的联合应用是一种快速鉴定植物药生物活性成分的有效途径。致谢：此项工作得到了北京新星工程(2008118),985 工程(CUN 985-03-03)and 111工程(B08044)支持。名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 7 页，共 9 页 -参考文献：1.Liu L,Cheng YY,Zhang HJ(2004)Phytochemical analysis of anti-atherogenic constituents of xue-fu-zhu-yu-
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