《广西涠洲岛3种海参共附生细菌多样性及其延缓衰老活性分析.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《广西涠洲岛3种海参共附生细菌多样性及其延缓衰老活性分析.docx（20页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、广西涸洲岛3种海参共附生细菌多样性及其延缓衰老活性分析银江林李蜜易湘茜刘永宏于清武高程海Fig. 1 Three kinds of sea cucumber collected in Weizhou Island, GuangxiA ：异色哈威参;B：方柱翼手参;C ：玉足海参A：H. versicolor；B：C. quadrangularis ;C：H. leucospilota多种，我国约有140种，主要分布于热带和温带地区(姜健等，2004；李妍等， 2012) o海参富含增强免疫力、抗肿瘤、抗凝血、抗衰老及抗菌等生物活性物 质(张梅秀等，2012),其蕴藏的共附生微生物资源也非常丰富
2、，同样具有极 高的开发利用价值。近年来，已有研究从马来西亚、印度尼西亚、日本等海域 的海参中分离获得种类繁多的共附生微生物，发现潜在新物种，并证实部分菌 株具有抗菌及降解多糖等生物活性(Farouk et al. , 2007；Zhang et al., 2012；Wibowo et al. , 2019) o国内针对海参共附生微生物的研究相对较少， 且主要集中在北方的刺参(Stichopus japonicus)和仿刺参(Apostichopus japoni-cus) o孙奕和陈瞒(1989)从刺参不同部位分离出359株细菌和57株 酵母菌，并证实刺参不同部位的微生物具有不同的生物活性，包
3、括降解褐藻酸 唆内、琼脂、淀粉、几丁质、明胶及酪蛋白等。张文姬等(2011)从大连地区冬 季和春季的仿刺参肠道中分离获得141株菌株，经16s rDNA序列测定和系统发 育进化分析，发现这些菌株分布于假单胞菌属(Pseudomonas)、弧菌属(Vibrio)、芽泡杆菌属(Bacillus)、希瓦氏菌属(Shewanella)及交替假 单胞菌属(Pseudoalteromonas)等10个属。李智等(2018)从福建吊笼养殖 的海参肠道分离出95株菌株，包括31株潜在益生菌、37株潜在致病菌及27 株普通肠道菌，从中筛选获得2株抑菌能力较强的益生菌，并确定其抑菌成分 为环脂肽类化合物。李昌明(
4、2019)从山东威海市的海参肠道内容物中共分离 获得226株菌株，隶属于4门49属102种，优势属为芽泡杆菌属，且有16株 菌株具有褐藻胶降解能力。【本研究切入点】涸洲岛是广西北部湾海域最大的 岛屿，全岛海岸线长26. 43 km,其沿岸海域分布的珊瑚礁是我国珊瑚礁的北缘(王欣和黎广钊，2009；梁文等，2010)。澜洲岛海域分布有异色哈威参(Havelockia versicolor)、玉足海参(Holothuria leucospilota)及方柱 翼手参(Colochirus quadr angular is)等海参，但至今鲜见针对这3种海参共 附生微生物多样性及其活性分析的相关报道。【
5、拟解决的关键问题】分析广西 溜洲岛海域异色哈威参、玉足海参及方柱翼手参的共附生细菌多样性，筛选出 具有延缓衰老活性的菌株，以期为挖掘延缓衰老活性的新化合物提供菌种资 源。1材料与方法1. 1样品采集2018年5月在广西澜洲岛海域采集获得4只海参(图1),经广西中医药大学 刘昕明博士鉴定，分别为2只异色哈威参、1只玉足海参及1只方柱翼手参。 活体海参采集后放入装有适量海水的取样箱，及时送回实验室进行处理。以无 菌水清洗干净海参体表，利用无菌手术剪在超净工作台中对海参进行解剖，剪 取其肠道、胃和表皮组织各2.0 g,分别加入3.0 mL无菌水充分研磨均匀；将 研磨得到的液体转移至无菌EP管中，即为
