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1、生 物 工 程 学 报Chin J Biotech2009,January 25;25(1):121-128 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 ?2009 Institute of Microbiology,CAS&CSM,All rights reservedReceived:July 11,2008;Accepted:November 19,2008 Supported by:the National Natural Science Foundation of China(Nos.20576036,20776044).Corre
2、sponding author:Wensong Tan.Tel:+86-21-64250948;Fax:+86-21-64252250;E-mail:国家自然科学基金项目(Nos.20576036,20776044)资助。组织工程和细胞培养 骨髓间充质干细胞无血清培养吴伟,周燕,谭文松华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海 200237 摘要:为建立一种化学成分明确的、能用于体外扩增骨髓间充质干细胞的无血清培养基,且骨髓间充质干细胞经无血清培养扩增后仍能保持其多向分化的潜能。采用密度梯度离心结合贴壁法从1 月龄新西兰大白兔股骨中分离骨髓间充质干细胞,比较在含10%胎牛血清的培养基(SC
3、M)和自制的化学成分明确的无血清培养基(CDSFM)中骨髓间充质干细胞的形态、增殖能力,以及扩增后的骨髓间充质干细胞的细胞周期、集落形成能力和成骨、成脂肪分化能力。经过10 d的培养,骨髓间充质干细胞在自制的无血清培养基中扩增了50 倍,在含 10%胎牛血清的培养基中扩增了40 倍。在无血清 和 有 血 清 培 养 基 中 扩 增 后 的 细 胞 中 G0/G1期 比 例 分 别 为(80.31%0.58%)和(75.24%4.05%),两 者 无 显 著 差 异(P0.05)。无血清培养扩增后的骨髓间充质干细胞集落形成率(12.7%4.0%)低于有血清培养组(28.7%4.2%),两者比较差
4、异显著(P0.05)compared to 75.24%4.05%for SCM culture.However,the cloning efficiency of BM-MSCs cultured in CDSFM was significantly lower than that in SCM(P0.01).The expanded BM-MSCs in CDSFM preserved differentiation potentials into mesenchymal lineages in vitro,including adipocytes and osteoblasts.We h
5、ave designed a chemically-defined serum free medium that could support in vitro proliferation and maintain the properties of BM-MSCs as stem cells,which could be applied to cell-based therapy and biomedical research.名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 1 页，共 8 页 -122 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech Jan
6、uary 25,2009 Vol.25 No.1 J Keywords:bone marrow-derived mesenchymal stem cells,serum free medium,proliferation,multilineage differentiation,tissue engineering 骨 髓 间 充 质 干 细 胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BM-MSCs)是存在于骨髓基质系统中非造血性的成体干细胞,能在体内和体外诱导分化成骨、软骨、脂肪、肌肉1等组织,且具有免疫调节功能2,因而可以作为组织工程理想的种
