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1、肿瘤模型专题1.最新的药效学指导原则要求化药临床前进行至少5 种人源肿瘤的体内抗癌活性评价，以确定药效及抗瘤谱。2.瘤株对药物的敏感性通过体外筛选可以说明，而体内评价更大程度上是考虑药物经体内吸收、分布、代谢之后的活性，由于目前的肿瘤模型多采用皮下接种，并不能完全反映药物的组织分布对其影响，所以感觉这种要求就显得不是很必要。注解：体内的敏感性不是仅考虑吸收分布代谢的影响，一些样品，体外活性都是不错的，体内甚至是瘤内直接注射给到很高剂量都没有效果，肿瘤细胞在体内和体外的生存环境差别很大，体外模拟的生存环境完全不能体现出体内的状态。3.皮下接种是一个目前能找到的最好的权宜之计了，实际上，SFDA明
2、确表示，鼓励原位肿瘤模型，但是由于技术的原因，很多瘤株都无法实现。而皮下模型有它的一系列优点：稳定，便于观察，易于构建，易于控制等等，能够在一定程度上反映药物经过体内过程的疗效，所以目前只能用它来进行评价。4.实际上原位肿瘤模型仍然不能很好的反映临床肿瘤的特点，目前能够预见得到最好的模型应该是经过基因修饰（转基因等）的能够集中比较均匀的自发模型，这才是和临床最接近的肿瘤模型。名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 1 页，共 13 页 -但是目前的经过基因修饰的自发肿瘤模型种类很少，而且可控制性差，周期长，所以还要经过很长时间的改善才能大规模的应用。5.常规的肿瘤细胞株接种后如果不能
3、成瘤，细胞悬液就会被动物吸收6.瘤体积可用游标卡尺量最长径（a)和最短径（b），体积计算公式：V=ab2/6,每 2-3 天测一次。体积=宽2*长/2 的公式计算肿瘤体积；抑瘤率=（对照组-治疗组）/对照组*100%；tumor size=width2 length 0.52).；ab2/6；关于肿瘤体积的计算：3.1415926./6约等于/2。如果想做得讲究一点，应该用RTV计算肿瘤体积：RTV（某日某老鼠的相对肿瘤体积）=TV(测量当天该老鼠的肿瘤体积）/TV（分组当天该老鼠的肿瘤体积）*100，在此基础上进行平均值SD等数据的计算7.是否必须称重小鼠的胸腺和脾脏8.超过 7 天的腹水再
4、传代就很容易出现血性；动物的周龄也不要太大，6 周左右。传代次数太多也很容易出现血性腹水。血性腹水可以离心后加 0.17 N 的 NH4CL 溶液破红细胞，然后精确一些的控制条件（接种量，传代时间，动物周龄等）传几代，很多情况下再传一两代后会有不血性的种鼠出现，然后用这只种鼠的腹水继续传代9.皮下接种与剥瘤子：小鼠肿瘤剥瘤子是一个艰难的过程，但是可以一定程度上的改善一下：接种的时候要精确控制接种在皮下，靠皮内会与皮肤强烈粘连，靠肌肉会与肌肉强烈粘连，而且不要名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 2 页，共 13 页 -太靠腋窝里面，可以往尾部靠一些，也可以稍微的往背部靠一点，不要往
5、腹部靠，容易使肿瘤被垫料磨烂。10.LD50 是毒理中的半数致死量，ED50 是体外试验中的半数有效量，一般体内实验没有类似的指标，如果想比较几个类似物的药效还是做量效曲线比较好。11.剂量设置应该按照LD10(10%致死剂量，也叫最大耐受剂量）来分组，一般分别采用1/2 LD10,1/4 LD10,1/7 LD10 或 1/10 LD,但最大剂量不得超过LD10。这里面还得考虑 ED 50，LD10 与 ED50的剂量相差越大越好。用 LD50 作为标准设置剂量是不现实的，因为动物实验是不可能允许10%以上动物死亡的。12.说到疗效的比较，如只是发文章，比较不同基团之间可能对母体抑瘤率的影响