6、海参样品原液，样品信息如表1所 不。1. 2试验材料野生型秀丽隐杆线虫(N2)、尿喀唬缺陷型大肠杆菌(0P50)由广西科学院汪 斌博士惠赠。ChelexTOO树脂及2XEasy Taq SuperMix购自美国Bio-Rad公 司；PCR 引物(27F： 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3和 1492R： 5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)购自北京全式金生物技术股份有限公司；二甲基亚碉 (DMSO)购自西陇科学股份有限公司；其他有机试剂均为国产分析纯。细菌分离 培养基：M5 (海藻糖一脯氨酸培养基)、M7 (改良ISP5培养基)、M9 (精氨酸 一天冬酰胺培养基）、
7、M10 （葡萄糖一水解酪素培养基）、Mil （棉籽糖一组氨 酸培养基）、P7 （酪氨酸一天冬酰胺培养基）、P3 （燕麦培养基）、AGG （改良 高氏培养基）及2216E培养基；细菌纯化与保藏培养基：改良ISP2固体培养基（酵母提取物2. 0 g,麦芽提取物2. 0 g,葡萄糖2. 0 g,琼脂15. 0 g,海水1000.0 mL）；细菌发酵培养基：改良ISP2液体培养基。主要仪器设备：超净工 作台（苏州安泰空气技术有限公司）、PCR仪（美国Bio-Rad公司）、凝胶成 像系统（美国Bio-Rad公司）、HVETIO高压灭菌锅（日本Hirayama公司）、 体视显微镜（日本Olypus公司）及
8、恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公 司）。1. 3试验方法1. 3. 1细菌分离、纯化与保藏采用梯度稀释法，以无菌水将海参样品原液制 备成10-3和10-4的稀释液，涂布于9种细菌分离培养基上，置于28 C恒温 培养箱中培养37 d；根据菌落颜色、大小及表面是否光滑等形态特征，挑选 形态差异的菌落接种于改良ISP2固体培养基上进行重复划线分离，以获得单一 菌落，记录菌落形态特征。纯化菌株以20% （v/v）甘油保藏于-80 超低温 冰箱内。1. 3. 2细菌分子鉴定参考周双清等（2010）的方法，以Chelex-100法提取 的细菌基因组DNA为模板，以27F和1492R为引物，进行16s r
9、RNA序列扩增。 PCR反应体系25.0 uL： DNA模板1.0 uL,上、下游引物各1.0 uL,2XEasy Taq SuperMix 12.5 uL, ddH20 9. 5 nLo 扩增程序：94 预变性 5 min； 94 30 s, 60 30 s, 72 1 min,进行 34 个循环；72 延伸 10 mine PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至上海美吉生物医药科技 有限公司广州分公司测序；运用DNAStar进行基因序列信息整理，基于EzBioCloud 数据库(https： /www. ezbiocloud. net/)进行序列比对分析。1. 3. 3细菌发酵
10、粗提物制备参考覃媚等(2016)的方法，将分离获得的菌株 接种至装有ISP2液体培养基(300.0 niL)的三角瓶中，28 下摇床(180 r/min)发酵培养7 d,发酵液用等量体积的乙酸乙酯萃取3次，取乙酸乙酯相 经旋转蒸发仪减压浓缩，所得浸膏干燥后即为细菌发酵粗提物。1. 3. 4细菌发酵粗提物延缓衰老活性检测以秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)为模型，通过线虫寿命试验评价细菌发酵粗提物的延缓衰老活性(Lakowski and Hekimi, 1998)。产卵期的线虫以M9缓冲液清洗，无菌离心 后弃上清液，按1 ： 3的比例加入裂解液(5 mol/L NaOH
