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1、第1卷 第9期环 境 工 程 学 报Vol.1,No.92 0 0 7年9月Chinese Journal of Environmental EngineeringSep.2 0 0 7生物强化技术及其在废水生物处理中的应用王建芳1赵庆良13 林佶侃2金文标3(1.哈尔滨工业大学市政环境工程学院,哈尔滨150090;2.金迪生物科技集团,东莞523581;3.哈尔滨工业大学深圳研究生院,深圳518055)摘 要 生物强化技术广泛应用于废水生物处理中,而竞争力和适应性强的高效菌株筛选是生物强化技术的决定性因素。论述了利用具有代谢性能的可移动基因片段强化、基因工程菌强化和常规微生物学手段分离菌株的
2、生物强化技术,并阐述了生物强化技术在废水生物处理过程中去除难降解有机物,去除过量的氮、磷等营养物质,维持生物系统稳定性中的应用。关键词 高效菌筛选基因工程 可移动基因组分 废水生物处理中图分类号X703.1文献标识码A文章编号 167329108(2007)0920040206B ioaugm entation technology andits appli cation inbiolog ical wastewater trea tm entW angJianfang1ZhaoQingliang1L in Jikan2JinW enbiao3(11School of Munici pal a
3、nd Environmental Engineering,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090;2.Golden B io2Treat TechnologyL im ited,Dongguan 523581;3.HarbinInstitute of Technology Campus of ShenzhenUniversity Town,Shenzhen 518055)Abstract B ioaug mentation technol ogy has beenwidely used in biological waste water tre
4、at ment in recentyears.The screenof high efficient bacteriawith stronger adaptability and competition in new environment is oneofdecisive factors for bioaug mentation technology.The paper elaboratesthreemethods for aug mentation of catabolicmobile genetic ele ments,geneengineering strainsand bacteri
5、awhich were isolated by conventionally microbiolog2ical tools.The applications of bioaug mentation technol ogy in biological waste water treat ment for re moval of recal2citrant contaminantsand redundantnutrients suchasN,P,andmaintaining stability of ecological syste ms are dis2cussed.Key wordsscree
6、nof effective and efficient bacteria;geneengineering;mobile genetic ele ments;biologi2cal waste water treat ment收稿日期:2006-03-28;修订日期:2007-07-20作者简介:王建芳(1973),女,博士研究生,主要从事废水生物处理技术与资源化研究工作。E2mail:3 通讯联系人,E2mail:自然环境或生物处理体系中,微生物通过自身的生命活动降解污染物、将有害物质分解为稳定无害的小分子物质,如 CO2和 H2O。随着工业的发展,一些有毒有害物质的排放会对环境微生物产生一定