6、，一般做做体外试验，比一比大家的IC50 就好了，不太做体内。如是真正的筛药，我个人有些观点：这个不是孤立起来看某个或者某几个剂量下谁比谁的抑瘤率高。主要要看谁更具有可开发性。首先，要考虑它的毒性以及治疗窗口 的大小，通俗的说，就是这个要在发挥疗效的剂量下，毒性是否大？比如A药，10mg 抑瘤率有 50%，但是体重下降了20%;而 B药，10mg的时候根本无效，30mg 的时候有 40%的抑瘤率，60mg 的时候抑瘤率高达 80%，而且体重几乎没有下降，这个时候 A 药与 B 药如何比较？特别如果是公司筛选新药，还要考虑成本，病人可接受度（动物上的有效剂量换算到人一天要吃2 斤，这种药也是不现
7、实的），制剂，工艺等等方面。如果单纯从药理的角度给出答案，名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 3 页，共 13 页 -至少要考虑 毒性和剂量限制 的问题。13.关于剂量选择，LD50 的几分之一是一种比较通用的方法，目前相对更合理一些的剂量选择是做一个简单的多次给药的毒理试验来确定剂量，我们一般会连续给药一周，然后再观察一周，这样摸出来的最大剂量可以直接用于药效试验，然后其他的剂量都在此剂量的基础上往下减。14.说到给药疗程，一般初筛的药物都是连续天天给药，qd。但是给药途径，特别是i.v 与 i.p 的选择，我们都是先做一个简单的PK试验考察一下，再确定，特别是如果PK 试验的
8、结果显示，血药浓度甚至达不到体外IC50 的浓度，那么是否进行体内试验，就有待商榷了。连续 i.p，小鼠的皮肤有时候会变厚，你可以换一边给药。15.动物选择:KM 小鼠,裸鼠,C57 等均可作为,但是个人认为 KM 能做出来最好,毕竟比较有普遍性,还是正常生理状态的健康动物,比较有说服力,还便宜,裸鼠或者其他特定品种,比较适合特定的瘤株16.关于肿瘤细胞活力的问题:一般培养的肿瘤细胞活力往往是不够的,很难在短时间内长到规定重量,所以建议至少在动物体内传2代,让肿瘤细胞活力充分体现以后再开始用于实验.传代数次的原因在于让肿瘤细胞充分活化，要不活化也行，多接种点吧17.关于接种部位的问题:以小鼠为
9、例一般可以选择腋下或者后肢,背部血管不发达,营养不够,一般不建议采用.接种一般采用皮下注射,针头沿皮肤水平进入,然后挑起表皮,注射名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 4 页，共 13 页 -18.关于肿瘤重量的问题:模型组肿瘤重量应该不低于0.5g19.肺内原位注射制作肿瘤模型效果颇好,流程如下:麻醉-固定-皮肤消毒-剪开左侧胸部皮肤,大约第 2-3 肋间的位置-用镊子轻轻拨开皮下筋膜,可以看到呼吸运动的肺叶-将准备好的肿瘤细胞注射入肺,分层缝合 OK20.胸膜活检穿刺针规格：#20#25(14G 12G)L 65 mm；用途：供人体胸腔穿刺，钩取胸膜活体组织用21.开始做肿瘤药
10、效评价，应该采用 s180 这些小鼠肿瘤模型。一个方面这些肿瘤对于药物很敏感，而且周期短，花费也少。但如果要成药，裸鼠模型是必需的。22.一般瘤重的 SD 在平均值的 7080%以下就还凑活，漂亮一点的是在 30%以下，实在不行，100%也勉强，就是特别难看，但是SD越大，统计上就越不利23.皮下肿瘤模型中，腋下最适合肿瘤生长。接种时由裸鼠体侧腰部稍靠上的部位进针，要保证与接种点的距离小于针头的长度，向头部方穿行，绝对不能刺破皮肤或者刺破肌肉层，当针头到达接种位点时注射，退出针头，这样操作的目的并不完全是避免漏液，其实熟练后，不需要皮下穿行也不会漏液，主要是避免污染，进针点还有少量污染的可能性