11、+5% NaClO, 2 ： 1混 匀)，振荡离心收集沉淀;沉淀以M9培养基清洗3次，转移至含0P50的NGM培 养基中，20 培养48 h后即获得L4期线虫。细菌发酵粗提物用1% DMS0配制 成500 Rg/mL的药液，以1% DMS0为空白对照，将L4期线虫挑至添加有50. 0 UL药液的NGM培养基中培养，每组设2个板，每板挑取20条L4期线虫，培 养当天记为0 do隔天对培养线虫的生存及死亡情况进行观察记录，每2 d将 线虫转移至新的含药NGM培养基中，直至线虫全部死亡。试验数据采用SPSS 22. 0进行统计分析。2结果与分析1海参共附生细菌的分离鉴定结果细菌分离纯化后，根据菌落颜
12、色、大小及表面是否光滑等形态特征进行排重， 共获得129株分离菌株，经16s rRNA序列比对分析，最终得到63株菌株，隶属于3门4纲14目25科35属(表2)。在纲分类水平上，放线菌纲(Actinobacteria)有 31 株 17 个属，Y-变形菌纲(Gammaproteobacteria)有13株9个属，a -变形菌纲(Alphaproteobacteria)有7株5个属，芽泡杆 菌纲(Bacilli)有12株5个属。可见，放线菌纲为优势菌群，包含考克菌属(Kocuria) 4 株，链霉菌属(Streptomyces)、诺卡氏菌属(Nocardia)、微 杆菌属(Microbacter
13、ium)和短杆菌属(Brevibacterium)各3株，短状杆菌 属(Brachybacterium)、红球菌属(Rhodococcus)和小单抱菌属(Micromonospora)各2株， 短小杆菌属(Curtobacterium)、分支杆菌属 (Mycobacterium)、假诺卡菌属(Pseudonocardia)、两面神菌属(Janibacter)、壤霉菌属(Agromyces) 糖多抱菌属(Saccharopolyspora)、纤维微菌属(Cellulosimicrobium)、原小单抱菌属 (Promicromonospora)及戈登菌属(Gordonia)各 1 株。根据16S
14、 rRNA序列最高相似性小于98.00%菌株为潜在新物种的归类原则 (Stackebrandt and Ebers, 2006),从广西渊洲岛3种海参样品中分离获得的放线菌GXIMD LM0085和GXIMD LM0159有可能为潜在新种，与对应有效发表 菌株 K. assamensis. K. salsicia 的相似性分别为 97. 38%和 97. 00%。2. 2不同培养基分离的海参共附生细菌分布情况利用9种选择性培养基进行海参共附生细菌分离，结果(图2)发现在属类水 平上存在明显的数量差异。其中，M9培养基分离获得的细菌种属数量最多，共 19属28株;P7培养基分离获得的细菌种属数量
15、最少，仅有6属6株。在分离获 得的17属31株放线菌中，M5培养基获得的放线菌种属数量最多，共9属11 株，分离效果最优;P7培养基分离获得的放线菌种属数量最少，仅得到1株放 线菌。在最终筛选确定的35属细菌中，仅Cobetia和嗜盐单胞菌属(Halomonas)在9种培养基均有生长分布，多达13个属仅在单一的培养基中 生长，其中，纤维微菌属、原小单抱菌属、戈登菌属和糖多泡菌属仅生长于M5 培养基，交替单胞菌属(Alteromonas)、假诺卡菌属、假芽胞杆菌属(Fictibacillus)和动性球菌属(Pianococcus)仅分离自M9培养基，肠杆菌 属(Enterobacter)和短小杆
16、菌属仅分离自Mil培养基，分支杆菌属、Pseudovibrio、微小杆菌属(Exiguobacterium)则分别分离自P3培养基、AGG 培养基和2216E培养基。可见，部分菌属对培养基具有高度的偏好性，采用多 种培养基相结合可筛选获得多样性更丰富的海参共附生细菌。2. 3不同海参共附生细菌多样性分析结果不同海参及其组织样品分离获得的共附生细菌种类和数量也存在明显差异(图 3和图4)。不同海参分离获得的共附生细菌数量排序为1#异色哈威参方柱翼 手参2#异色哈威参玉足海参，不同海参组织样品分离获得的共附生细菌数量 排序则表现为 Hl-2H4-2=H2-lHl-3Hl-lH3-l=H3-2=H4
