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1、第一页，讲稿共三十七页哦第二页，讲稿共三十七页哦第三页，讲稿共三十七页哦l暗视野显微镜l相差显微镜l荧光显微镜第四页，讲稿共三十七页哦l根据丁达尔效应原理设计的一种在黑色背景条件下观察被检物体的显微镜l观察到明场看不到的极其微小的物体l最高分辨率可达0.004微米第五页，讲稿共三十七页哦1.1 原理 丁达尔现象：在日常生活中，室内飞扬的微粒灰尘是不易被看见的，但在暗的房间中若有一束光线从门缝斜射进来，灰尘便粒粒可见了，这就是微粒发光。暗视野显微镜就是利用微粒发光原理设计的。1.2 结构特点 使用中央遮光板或暗视野聚光器（常用的是抛物面聚光器），使光源的中央光束被阻挡。不能由下而上地通过标本进入
2、物镜。从而使光线改变途径，倾斜地照射在观察的标本上，标本遇光发生反射或散射，散射的光线投入物镜内，因而整个视野是黑暗的。第六页，讲稿共三十七页哦第七页，讲稿共三十七页哦第八页，讲稿共三十七页哦1.3成像特点及优缺点 在暗视野中所观察到的是被检物体的衍射光图像，并非物体本身，所以只能看到物体的存在和运动，不能辨清物体的细微结构。但被检物体为非均质时，并大于12波长，则各级衍射光线同时进入物镜，在某种程度上可观察物体的构造。一般暗视野显微镜虽看不清物体的细微结构，但却可分辨0.004um以上的微粒的存在和运动，这是普通显微镜(最大的分辨力为0.2um)所不具有的特性，可用以观察活细胞的结构和细胞内
3、微粒的运动等。第九页，讲稿共三十七页哦1.4 1.4 应用：应用：微小粒子、细菌形态、细菌记数，透明标本观察等。1.5 暗场显微镜的要求l要求载玻片和盖玻片必须无疵痕和灰尘l物镜前透镜必须清洁无尘l载玻片和盖玻片厚度必须绝对符合要求第十页，讲稿共三十七页哦1.6暗场观察方式调节(1)换上暗场聚光镜（干燥系或油浸系）并在聚光镜透镜上表面滴上镜头油。向上缓慢调升聚光镜，使镜头油与载玻片底面相接触后。(2)将视场光阑适当缩小，用10X物镜找到被检物体，同时在视场中看到视场光圈的轮廓象。上下缓慢调整聚光镜，使视场光圈像清晰可见。(3)视场光圈如不在视野中央，可利用聚光镜外侧两个调节螺丝进行调整，再将其
4、开大到相应位置。第十一页，讲稿共三十七页哦一、原理l 荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650入或紫蓝光4200入)作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。l荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。第十二页，讲稿共三十七页哦l 什么是荧光：物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温
5、度辐射光冷光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。l显微镜荧光利用光源激发光化荧光第十三页，讲稿共三十七页哦l荧光的种类：自发荧光（固有荧光）二次荧光第十四页，讲稿共三十七页哦l荧光的性质：吸收光，必需有激发光源 荧光波长激发波长（损失热能）荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的衰减 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率第十五页，讲稿共三十七页哦二、荧光显微镜的种类：透射式 落射式第十六页，讲稿共三十七页哦第十七页，讲稿共三十七页哦第十八页，讲稿共三十七页哦 透射式透射式l汞灯光源汞灯光源l激发滤色镜激发滤色镜l吸收滤色镜吸收滤色镜l暗场聚光镜暗场聚光镜 落射式落射式l汞灯光源汞灯
6、光源l激发滤色镜激发滤色镜l分色镜分色镜l吸收滤色镜吸收滤色镜第十九页，讲稿共三十七页哦荧光显微镜内部构造第二十页，讲稿共三十七页哦落射荧光显微镜光路图落射荧光显微镜光路图第二十一页，讲稿共三十七页哦透射荧光显微镜光路图透射荧光显微镜光路图第二十二页，讲稿共三十七页哦 WUWU WIBWIBDUALDUAL BAND BANDWIBAWIBAWIGWIGWIBWIB双重染色标本的单色和双色观察双重染色标本的单色和双色观察第二十三页，讲稿共三十七页哦l荧光光源荧光光源 一般采用超高压汞灯一般采用超高压汞灯(50(50一一200200W)W)，它可发它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生
7、最强荧出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫外、光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。l每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。荧光具有专一性，一般照射波长更长的可见荧光。荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断滤