11、的，针头在皮下穿行一段后，接种点离进针点较远，最大限度减少污染的可能。24.如果是药效试验，不建议你用手术标本，因为SFDA 的临床前研究指导原则上明确指出要用建株的肿瘤株进行试验，因为用手术名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 5 页，共 13 页 -标本的试验可重复性太差25.一般用 4-5WK，体重 1517g 鼠，年轻鼠接种瘤容易长26.种植肾被膜下：第一该区免疫豁免，第二贴近肾可以从此获得充分的养料.在实验时先用显微用的镊子在肾被膜上撕慨一个小口子,然后种植。注意:肾被膜和肾脏是有一个间隙可以用镊子在被膜下赶肿瘤组织到远离撕开口处,不用缝合被膜.这样就可以了27.人肿瘤模
12、型用裸鼠，基本上没有可成腹水的，只能皮下接种传代28.nude mice 的数据在 SCID mice 上是比较有参考价值的，另外，因为免疫系统的进一步缺乏，肿瘤生长的进程可能会比nude mice上更快一点29.接种后，用干净的棉签按住注射部位才拔针,拔针后再按住 10 秒种左右,一般不会有液体渗出30.K562 第一代细胞接种的成瘤很好，传一代就很差了，没有几只成瘤的，到第三代就全军覆没31.不赞同用 7901 这个瘤株，国际公认度比较差32.分组要求平行性，尽量缩小组间差异，组内差异是实际情况的反映。你可以按照肿瘤体积分层随机分组，这样平行性比较好33.肿瘤细胞悬液裸鼠接种前稀释效果顺序
13、：相应的无血清培养基PBSsaline34.现在常用的阳性对照药物是CTX和 cisplatin，另外乳腺癌可以用Taxol。阳性药的剂量途径和疗程不要求和样品一致，不过给药途径尽量一样。还有，最好选用机制类似或者结构类似的阳性对照。名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 6 页，共 13 页 -一般来说阳性对照的抑制率都会在60%以上或者更大，少数情况下只有 50%左右。35.细胞毒类抗肿瘤药物临床前体内试验一般至少应选用6 种人癌移植瘤模型，其中应包括II 期临床试验中拟筛选的肿瘤组织类型。36.针对每一种人癌移植瘤模型，推荐采用相对肿瘤增殖率T/C（%）作为试验评价指标，评价标
14、准通常为：T/C（%）40%为无效；T/C（%）40%，并经统计学处理P 0.05 为有效。在体内有效性试验采用的全部人癌移植模型中，一般至少应有1/3 达到有效标准。注解：对于 T/C40%，按照这个标准，很多现有的一线化疗药物都会被淘汰37.适于接种的瘤源的直径最好为1cm 或者稍大一点，直径2cm 可能对于有些瘤株来说会太大了一点。一般来说，插块法，一个瘤源接种 30 只动物是没有问题的，匀浆法一般2 只也可以接种 30只了38.新的抗肿瘤药物指导原则上强调要3 代以上才能用，并且不能超过 1520 代（人肿瘤）。39.只有少部分的小鼠实体瘤可以腹水传代，人实体瘤几乎没有能够腹水传代的4
15、0.一般来说，小鼠肿瘤比较推荐路易斯肺癌和B16。国内的S180并不好，各实验室之间的变异很大。国外基本都不用它。其实并不是因为 S180 有多好大家才选用他，而是他进行实验的成本低，周期短，操作较容易名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 7 页，共 13 页 -41.灌胃药溶解用生理盐水可以吗：不一定，根据混悬效果来看，一般多用 0.5-2%甲基纤维素钠（CMC-Na）42.实体肿瘤不可以采用生命持续时间这个指标，这个是明确有规定的43.正常的实体肿瘤都是越长越大，最后可能会溃破，但是没有消亡这个现象，如果肿瘤整体的自发消亡，说明模型有问题，最大可能是被污染了44.出针挂组织的问