7、子细胞来源。但骨髓中间充质干细胞含量极少,必须在体外进行扩增以获得足够的细胞数量来满足应用需求。添加了胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)的培养基被认为是体外扩增骨髓间充质干细胞最有效的培养基3。然而,血清成分不明确,其中可能含有动物携带的已知的或未知的病原体,在临床应用中具有潜在的危险,因而研究人员致力于开发适合骨髓间充质干细胞的无血清培养基。早期开发的无血清培养基通常缺乏贴壁因子4,细胞需要在含血清的培养基中贴壁完全后,再更换无血清培养基进行培养,因此不是严格意义上的无血清培养。如今,人们通常在间充质干细胞的无血清培养基中添加血清替代物以促进细胞贴壁和增殖的成分并不明确
8、,有未知的动物来源的蛋白,仍具有潜在的危险性。近 年 来,有 报 道 使 用 浓 缩 的 血 小 板 裂 解 物(Platelet Lysates,PL)作为安全的血清替代物在体外扩增骨髓间充质干细胞6,但其化学成分仍不明确,且应用过程中需要大量的外周血,无法满足大规模扩增骨髓间充质干细胞的需求。因此迫切需要开发能够大量扩增骨髓间充质干细胞的化学成分明确的无血清培养基。本研究旨在建立一种化学成分明确的无血清培养基,在实现骨髓间充质干细胞体外扩增的同时,能够维持其自我更新和多向分化潜能。1材料与方法1.1材料兔骨髓间充质干细胞取自于1 月龄新西兰大白兔股骨和胫骨,-MEM 培养基、DMEM 培养
9、基和胰蛋白酶均购自Gibco 公司,胎牛血清购自Biochrom AG 公司,氨基酸浓缩液(由本实验室自行配制,含20 种氨基酸,均购自 Sigma),胰蛋白酶抑制剂、碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、牛血清白蛋白(BSA)、还原型谷胱甘肽、-巯基乙醇、地塞米松、氢化可的松、SITE(亚硒酸钠、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺)、I 型鼠尾胶原、抗坏血酸、地塞米松、-甘油磷酸钠、IBMX、消炎痛、茜素红、油红-O、EDTA、二甲基亚砜(DMSO)均购自 Sigma。1.2方法1.2.1BM-MSCs 的分离、培养和扩增空气栓塞法处死1 月龄新西兰大白兔,无菌分离股骨和胫骨,并在
10、75%乙醇中浸泡5 min。PBS冲洗 35 遍,用碎骨钳去除骨两端骨骺,用注射器反复冲洗骨髓腔,获得骨髓细胞悬液,将得到的骨髓细胞悬液离心后重悬,缓慢铺到离心管中预先加好的等体积的 Ficoll 淋巴细胞分离液(密度 1.077 g/mL)液面上,3000 r/min 离心 30 min,以尖头吸管小心吸取中间云雾状细胞层,加入 PBS 冲洗并离心除去残留 Ficoll,即得单个核细胞。台盼蓝染色进行活细胞计数后用含10%胎牛血清的-MEM 培养基调整单个核细胞密度至1106 cells/mL,接种到 100 mm 培置于 37C、5%CO2、中培养。2448 h 后倒置相差显微镜(Niko
11、n)下观察细胞贴壁,换液除去悬浮细胞。之后每3 d 换液,待培养皿中的原代BM-MSCs生长至 80%汇合后,用含 0.02%EDTA 的 0.25%胰酶溶液消化,加入含FBS 的培养液终止胰酶作用,以1:(34)进行传代培养。1.2.2细胞增殖能力检测和传代培养原代 BM-MSCs 生长至 80%汇合后,用含 0.02%EDTA 的 0.25%胰酶溶液消化,10 mg/mL 胰酶抑制剂中和胰酶活性,PBS 洗涤后制备 BM-MSCs 单细胞悬液,调整细胞密度为0.5 104 cells/mL,接种于预铺了 I 型鼠尾胶原的24 孔板(Nunc)中,每 3 d 换液,每天取样,血球计数板计细胞
12、数,绘制细胞生长曲线。每组实验设 3 个平行样本,共进行 2批实验,进行统计分析。有血清培养体系(SCM)为-MEM 培养基添加10%胎 牛 血 清,无 血 清 培 养 体 系(CDSFM)为-MEM 培养基添加10 mg/L bFGF、10 mg/L EGF、5 g/L BSA、1.5 mg/L 还原型谷胱甘肽、0.1 mmol/L -巯基乙醇、1%(V/V)SITE、10 mg/L 氢化可的松、10 nmol/L 地塞米松和氨基酸浓缩液。按下列公式计名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 2 页，共 8 页 -吴伟等:骨髓间充质干细胞无血清培养123J算各生长参数:扩增倍数:扩增
13、倍数(Dn)=n 代收获的细胞数/n代接种的细胞数平 均 倍 增 时 间:平 均 倍 增 时 间(ADT)=(t2-t1)/log2(N2/N1)为了检测BM-MSCs 在无血清的连续传代能力,同 上 制 备BM-MSCs的 单 细 胞 悬 液,以1 105 cells/well 的接种密度,接种于预铺了I 型鼠尾胶原的 6 孔板中,每组实验设3 个平行样本,每 3 d 进行传代培养,计细胞数,并计算累积扩增的细胞总数。1.2.3有效因子分析BM-MSCs 在无血清培养1 代后,取细胞密度为1104 cells/mL 的单细胞悬液,每孔 1 mL 接种于预铺了I 型鼠尾胶原的 24孔板中。将