7、的毒害作用,使得生物降解体系中缺乏足够的微生物降解相应的污染物,或抑制具有降解复杂污染物性能的微生物生长,需要很长一段时间才能通过酶的诱导、遗传物质转移等方式使微生物逐渐适应。有效微生物的数量和浓度是生物处理的决定性影响因素。因此,生物强化技术受到人们的青睐。生物强化技术是向传统的生物处理系统中引入具有特定功能的微生物,提高有效微生物的浓度,增强对难降解污染物的降解能力,提高其降解速率,并改善原有生物处理体系对目标污染物的去除效能。将生物强化技术融入到传统的生物修复,并结合现代分子生物学技术和分析化学提供的新方法、手段进行监测、评价,已成为土壤、地下水等生物修复发展的一种趋势 1。在废水生物处
8、理技术中,由于某些污染物的复杂性、难降解性及对微生物体系的抑制性,用常规的处理方法很难有效去除。向生物反应器中投加特种微生物的生物强化技术成为有效的辅助手段。?1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 1 页，共 6 页 -第9期王建芳等:生物强化技术及其在废水生物处理中的应用1 环境微生物学中的生物强化技术以生物强化为基础的生物修复理念非常简单,通过具有降解功能的微生物强化受污染体系,能加速生物修复,核心是投加高
9、效降解微生物。其效果由微生物本身的降解性能和各种生态因素综合作用决定。高竞争力和适应性强的高效菌株筛选是生物强化技术成败的关键。根据用于生物强化的菌株筛选或构建途径不同,生物强化技术主要可分为以下3种:(1)含有代谢功能的可移动基因组分的菌株强化;(2)通过基因工程手段改造得到具有特定功能的微生物强化;(3)利用常规的微生物学手段,通过长期驯化得到具有一定降解能力的微生物菌群或从特定环境中分离纯化得到某些具有特定降解性能的微生物强化。1.1具有代谢性能的可移动基因片段(cataboli cm obile genetic ele m ents)强化通过向具有竞争力的土著微生物中引入可移动代谢基因
10、,能加速自然基因的交换和代谢途径的构建,可作为受污染土壤和水体生物强化的有效手段 2。接种含有可移动基因组分可为微生物引入特定特征的代谢基因。这些具有代谢功能的可移动组分包括质粒、可交换组分和可利用类抗菌素整合酶的组分等 3,4,大部分都存在于经选择性分离的异型生物降解菌株。一旦代谢活性的基因组分在土著微生物中转移、表达,就不再需要供体。Springael等 5 向活性污泥和活性污泥2 膜生物反应器中引入P.putidaBN210 菌株,这种微生物携带能降解32 氯苯甲酸(3CBA)的 clc基因。利用PCR2 DGGE 分析表明,尽管 2个反应器中BN210 菌株消失,反应器仍具有降解3CB
11、A性能,活性污泥2 膜 生物反应器的降解速率是活性污泥系统的3倍多,表明clc基因组分已转移到土著微生物中。生物处理系统中通过基因组分转移进行生物强化的主要条件是细胞密度,因为供体和感受态菌株需直接接触。Mancini 等 6 研究了活性污泥单元中质粒转移,发现在初沉池的底部和二沉池的回流污泥中,细胞浓度最高,转化融合子的数量最多;相同条件下,由于膜生物反应器比活性污泥具有更高的细胞密度,有助于可移动基因组分的转移。由于很难寻找含有难降解污染物降解基因的供体,分离纯化相关的降解基因,并快速灵敏探测基因转移,以质粒为中介的生物强化技术大部分研究都停留在实验室阶段。1.2利用基因工程技术构建高效微
12、生物的生物强化 运用微生物遗传学的手段去改造生物反应器中的微生物特性,使之获得高耐毒性、高降解活性以及特异或广谱降解污染物等优良遗传性状,从而创造出新的高效生物处理工艺。Dai 等 7通过三轮基因重组将Sphingobilumchlorophenolicum对剧毒杀虫剂五氯酚的耐受浓度提高了10倍以上,并可将培养基中所含的3 mmol/L 五氯酚完全降解。通过基因重组将多种有益的突变组合在一起,其中包括提高菌体生长速率、提高五氯酚降解酶的组成型表达和提高菌株对五氯酚的耐受性。W atanabe 等 8监测了活性污泥中降解酚的微生物菌群,从菌株C.testosteroniR 5中选择数量上占主