16、题，关键在于针头的磨制，在针后部的小突起于小缺口吻合后，实体针弯曲方向应该与套管针磨制的斜面一致，接种时，实体针要推到底，也就是后面的小突起与小缺口契合，然后针头“舔住”肌肉层转一圈再退针，还有就是瘤块一定要完全塞入针头内，外面不能有漏出来的。45.S180、H22 不需要测量肿瘤体积，试验结束后直接剥取肿瘤成瘤重46.瘤株皮下成瘤率好，那么到了原位应该会更好47.建议最好流水线操作，确保每一个步骤都是同一个人做到底的，比如插块法，可以一个人切，一个人塞瘤块，一个人接种；比较忌讳每个人自己切自己塞自己接种，然后只做一部分的动物48.B16 是小鼠黑色素瘤，宿主一般多用C57 小鼠，因为这个肿瘤
17、的细胞是黑色的，用它做肺转移，在白色的肺叶上是黑色的转移灶，很容易分辨。49.在注射肿瘤细胞前对小鼠使用环磷酰氨 或放射线照射,有利于名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 8 页，共 13 页 -移植瘤的生长50.对于水不溶药物：低浓度的DMSO 确实是一个不错的解决手段，当然这么做进行报批是不能够被接受的，因为临床不允许这样的制剂血液给药，但是动物实验凑合可以，1%的浓度很低了，实际上，给小鼠（包括裸鼠）尾静脉注射DMSO，5%以下基本没有任何反应，10%的时候需要较慢的速度注射，但是动物也能够接受，再高就不行了51.瘤内注射：总注射量只能为瘤体积的10%，最多 20%，瘤内注射
18、有一定的技巧，我们就是用的4 号针头，但是进针点要远一点，让针头在皮下多走一段，然后再刺入瘤内，一个肿瘤可以多点注射，但是一定要注意，刺入一点注射完毕以后，针头退出瘤组织，但是绝对不能退出皮下，然后换个地方再刺进去，一个点只能注射 1015ul，不要多打，比如要注射20ul，就分两个点注射，每个点 10ul。52.肿瘤模型一般常用的有小鼠模型和人肿瘤裸小鼠移植瘤模型。其中用得最多的是皮下模型，另外还有腹水（或者尾静脉注射）以及原位模型，其他的模型很少用53.小鼠模型分三大类：a)第一类：以S180、EAC、H22 等为代表的，他们的宿主小鼠多选用 KM，可产生腹水，也可在皮下成瘤。多以腹水传代
19、，实验时抽取腹水，经过一定稀释后皮下接种构建模型，接踵后第二天开始给药，给药7 到 10 天，接种 10 天后结束试验，名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 9 页，共 13 页 -剥取肿瘤称瘤重。i.关于构建瘤种：可以用体外细胞株培养后，用PBS 悬浮至 13106/0.1ml/mouse，i.p 接种即可，最好用6 号左右的针头，就是常用的2ml 一次性注射的针头。ii.关于腹水传代：观察到第一代的种鼠肚子较大后（一般约89 天左右），可以传代，传代时取1ml 注射器，用2ml注射器的针头，种鼠腹部消毒后直接将针头插入抽取腹水即可，注意不要把针头插得很深，尽量浅一点，还可以把老
20、鼠拎起来，利用重力，让腹水集中在某处便于抽取，一般抽个 0.5ml 就可以了，不用离心，直接用PBS36 倍稀释后，接种到新的老鼠腹腔，腹水颜色为白色或者略有发黄都是正常的，但是血性腹水说明不好，需要注意调整，第二代以后，尽量 67 天的时候传代，不要等的时间太久，否则腹水容易血性。三代后可用于试验。iii.关于接种进行试验：这个时候抽取的腹水需要量比较多，一般需要处死种鼠后，小心地用消毒眼科剪刀镊子剥开腹部皮肤，注意不要弄破肌肉，然后，用镊子（最好是那种前面有倒勾的镊子，学名好像是唇型镊）拎起腹部的肌肉，用剪刀剪开一个小口，然后用玻璃滴管或者去掉针头的注射器吸取腹水。然后经过一定的稀释后，接