17、-3H4-lH2-2o 由此 可见，以来自海参胃部的可培养共附生细菌最多，其多样性高于肠道和表皮组 织，2#异色哈威参和玉足海参因个体太小未能获取胃部样品，因此其可培养共 附生细菌多样性低于1#异色哈威参和方柱翼手参。海参体内存在大量共附生放线菌(Wang et al. , 2018)。Wibowo等(2019) 利用Illumina MiSeq分析2只海参共附生细菌多样性时发现，海参内部放线菌 相对丰度分别是体表的3. 6和9. 6倍。本研究结果表明，除了玉足海参外，其 他3只海参体内的共附生放线菌相对丰度也明显高于体表共附生放线菌相对丰 度，其中1#海参体内放线菌相对丰度是体表的5.33倍
18、，2#海参体内放线菌相 对丰度是体表的6. 00倍，方柱翼手参体内放线菌相对丰度是体表的8. 00倍。2. 4海参共附生细菌发酵粗提物延缓衰老活性分析结果将分离到的海参共附生细菌分成2组，进行发酵粗提物延缓衰老活性检测，结 果（图5）显示，有6株菌株的发酵粗提物能显著延长秀丽隐杆线虫寿命（P0. 05）,分别是GXIMD LM0037 （寡养单胞菌属）、GXIMD LM0005 （链霉菌 属）、GXIMD LM0071 （副球菌属）、GXIMD LM0114 （寡养单胞菌属）、GXIMD LM0099 （原小单抱菌属）和GXIMD LM0032 （短状杆菌属），其发酵粗提物培养 的秀丽隐杆线虫
19、寿命分别较空白对照组延长31. 50%、31. 13%, 26.88%、 18. 81%、18. 79%和 18. 50%o3讨论近年来，许多学者通过优化培养基配方以期获得多样性更丰富的可培养微生 物。Zhang等（2012）综合考虑海洋微生物生长环境的pH和盐度，设计出13 种培养基用于分析玉足海参肠道菌群多样性。赵雅慧等（2018）基于原位环境 的营养组成，设计不同营养物质及碳氮源组成的5种培养基，用于对比分析普 通红树和盐碱地红树根际土壤细菌的多样性。本研究选用9种培养基对广西涸 洲岛海参共附生细菌进行分离纯化，结果发现，以M9培养基分离获得的细菌种 属数量最多，分离效果最佳；而M5培养
20、基分离获得的放线菌数量最多，多样性 最丰富，与姜舒等（2020）从真红树中筛选内生放线菌的结果一致。在35个菌 属中，有13个属仅在单一的培养基中生长，说明不同微生物对培养基具有明显 的偏好性，采用多种培养基相结合能满足不同微生物的生长需求，进而提高海 参共附生细菌的筛选效率（Dupont et al. , 2014） o随着宏基因组等高通量测 序技术的发展，研究人员虽然通过免培养技术也能全面了解微生物多样性，但 要深入研究微生物的生理特征、代谢产物及活性等内容，仍需通过可培养法获 得纯培养菌株。因此，开发设计新型培养基、优化培养基配方、改进微生物分 离方法仍是开发利用微生物资源及发掘具有生物
21、活性微生物新物种的重要途 径。本研究利用多种选择性培养基对广西澜洲岛海参共附生细菌进行分离纯化，通 过16s rRNA测序分析，共获得63株共附生细菌，隶属于3门4纲14目25科 35属，以放线菌纲(49.21%)为优势菌群，且发现有2株考克菌属菌株(GXIMD LM0085 和 GXIMD LM0159)为潜在新种。Zhang 等(2012)研究发现, 日本海域海参共附生细菌以放线菌门、变形杆菌门及厚壁菌门为主，其中厚壁 菌门(56.7%)为优势菌门；Wibowo等(2019)对印度尼西亚海域2种海参共附 生细菌进行多样性分析时发现，主要门类为放线菌门、变形杆菌门及厚壁菌 门，以放线菌门(4
22、9. 6%)为优势菌门。优势菌门间的差异可能与海参来源、食 用沉积物及生长阶段有关(成功，2011 ；Gao et al. , 2014；Wang et al., 2018) o海洋放线菌易产出潜在的活性物质，大量存在海洋沉积物中，而海参 主要以生长环境的沉积物为食，其体内及体表共附生大量放线菌，是挖掘新型 活性化合物的重要资源库。此外，本研究以秀丽隐杆线虫为模型探究海参共附生细菌发酵粗提物的延缓衰 老活性，结果发现，有6株菌株的发酵粗提物能显著延长线虫寿命。其中， GXIMD LM0037 (寡养单胞菌属)、GXIMD LM0005 (链霉菌属)发酵粗提物对秀 丽隐杆线虫寿命延长了 31.