13、导 的 编 码 酚 羟 化 酶 基 因phc,整 合 到Co2mamonass p.r N7,得到转化菌株rN7,其中特定酚氧化活性比原菌株R5活性高出3倍多。35 d后,定量 PCR结果表明,phc基因仍留在转化株中,每毫升液体中含有108个拷贝,而没有监测到phc基因供体 R5。而且,接种含有转化株的活性污泥,提高了酚氧化活性和抗酚冲击负荷能力。显而易见,酚处理能力的提高是由已适应自然生态系统的外源代谢基因引起的。利用这种含有外源代谢基因的土著微生物强化,可避免与土著微生物竞争资源和空间、面对原生、后生动物的捕食和不利的生长条件。就废水生物处理而言,通过遗传学手段创造的基因工程菌在处理有毒
14、、生物难降解废水中,已显示出诱人的应用前景。目前基因工程菌生物强化,实验室研究偏多,实际应用较少。造成这种情况的原因主要有:(1)进行系统的遗传工程育种尚缺乏一个生物有效降解菌种资源库;(2)对于污染物降解基因在各种有效降解菌体内的定位尚需做大量的研究工作;(3)由于人们对基因工程菌释放到环境后的生态影响尚缺乏充分的认识,目前除细胞融合技术、原生质体融合技术、诱变技术和传统杂交繁殖技术等外,其他遗传工程菌向野外释放的行为还需要经过各国政府的严格审查和批准。1.3利用常规微生物学手段分离菌株的生物强化1.3.1 筛选高效菌株在长期驯化或受污染环境中,通过选择性培养基分离具有特定降解性能的微生物,
15、再通过富集培养、多次分离纯化得到高效微生物用于生物强化,具14?1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 2 页，共 6 页 -环境工程学报第1卷体流程见图1。直到现在,利用这种分离方法筛选到的高效菌仍是生物强化技术的主流。理想菌株的筛选是生物强化技术决定性因素;新的生态环境对生物强化效果也有重要影响。图1 高效微生物筛选和生产流程图Fig.1Sche matic flow chart of screen ofef
16、fective m icroorganism s1.3.2高效菌株筛选存在的问题到目前为止,菌株的筛选一般都以降解能力作为惟一标准。但这种标准筛选得到的菌株应用于生物强化可能存在2个方面的问题:缺乏对微生物的原位扩增潜力和活性的了解;有可能所得到的高效菌是致病菌,会对社会造成不利影响。在特定的条件下,通过选择性富集,得到具有相对高效降解能力的菌株,在目标污染源土著微生物中不一定具有典型性或代表性,或者有可能只是一些暂时存在的微生物。而且富集过程不可能提高菌株在实际环境中与土著微生物的竞争力。因此由于缺乏对原微生物菌群及在目标污染地微生物种群构成及动力学变化的了解,容易使优势菌株选择失败。Sim
17、on等 9将 2种商业生物强化菌剂用于提高湿地石油污染生物修复,结果表明,这 2种菌剂在湿地生物修复中没有明显作用。Oerther等 10 在 S BR 系统中加入纯培养Acinetobacters p.菌株,对系统的启动并没有重要影响。此外,以降解能力作为惟一标准筛选得到的一些菌株,有可能是致病菌,应用于环境工程会造成负面社会影响。例如,假单胞P.aeruginosa菌株是多功能革兰氏阴性细菌,但可能会引起肺炎和严重的呼吸道疾病 11,不宜用于工程实践。1.3.3 改进型高效菌筛选生物强化技术要取得成功应用,取决于高效菌株筛选、投放到目标污染地后微生物的生存能力和活性以及被选菌株相适宜的环境
18、参数。在排除致病菌的基础上,按照降解效能与维持微生物持久性和活性相结合的原则筛选高效微生物。首先,了解微生物在原菌群生态系统中的特征,以微生物独特性、种群动力学、时空分布为基础,确定优势的微生物种群;在确定优势微生物种群的基础上,鉴别能够降解目标污染物的菌株。van derGast 1214 等利用三重标准选择处理金属车间废液的高效菌株:微生物在金属车间废液中初始微生物的相对丰度;对共污染物(废液中共存的化合物)的耐受性;处理金属车间废液的能力。用这种方法筛选的耐共污染物毒性的微生物,在处理金属车间废液时,处理效率要比接种从污水中分离到的不明确菌团高出85%。化学分析方法和特定的探针分析,表明