14、bFGF、EGF、地塞米松、氢化可的松两两添加至不含这4 种组分的 CDSFM 中,对照组为无血清的-MEM 培养基和 CDSFM,每组实验设 3 个平行样本。培养 3 d后计细胞数。1.2.4细胞周期检测BM-MSCs 在无血清和有血清培养1 代后,以0.5 104 cells/mL 的密度接种于100 mm培养皿中,分别经过无血清和有血清培养-20C预冷的 70%乙醇固定染色,流式细胞仪(BD 公司)检测 DNA 含量。每组实验均取 3 个样本,进行显著性差异分析。1.2.5集落形成检测BM-MSCs 在无血清和有血清中分别培养1 代、2 代、3代后,以 200 cells/well 的密
15、度接种于预铺了I 型鼠尾胶原的6 孔板(Nunc)中,每 3 d 换液,7 d 后结晶紫染色集落,相差显微镜下计集落数,超过 50个细胞计为一个集落。每组实验设3 个平行样本。按下面公式计算集落形成率:集落形成率(Colony-forming efficiency,CFE)(%)=(集落数/接种细胞数)100%1.2.6诱导 BM-MSCs 成骨分化BM-MSCs 在无血清和有血清培养1 代后,以1105 cells/well 接种于预铺了I 型鼠尾胶原的6 孔板中,待细胞达到50%汇合时更换培养基为成骨诱导培养基。成骨诱导培养基为DMEM 培养基添加10%胎牛血清、1 mol/L 地塞米松、
16、50 g/mL 抗坏血酸、0.01 mol/L -甘油磷酸钠。对照组为添加10%胎牛血清的 DMEM 培养基。每 3 d 换液,诱导 14 d 后,95%乙醇固定,茜素红染色,显微镜下观察胞外钙基质沉积。钙测定试剂盒(南京建成)测定胞外钙基质沉积。每组实验设3 个平行样本。1.2.7诱导 BM-MSCs 成脂肪分化BM-MSCs在无血清和有血清培养1 代后,以1105 cells/well 接种于预铺了I 型鼠尾胶原的6孔板中,待细胞达到80%汇合时更换培养基为脂肪诱导培养基。脂肪诱导培养基为DMEM 添加 10%胎牛血清、10 g/mL 胰 岛 素、1 mol/L 地 塞 米 松、0.5 m
17、mol/L IBMX、0.1 mmol/L 消炎痛。对照组为添加 10%胎牛血清的 DMEM 培养基。每 3 d 换液,诱导 14 d 后,10%多聚甲醛固定,饱和油红-O 染液染色,显微镜下观察胞内着色脂滴。异丙醇萃取脂滴内的油红-O,在 510 nm 下测定光吸收值,进行脂滴定量分析。每组实验设3 个平行样本。1.2.8 统计学处理数据结果均以xs 表示,采用 SPSS 13.0 软件进行统计分析,组间差别采用双尾t 检验和方差分析(结果以 P0.05 为有较显著性差异,P0.05)。2.5集落形成比较如图 5a 所示,无血清扩增后的BM-MSCs 的集落 形 成 率 为(12.67%4.
18、04%),低 于 有 血 清 组(28.00%2.00%),二者比较差异显著(n=3,P0.01)。随着无血清培养代次的增加,细胞的集落形成能力略有下降,培养了 2 代、3 代后细胞的集落形成率分别为(11.00%2.64%)、(7.50%1.73%),而有血清组则维持在 28%左右。等渗结晶紫染色细胞集落,可见有血清组细胞的集落尺寸较无血清培养组大(图 5b)。名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 4 页，共 8 页 -吴伟等:骨髓间充质干细胞无血清培养125J图 4BM-MSCs在 CDSFM和 SCM 中的细胞周期比较Fig.4 Comparison of cell cycl
19、e of BM-MSCs expanded in CDSFM and SCM.图 5BM-MSCs经 CDSFM和 SCM 扩增后的集落形成比较Fig.5 Colony-forming of BM-MSCs cultured in CDSFM and SCM.a:colony-forming efficiency for 3 passages;b:representative crystal violet staining of BM-MSCs colonies;n=3,*P0.05,*P0.01.Error bars represent standard deviations.2.6成骨分化
20、比较经过无血清或有血清培养扩增后的骨髓间充质干细胞在成骨诱导培养基中诱导3 d 后均可见钙结节形成,14 d后茜素红染色呈阳性(图 6),箭头所示为阳性区域。图 6BM-MSCs经 CDSFM和 SCM 扩增后的成骨分化比较Fig.6 Osteogenesis of BM-MSCs after expanded in CDSFM and SCM at day 14(100).The phase contrast images of BM-MSCs grown in(a)CDSFM and in(d)SCM.Calcium nodules formation in osteogenesis of