23、50%和31. 13%,与100 umol/L白藜芦醇(30. 08%) 及80 mg/L铁皮石斛多糖(30. 54%)对线虫寿命的延长效果相当(王婷婷等， 2015；李海春，2016) ；GXIMD LM0071 (副球菌属)发酵粗提物对秀丽隐杆线虫 寿命延长了 26.88%,略高于100 umol/L牛芽木脂素及25 mg/L桑叶多酚的效 果(Shan and Michael, 2015； Zheng et al. , 2014) ；GXIMD LM0114 (寡养单 胞菌属)、GXIMD LM0099 (原小单抱菌属)及GXIMD LM0032 (短状杆菌属)发 酵粗提物分别延长秀丽隐杆
24、线虫18.81%、18.79%和18.50%的寿命，略低于45 umol/L淫羊薯昔(20. 67%)及20 umol/L淫羊薯次昔II (20. 00%)对线虫寿 命的延长效果(蔡外娇，2012)。但具体是活性菌株发酵粗提物中的何种成分 对秀丽隐杆线虫具有延缓衰老作用，尚有待进一步验证。4结论广西涸洲岛海域海参蕴含着多样性丰富的共附生细菌资源，具有潜在的新物 种，且部分菌株具有延缓衰老活性，在延缓衰老活性物质挖掘及新型抗衰老药 物研发方面具有巨大潜力。Reference：蔡外娇.2012.淫羊薯总黄酮、淫羊着昔、淫羊着次昔n延长健康寿限及其作 用机制的研究上海：复旦大学.Cai W J. 2
25、012. Research on the effect and mechanism of EF, icariin and icariside II in extending healthspanD. Shanghai： Fudan University. _成功.2011.仿刺参体表微生物多样性研究D.大连：大连工业大学.Cheng G. 2011. Study on the diversity of microorganizm carried byApostichopus japonicusD. Dalian： Dalian Polytechnic University.姜健，榻宝灵，邰阳.
26、2004.海参资源及其生物活性物质的研究J.生物技术 通讯，15 (5) ： 537-540. Jiang J, Yang B L, Tai Y. 2004. Studies on resources and bioactive substances of sea cucumberJ. Letters in Biotechnology, 15 (5) ： 537-540. doi： 10.3969/j. issn. 1009- 0002. 2004. 05. 033.姜舒，李蜜，候师师，韩敏敏，银江林，高程海.2020.海南西海岸真红树内 生放线菌多样性及其延缓衰老活性初筛J.广西植物，40
27、(3) ： 327-334.Jiang S, Li M, Hou S S, Han M M, Yin J L, Gao C H. 2020. Diversity and anti-aging activity of endophytic actinobacteria from true mangrove plants collected from the west coast of HainanJ. Guihaia, 40 (3) ： 327-334. doi： 10.11931/guihaia. gxzw201904036.李昌明.2019.海参肠道微生物多样性分析及菌株si2T褐藻胶裂解酶
28、研究D. 济南：山东大学.Li C M. 2019. Analysis of microbial diversity in the intestine of sea cucumber and studies on alginate lyase of strain sl2TD. Jinan： Shandong University. _李海春.2016.八种石斛多糖抗氧化、抗衰老活性的比较研究D.广州：华南 农业大学.Li H C. 2016. Studies on anti-oxidation and anti-aging of polysaccharides from eight Dendr
29、obium speciesD. Guangzhou： South China Agricultural University. _李韦霖，徐睿航，张敬燕，张国庚.2018.海洋微生物活性物质研究进展J. 农村经济与科技，29 (8) ： 46. Li W L, Xu R H, Zhang J Y, Zhang G G.2018. Research development of marine microbial active substancesJ. Rural Economy and Science-Technology, 29 (8) ： 46. 1 doi： 10. 3969/j. iss
30、n. 1007-7103. 2018. 08. 032.李妍，张付云，李云冰，王斌，张瑛.2012.海参及其共附生微生物的生物活 性研究进展J.食品研究与开发，33 (6) ： 223-226. Li Y, Zhang F Y, Li Y B, Wang B, Zhang Y. 2012. Advances in biologocal activity of sea cucumber and symbiotic microorganismJ. Food Research and Development, 33 (6) ： 223-226. doi： 10.3969/j. issn.1005-
31、6521.2012.06. 063.李智，黄晓山，郑宝东，邓凯波.2018.福建海参内源微生物多样性分析及益 生菌抑菌机理初探J.食品工业科技，39 (12) ： 137-141. Li Z, Huang X S, Zheng B D, Deng K B. 2018. Analysis of endogenous microbial diversity of Fujian sea cucumber and probiotic mechanismJ. Scien-ce and Technology of Food Industry, 39 (12) ： 137-141. doi： 10.1338