21、种到小鼠的腋下。关于稀释量，各个实验室的情况都不一样，最好摸索一下，开始的时候可以适当的计数，但是要用台盼兰染色名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 10 页，共 13 页 -后计活细胞数。接种部位在小鼠腋下，但是不要深入到腋窝里面，会给以后的操作带来麻烦。接种时的进针处离接种处远一点，让针头在皮下多走一段，不容易污染。有的人接种的时候喜欢针头向上用力，紧贴着表皮往里走，然后注射的时候感觉阻力较大，打出来的皮丘又紧又圆，这样的接种，会使肿瘤与皮肤严重粘连，不利于最后肿瘤的剥取。也不要紧靠肌肉，肿瘤会与肌肉严重粘连。应该在两者之间，进针的感觉轻松自如，针头很自由，虽然打出来的肿瘤不会
22、很圆很漂亮，但是相对好剥取一些。iv.关于观测指标：主要是按时称体重，试验结束后剥取肿瘤称瘤重。因为出瘤已经是接种后的第6 天左右了，第10天就结束时间，瘤体积的数据意义就不大。小鼠肿瘤很难剥，这是没有办法的，只能耐心，没有太好的办法，剥多了以后，手上会掌握一些巧力，有一些帮助，但是我们还是很头痛小鼠肿瘤试验结束。肿瘤组织周围经常会有一些血窦的形成，弄破后会有血和黄色的液体流出，正常的，但是剥瘤子的时候不要把它弄破，会严重影响瘤重。按照SFDA 的规定，平均瘤重小于1g，或者单个瘤重小于200mg，认为肿瘤生长不良，试验作废。b)第二类：以 lewis 肺癌、B16 为代表的，他们的宿主多为C
23、57。不产生腹水，只能皮下生长。多用插块法或者匀浆法传代和接种做试验。有一种做法也是接种后第二天开始给药，还有一种名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 11 页，共 13 页 -做法是接种三天后给药，接种后两周结束试验，剥取肿瘤称重。i.关 于 瘤 种构 建：体 外 细 胞 株，培 养 后PBS 悬 浮 至13 106/0.1ml/site，接种至小鼠腋下，即可。ii.关于传代与接种：剥取肿瘤，在PBS中取出肿瘤表面包膜和中心的坏死部分，剪刀剪成小块，小块大小以套管针的针口为标准。用镊子将小块从针头处塞进1820 号的套管针，接种至小鼠腋下，用套管针中间的实体针将瘤块推出即可。还可
24、以在上述肿瘤组织剪成小块后，用玻璃匀浆器匀浆后，200 目筛网过滤，收集滤液，活细胞计数，PBS稀释后用注射器接种，稀释量也需要各个实验室自己摸索。也是三代后可用于试验。iii.关于观测指标：可以在出瘤后测量瘤体积，但是主要还是考察瘤重。c)第三类：以 P388、L1210 为代表的白血病模型。宿主为 DBA2，也有人用 C57 与 DBA2 的 F1 代传代，DBA2 用于试验，但是我们两种宿主都传过代，没有发现有什么区别。他们能形成腹水，一般不用于皮下接种试验，平时多用腹水传代，实验时多用腹腔接种或尾静脉接种考察生存时间。也是接种后第二天开始给药。这个就不细说了，很多可以参考第一类，主要几点就是，他们的腹水都是血性的。另外，腹水量也不多，有的时候可以先注射一到两毫升的PBS后，再抽取。54.合成化合物或植物提取纯品的IC5010 gm1 或植物粗提物的名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 12 页，共 13 页 -IC5020 gm1 时，则判断样品在体外对肿瘤细胞有杀伤作用。55.名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 13 页，共 13 页 -