19、这些高效菌株是生物反应器中微生物的重要组分,并能在反应器中稳定持久存在。1.3.4 生态因素对生物强化的影响陌生的生态环境也是生物强化技术成功的一个主要障碍。有时生物强化技术的失败并不是由于缺乏相关的、具有代谢功能的微生物,而是由于缺乏维持微 生 物 正 常 代 谢 功 能 和 活 性 的 环 境 条 件。Bouchez等 15 在具有硝化功能的S BR 反应器运行中,多次大量使用好氧反硝化菌进行生物强化。结果不仅硝化能力没有提高,而且外源微生物快速消失,这主要是由于在生态系统中,原生、后生动物占优势,细菌被广泛捕食所致。尽管各种单一的或混合菌株加入生态系统中能够提高该生态系统中生物降解潜能,
20、但效果经常是短暂的。原生、后生动物的捕食,与土著微生物竞争营养物质、电子受体,湿度、温度、pH、DO、污染物浓度、毒性和微量元素等多种因素共同影响生物强化的效果。因此,为了给外源微生物创造良好的生态环境,一方面,可通过生物刺激与生物强化相结合,提高外源微生物的竞争力,如提供充足的营养、微量元素等,另一方面,通过各种固定化手段防止接种微生物流失,减少直接捕食等 16,17。2生物强化在废水生物处理中的应用2.1去除难降解有机物研究者们利用各种手段分离到具有特定降解性24?1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House.Al
21、l rights reserved.http:/名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 3 页，共 6 页 -第9期王建芳等:生物强化技术及其在废水生物处理中的应用能的微生物,通过生物强化手段,提高有效微生物的浓度,改善生物系统的处理效果。Wang等 18 以喹啉作为目标污染物,在厌氧 2 缺氧 2 好氧(A/A/O)系统以喹啉降解菌B urkholderiapickettii强化处理焦化废水。结果表明,厌氧、缺氧和好氧反应器中COD的去除率分别为25%、16%和 59%。Shi等 19 在活性污泥反应器后设置以2,42 DCP降解菌为生物强化菌剂处理生活污水和多氯酚的混和液的反应器
22、,结果表明,2,42 DCP降解菌不仅提高了2,42 DCP的处理效率,同时提高其他多氯酚如42 氯酚、2,4,52 三氯酚的去除率,并改善了系统抗毒性物质冲击负荷能力。在含有难降解化合物的造纸废水 20,21、制药废水 22、染料废水 17 和农药废水 23 生物处理中,应用高效微生物强化,都取得了一定的成效。随着进入水体环境污染物种类增多,很多是结构复杂的化合物或多种化合物的混合物,只有非常专一的菌株或具有特定代谢性能的微生物才能降解。如一些典型的化学污染物包括多环芳烃、卤化有机物、多氯联苯、多硝基芳烃和有机磷等农药和杀虫剂。由于这些物质对微生物有毒害作用,相应具有代谢功能的微生物数量很少
23、,因此这些物质会长期残留在环境中,造成污染。用常规的生物处理方法很难达到理想的效果,生物强化技术成为有效的辅助手段。2.2去除废水中过量营养物由于工农业生产排放大量的无机盐,使水体中氮、磷等营养物含量过高,引起富营养化。而生物法处理这些污染物时,相应的微生物生长缓慢,或维持高浓度微生物的条件控制困难。如生物硝化工艺主要缺点之一是启动时间长、污泥流失或遭受冲击负荷后很难恢复。这些问题主要是由于硝化菌生长速率缓慢,硝化菌产率低 24,因此生物强化技术被广泛引入相应的生物处理系统中。Sat oh等 25研究了硝化菌生物强化对转盘生物膜反应器启动的影响,表明硝化菌强化极大地促进生物膜中硝化菌群的高密度
24、生长,导致快速启动和原位硝化活性的提高。接种的微生物能在生物膜中扩增或繁殖。硝化菌的加入提高了生物膜表面硝化菌的丰度,从而导致硝化速率加快。Head等 26 研究了硝化菌生物强化对低温废水和短固体停留时间反应器脱氮的影响,取得良好的脱氮效果。Belia 等 27 利用纯培养菌株Acinetobacter lw offii对传统活性污泥进行强化,使聚磷菌在微生物中占主导地位,成为强化生物除磷工艺(E BPR)。实验证实,生物强化14 d后能够将传统污水处理厂的活性污泥转化成为EBPR污泥,能适应磷负荷冲击。2.3维持生物系统的稳定性污染物 的 化 学 性 质、浓 度、环 境 的 理 化 特 征(