32、6/j. issnl002-0306. 2018. 12. 025.梁文，黎广钊，范航清，农华琼，王欣.2010.广西涸洲岛珊瑚礁物种生物多 样性研究J.海洋通报，29 (4) ： 412-416. Liang W, Li G Z, Fan H Q, Nong H Q, Wang X. 2010. Study on the species diversity of coral reef on Weizhou Island, GuangxiJ. Marine Science Bulletin, 29 (4) ： 412- 416. doi： 10. 3969/j. issn. 1001-6392
33、. 2010. 04. 010.林韬，李谭，赵育林，张萌，曾馨，龚冬梅.2018.抗衰老药物的研究进展 J.中国临床药理学杂志，34 (20) ： 2486-2488. Lin T, Li T, Zhao Y L, Zhang M, Zeng X, Gong D M. 2018. Research progress of anti-aging drugsJ. The Chinese Journal of Clinical Pharmacology, 34 (20)： 2486-2488. doi： 10.13699/ki.1001-6821. 2018. 20. 025. 缪莉，郑忠辉，苏文金
34、.2002.共附生海洋微生物活性物质的研究进展J.海 洋通报，21 (3) ： 62-68. Miao L, Zheng Z H, Su W J. 2002. Research development of bioactive substance of symbiotic and epibiotic marine microorgani-smsJ. Marine Science Bulletin, 21 (3) ： 62-68. doi： 10. 3969/j. issn. 1001-6392. 2002. 03. 010.孙奕，陈瞒.1989.刺参体内外微生物组成及其生理特性的研究J.海洋与
35、沼 泽，20 (4) ： 300-307. Sun Y, Chen D. 1989. The microbial composition of Stichopus japonicus and its physiological propertyJ. Oceanologia et Limnologia Sinica, 20 (4) ： 300-307.覃媚，于清武，竺利波，李菲，颜栋美，余炼，高程海.2016.三种江营共附 生细菌多样性及抑菌活性分析J.南方农业学报，47 (11) ： 1966-1973.Qin M, Yu Q W, Zhu L B, Li F, Yan D M, Yu L,
36、Gao C H. 2016.Diversity of epiphytic bacteria of three species of gracilaria and their bacteriostatic activitiesJ. Journal of Southern Agriculture, 47 (11) ： 1966-1973. doi： 10. 3969/jissn. 2095-1191. 2016. 11. 1966.王婷婷，张玉瑶，王吉锡，刘洋，陈永春，姜国华.2015.白藜芦醇对秀丽隐 杆线虫寿命的影响及其初步机制研究J.神经药理学报，5 (5) ： 1-6. Wang T T,
37、 Zhang Y Y, Wang J X, Liu Y, Chen Y C, Jiang G H. 2015. Effect of resveratrol on longevity of Caenorhabditis elegans and its potential mechanismJ. Acta Neuropharmacologica, 5 (5) ： 1-6. doi： 10. 3969/j. issn. 2095-1396. 2015. 05. 001. 王欣，黎广钊,2009.北部湾澜洲岛珊瑚礁的研究现状及展望J.广西科学院 学报，25 (1) ： 72-75. Wang X, L
38、i G Z. 2009. The status and prospect of researches on coral reef in Weizhou islandJ. Journal of GuangxiAcademy of Sciences, 25 (1) ： 72-75. doi： 10. 3969/j. issn. 1002-7378. 2009.01.019.游竣驿.2019.海洋微生物药物开发的研究进展J.中国高新科技，(9)： 101-104. You J Y. 2019. Research progress on marine microbial drug developmen
39、tJ. China High-Tech, (9) ： 101-104. doi：10. 13535/j. cnki. 10-1507/n. 2019. 09. 22.张梅秀，王锡昌，刘源.2012.海参生物活性研究进展J.天然产物研究与开 发，24 (8) ： 1151-1159. Zhang M X, Wang X C, Liu Y. 2012. Advances on the research of sea cucumber biological activitiesJ. NaturalProduct Research and Development, 24 (8) ： 1151-1159
40、. doi：10. 3969/j. issn. 1001-6880. 2012. 08. 031.张文姬，侯红漫，张公亮，李琴艳，杜晨萌.2011.仿刺参肠道可培养微生物 多样性研究J.食品工业科技，32 (9) ： 149-151. Zhang W J, Hou H M, Zhang G L, Li Q Y, Du C M. 2011. Study on diversity of intestine cultivable microorganisms from Apostichopus japonicusJ. Scien-ce and Technology of Food Industry,