21、 BM-MSCs expanded in(b)CDSFM and(e)SCM.Alizarin red staining of calcium nodules in osteogenesis of BM-MSCs expanded in(c)CDSFM and(f)SCM.钙试剂盒检测细胞外钙沉积的结果见图7,无血清组钙含量(2.08 0.03)mol/106 cells 较有血清组(2.29 0.02)mol/106 cells 略低,二者相比差异较显著(n=3,P0.05)。2.7脂肪分化比较如图 8 所示,骨髓间充质干细胞在成脂肪诱导过程中,随着诱导时间的延长,细胞形态逐渐变得宽大扁平,
22、扩增速度变慢,胞内开始逐渐积聚大量镜下可见的脂滴。诱导 14 d 后,油红-O 染色呈阳性,箭头所示为阳性区域。胞内的油红经异丙醇萃取后,在 510 nm 下测定吸光度,对脂滴进行定量分析(图 9)。无血清组的油 红 含 量 略 高 于 有 血 清 组,二 者 差 异 较 显 著(P0.05)。名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 5 页，共 8 页 -126 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech January 25,2009 Vol.25 No.1 J 图 7BM-MSCs经 CDSFM和 SCM 扩增后的成骨诱导14 d 后钙含量定
23、量分析Fig.7 Calcium content of BM-MSCs constructs in osteo-induced(osteogenesis)and complete media(control)at day 14.n=3,*P0.05.Error bars represent standard deviations.图 8BM-MSCs经 CDSFM和 SCM 扩增后的成脂肪分化比较Fig.8 Adipogenesis of BM-MSCs after expanded in CDSFM and SCM at day 14(100).The phase contrast imag
24、es of BM-MSCs grown in(a)CDSFM and(d)SCM.Adipocyte lipid-vacuole formation in adipogenesis of BM-MSCs expanded in(b)CDSFM and(e)SCM.Oil red-O staining of lipid-vacuole in adipogenesis of BM-MSCs expanded in(c)CDSFM and(f)SCM.图 9BM-MSCs经 CDSFM和 SCM 扩增后的成脂肪诱导 14 d 油红-O 染色定量分析Fig.9 Adipocyte lipid-vacu
25、ole quantitative analysis of BM-MSCs after expanded in CDSFM and SCM at day 14.n=3,*P0.05.Error bars represent standard deviations.3讨论骨髓间充质干细胞因其具有多向分化潜能和免疫调节功能,成为组织工程良好的种子细胞。目前,体外扩增BM-MSCs,不论是实验研究还是临床应用,通常在基础培养基中添加胎牛血清,这被认为是培养 BM-MSCs 的最佳条件3。但是使用动物血清具有两面性,一方面血清含大量的蛋白、丰富的营养成分、细胞因子、微量元素以及贴壁因子等,能很好地支持细
26、胞的生长;另一方面,血清的生物安全性受到人们普遍质疑,其可能含有动物来源的病原体,在生产临床级别的人用细胞产品时,理论上会导致这些病原体的传播。此外,细胞的吞噬作用使牛血清中的蛋白分子细胞内在化,当进行细胞移植时将导致宿主产生免疫反应7,因而本研究旨在构建一种化学成分明确的、适合骨髓间充质干细胞生长的无血清培养体系,以避免这些潜在的威胁。骨髓间充质干细胞无血清体外扩增,要解决2个关键问题:促进细胞贴壁和增殖。在早期关于骨髓间充质干细胞无血清培养的研究中,往往通过有血清培养贴壁完全后,更换为无血清培养基进行培养4,这样会残留血清成分,具有潜在的危险。在本研究中,通过在培养基中添加或者在培养介质表
27、面预铺一层胶原,可以有效地促进细胞贴壁。在无血清培养中,由于培养皿表面铺有一层胶原,有利于细胞贴壁铺展,因而无血清培养中飘浮的细胞少于有血清培养。由图2 生长曲线可见无血清培养的延滞期较长,说明细胞需要较长的时间适应无血清环境,而在有血清培养中,部分贴壁较早的细胞可能开始增殖,计算接种24 h 后细胞的贴壁率,无血清组(50.50%6.36%)低于有血清组(57.50%5.30%),因而需要进一步考察BM-MSCs在无血清环境中24 h 内的贴壁动力学。对于促进细胞增殖,主要通过生长维持、损伤保护和刺激增殖来实现。生长维持主要通过补充氨基酸和SITE 来实现,SITE 是各种动物细胞的无血清培