25、pH、氧化还原电位和温度等)、微生物对污染物的可利用性等多种因素影响微生物的生存及代谢活性 28。生物处理系统易受各种因素的影响导致系统不稳定,甚至系统崩溃。利用生物强化技术,可提高有效微生物浓度,减轻各种外界因素对系统的冲击。Boon等 29研究了32 氯苯胺对活性污泥反应器的冲击、对系统受冲击后氨氮去除效率的恢复、污泥菌群结构和功能的变化,如硝化效果、有机物去除效率和污泥沉降性能等多方面的影响。在非生物强化的反应器中,受 32 氯苯胺 2 d的冲击后,出现氨氮积累,硝化活性在12 d内不能恢复,COD的去除率下降 36%;而生物强化反应器中硝化活性在4 d内恢复,COD的去除效率没有下降。
26、结果表明,接种32氯苯胺降解菌株强化加速了32 氯苯胺的降解,保护硝化菌群,改善反应器受毒害物质冲击后的恢复能力。3结 语尽管生物强化在生物修复中的作用在环境微生物学术界的评价褒贬不一,而且许多成功的实践都仅停留在实验室阶段,但存在对微生物有毒性作用的污染物或缺乏一定数量和质量有效微生物的生物处理系统中,生物强化技术有明显的优势。对现场生态特征有全面理解的基础上,原位生物强化修复技术已成为去除污染物的环境友好技术之一。用特定的有效微生物强化,可提高废水生物处理系统中难降解有机物的降解效率、改善系统脱氮除磷效率、提高系统稳定性等。高效微生物筛选是生物强化技术成功的决定性因素。改进传统高效菌种筛选
27、时以目标污染物的降解为惟一手段,结合微生物的遗传特征、污染物可生物降解性和生物修复速率等多方面因素,可开发出能够维持异常代谢特征或对化学污染物或环境压力具有更好耐受性的高效菌种。通过分析环境微生物菌群的组成和结构,微生物的生态环境、种群结构和数量变化,筛选具有高效降解性能、良好生态适应性、能在目标污染地维持相当持久性和活性的微生34?1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 4 页，共 6 页 -环境工程学报第1卷
28、物菌株作为生物强化接种体,是提高生物强化技术的有效手段。利用基因工程手段构建具有高效降解性能的土著微生物,或直接利用具有代谢性能的可移动基因组分进行强化,可避免与土著微生物竞争资源和空间,是未来生物强化技术的发展方向。分子生物学技术对生物强化技术不仅在构建高效微生物中发挥重大作用,而且是监控、探测、分析高效微生物在新的生态系统中种群结构多样性及变化的有力工具。以 16S rRNA目标寡核苷酸探针的荧光定量杂交(FISH)29,30、变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳(DGGE/TGGE)31等分子生物学手段与微生物生态学相结合,是评价生物强化和生物刺激的有效工具 26,已经成为研究给定环境中微
29、生物菌群行为和生物强化后整个环境生态的重要学科。如何更好地探索目标微生物的降解特征、生态模式,更好地对系统和环境参数的变化做出反应,并能够定性定量地分析微生物与污染物降解的相关性,确定生物强化技术工艺工程设计的关键参数,如何将生物强化技术与微生物刺激、各种微生物固定化技术相结合,提高外源微生物的存活能力和降解活性,这些都是未来生物强化技术研究的方向。参 考 文 献 1 A lves C.F.,M elo L.F.,V ieira M.J.Influence of medi2u m composition on the characteristics of a denitrifyingbio2f
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40、hts reserved.http:/名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 5 页，共 6 页 -第9期王建芳等:生物强化技术及其在废水生物处理中的应用dichl orophenol in a conventional activatedsludge syste mthrough bioaugmentati on.Process B iochem.,2004,39:17011707 20 Yu Z.T.,Mohn W.W.B ioaugmentati on with resin2acid2degrading bacteria enhances resin acid removal
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