41、 32 (9) ： 149-151. doi：10.13386/j. issnl002-0306. 2011. 09. 001.赵雅慧，张舒琳，吴家法，黄新静，吴霜，张政，杨立芳，龙寒，襟金彩，姜 明国.2018.山口红树林根际土壤可培养细菌多样性及其活性筛选J.海洋学 报，40 (8) ： 138-151. Zhao Y H, Zhang S L, Wu J F, Huang X J, Wu S, Zhang Z, Yang L F, Long H, Xuan J C, Jiang M G. 2018. Screening the diversity and activity of cult
42、urable bacteria isolated from mangrove rhizosphere soil at ShankouJ. Acta Oceanologica Sinica, 40 (8)： 138-151. doi： 10. 3969/j. issn. 0253-4193. 2018. 08. 014.周双清，黄小龙，黄东益，胡新文，陈吉良.2010. Chelex-100快速提取放线 菌DNA作为PCR扩增模板J.生物技术通报，26 (2) ： 123-125. Zhou S Q, Huang X L, Huang D Y, Hu X W, Chen J L. 2010. A
43、 rapid method for extrac-ting DNA from actinomycetes by Chelex-100J. Biotechnology Bulletin, 26 (2) ： 123-125. doi：10. 13560/j. cnki. biotech, bull. 1985. 2010. 02. 024.Dupont S, Carre-Mlouka A, Domart-Coulon I, Vacelet J, Bourguet- Kondracki M L. 2014. Exploring cultivable bacteria from the prokary
44、otic community associated with the carnivorous sponge Asbestopluma hypogeaJ. FEMS Microbiology Ecology, 88 (1) ： 160-174. doi： 10.1111/1574-6941. 12279.Farouk A E, Hamid Ghouse F A, Ridzwan BH. 2007. New bacterial species isolated from Malaysian sea cucumbers with optimized secreted antibacterial ac
45、tivityJ. American Journal of Biochemistry andBiotechnology, 3 (2) ： 60-65. doi： 10.3844/ajbbsp. 2007. 60. 65.Fenical W. 1993. Chemical studies of marine bacteria： Deve-loping a new resourceJ. Chemical Reviews, 93 (5) ： 1673-1683. doi： 10.1021/cr00021a001.Gao F, Tan J, Sun H L, Yan J P. 2014. Bacteri
46、al diversity of gut content in sea cucumber (Apostichopus japonicus) and its habitat surface sedimentJ. Journal of Ocean University of China, 13： 303- 310. doi： 10. 1007/sll802-014-2078-7.Jensen P R, Jenkins K M, Porter D, Fenical W. 1998. Evidence that a new antibiotic flavone glycoside chemically
47、defends the sea grass Thalassia testudinum against Zoosporic fungiJ. Applied and Environmental Microbiology, 64 (4) ： 1490-1496. doi： 10. 1128/AEM. 64. 4. 1490-1496. 1998.Lakowski B, Hekimi S. 1998. The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegansJ. Proceedings of the National Academy o
48、f Sciences of the United States of America, 95 (22) ： 13091-13096. doi： 10. 1073/pnas. 95. 22. 13091.Shan S, Michael W. 2015. Natural lignans from Arctium lappa as antiaging agents in Caenorhabditis elegansJ. Phytochemistry, 117： 340-350. doi： 10. 1016/j. phytochem. 2015. 06. 021.Stackebrandt E, Ebers J. 2006. Taxonomic parameters revisi-ted：Tarnished gold standardsJ. Microbiology Today, 8 (4) ： 6-9.Wang Q, Zhang X M, Chen M Y, Li W T, Zhang P D. 2018. Comparison of intestinal microbiota and activities of digestive and immune-related enzymes of sea cucumber Apostichopus ja