28、养基中必需组分,对细胞在无血清条件下生长的维持至关重要8。血清白蛋白、还原型谷胱甘肽、-巯基乙醇等可以保护细胞在无血清环境中免受各种毒素和氧化损伤。为了促进骨髓间充质干细胞增殖,本研究所采用的无血清培养基在基础培养基添加蛋白、微量元素和抗氧化剂的基础上,进一步添加了在有血清培名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 6 页，共 8 页 -吴伟等:骨髓间充质干细胞无血清培养127J养中能刺激骨髓间充质干细胞增殖并维持其干细胞特性的物质。在有血清培养中,bFGF 和地塞米松能够促进骨髓间充质干细胞集落形成和增殖,维持成骨分化潜能9。此外,EGF 也被认为是骨髓间充质干细胞集落形成所必需的1
29、0。关于氢化可的松影响细胞增殖的报道较少,Paulsen 等11在化学成分明确的培养基中添加氢化可的松,用来维持鸡和鼠的间充质细胞高密度培养。Ye 等12在有血清培养造血祖细胞的培养中也添加了氢化可的松。考虑到无血清培养基的成本,本研究仅选取bFGF 和 EGF 这两种文献报道较多的生长因子,以及氢化可的松和地塞米松这 4 种添加剂,考察它们对骨髓间充质干细胞的促增殖作用。实验结果表明这4 种添加剂均能在无血清培养环境中促进骨髓间充质干细胞增殖(数据未显示)。为了进一研究这4 种添加剂对骨髓间充质干细胞增殖的促进作用,并假设各添加剂不独立发生作用,而是受到其他添加剂的影响,对 bFGF、EGF
30、、氢化可的松和地塞米松进行因子分析。结果表明,bFGF 或 EGF 与氢化可的松联合使用能够显著地刺激骨髓间充质干细胞增殖13脐 血 间 充 质 干 细Mansukhani 等14认为 FGF 与其受体(FGFR)结合后,通过激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)旁路,促进细胞增殖。Bianchi 等15认为 FGF-2 在骨髓间充质干细胞的培养中选择了端粒较长的亚群,因而在培养基中添加FGF-2,表现出其增殖能力的提高。EGF则通过与EGFR 结合,激活细胞外信号调节激酶(ERK)和蛋白激酶(AKT)途径,促进骨髓间充质干细胞增殖16。Almawi 等17研究表明糖皮质激素能够促进生长因子受体表
31、达,Scutt等9发现在有血清培养中,bFGF 和地塞米松联合使用能促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化。本研究表明bFGF 或 EGF 和氢化可的松的联合使用在无血清培养中促增殖效果更好,下一步的研究重点将是考察氢化可的松是否可能通过促进bFGFR和 EGFR 表达来协助生长因子刺激骨髓间充质干细胞增殖。本研究所采用的无血清培养基在体外扩增骨髓间充质干细胞,尽管平均倍增时间(42.6 h)较有血清时间(35.8 h)长,但远低于 Marshak 等18建立的无血清培养基(96 h),且与有血清组对照,培养液中飘浮的死细胞较少,最终经 10 d 培养,无血清组获得较高的细胞扩增倍数。在连续传代培
32、养中,无血清培养的细胞在前3 代能保持较高的增殖能力。但随着代次的增加,无血清培养的细胞增殖能力有所下降。4 代以后,无血清培养的细胞增殖能力已不如有血清培养,但经过5 代的无血清培养,细胞扩增了1000 倍,而在 Lennon4和 Marshak18等的研究中并无传代培养的数据描述。经无血清扩增的骨髓间充质干细胞80%以上处于 G0/G1期,略高于有血清组,但组间无明显差异,符合干细胞的慢周期特性。但前者集落形成率仅为有血清组的一半,表明该无血清培养基中可能还缺乏促进集落形成的细胞因子。因此,培养基组分和各组分的有效浓度还需进一步优化,以促进干细胞的自我更新。经过成骨和成脂肪诱导14 d 后
33、,茜素红和油红-O 染色均呈阳性,表明无血清培养基扩增后的骨髓间充质干细胞能够分化成成骨和脂肪细胞。同时,无血清组成骨诱导后的胞外钙基质沉积略低于有血清组,而成脂肪诱导后脂滴附着的油红则略高于有血清组。经无血清培养扩增的骨髓间充质干细胞其分化能力在不同方向上有何变化,还需进一步的实验验证。本研究表明,该无血清培养基能够在体外进行骨髓间充质干细胞的扩增,扩增后的细胞仍能保持其干细胞特性,包括慢周期特性、自我更新能力(集落形成能力)以及多向分化潜能。REFERENCES 1 Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineage potential of
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