8、光片。它的作用有二：一是吸收和阻面需加阻断滤光片。它的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免干扰荧光和损伤眼睛。二挡激发光进入目镜、以免干扰荧光和损伤眼睛。二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。彩。两种滤光片必须选择配合使用。第二十四页，讲稿共三十七页哦四、使用方法四、使用方法 1 1打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能达到最亮点。打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能达到最亮点。2 2透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所要透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所要求的激发滤片，在物镜的后面装上相应
9、的阻断滤片。求的激发滤片，在物镜的后面装上相应的阻断滤片。落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片双色束分离器阻断滤片的插块。的激发滤片双色束分离器阻断滤片的插块。3 3放置标本片，调焦后即可观察。放置标本片，调焦后即可观察。使用中应注意：末使用中应注意：末装滤光片不要用眼直接观察，以免引起眼的损伤；装滤光片不要用眼直接观察，以免引起眼的损伤；第二十五页，讲稿共三十七页哦 4 4高压汞灯关闭后不能立即重新打开，高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需经需经5 5分钟后才能再启动，否则会不稳定，分钟后才能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。影响汞灯
10、寿命。第二十六页，讲稿共三十七页哦五、用途五、用途 1 1 观察标本中的自发荧光物质或以荧光素染色或标记的细观察标本中的自发荧光物质或以荧光素染色或标记的细胞和结构胞和结构 2 2 标本中的荧光物质在紫外线激发下产生各种颜色的标本中的荧光物质在紫外线激发下产生各种颜色的荧光，借以研究该荧光物质在细胞和组织内的分布。荧光，借以研究该荧光物质在细胞和组织内的分布。组织中的自发性荧光物质如神经细胞和心肌细胞等内组织中的自发性荧光物质如神经细胞和心肌细胞等内的脂褐素呈棕黄色荧光，肝贮脂细胞和视网膜色素上的脂褐素呈棕黄色荧光，肝贮脂细胞和视网膜色素上皮细胞内的维生素皮细胞内的维生素A A呈绿色荧光，某些
11、神经内分泌细呈绿色荧光，某些神经内分泌细胞和神经纤维内的单胺类物质（儿茶酚胺、胞和神经纤维内的单胺类物质（儿茶酚胺、5 5羟色羟色胺、组胺等）在甲醛作用下呈不同颜色的荧光，组胺、组胺等）在甲醛作用下呈不同颜色的荧光，组织内含有的奎宁、四环素等药物也呈现一定的荧光。织内含有的奎宁、四环素等药物也呈现一定的荧光。第二十七页，讲稿共三十七页哦 3 3 细胞内的某些成分可与荧光素结合而显细胞内的某些成分可与荧光素结合而显荧光，如溴化乙锭与吖啶橙可与荧光，如溴化乙锭与吖啶橙可与DNADNA综合，综合，进行细胞内进行细胞内DNADNA含量测定。含量测定。4 4 荧光显微镜更广泛用于免疫细胞化学研荧光显微镜
12、更广泛用于免疫细胞化学研究，即以异硫氰酸或罗丹明等荧光素标究，即以异硫氰酸或罗丹明等荧光素标记抗体（一抗或二抗），用该标记抗体记抗体（一抗或二抗），用该标记抗体直接或间接地与细胞内的相应抗原结合，直接或间接地与细胞内的相应抗原结合，以检测该抗原的存在与分布。以检测该抗原的存在与分布。第二十八页，讲稿共三十七页哦三、试剂与器材三、试剂与器材鱼、草履虫、甲醇、鱼、草履虫、甲醇、5 丫啶橙、滤纸、吸管、载玻片、荧光显微丫啶橙、滤纸、吸管、载玻片、荧光显微镜、暗视野显微镜、普通光学显微镜镜、暗视野显微镜、普通光学显微镜第二十九页，讲稿共三十七页哦四、实验内容和实验步骤四、实验内容和实验步骤l鱼血细胞染
13、色观察：取少许鱼血鱼血细胞染色观察：取少许鱼血 常规血涂片常规血涂片 凉干凉干 甲醇固定甲醇固定10 min 5 丫啶橙染色丫啶橙染色5 min 水洗水洗 室温干燥（滤纸擦干玻片室温干燥（滤纸擦干玻片底面）底面）荧光显微镜观察（先低倍后高倍观察）荧光显微镜观察（先低倍后高倍观察）（可在同一玻片上（可在同一玻片上观察未荧光染色的血细胞）观察未荧光染色的血细胞）l取洋葱取洋葱撕取一小片内表皮撕取一小片内表皮平面单层铺展于玻片上平面单层铺展于玻片上室温凉干室温凉干1丫啶橙染色丫啶橙染色5min 水洗（用吸管，小心掉片）水洗（用吸管，小心掉片）室温干燥（或室温干燥（或用滤纸擦干）用滤纸擦干）荧光显微镜
14、观察荧光显微镜观察第三十页，讲稿共三十七页哦3.1 3.1 原理原理l光波有振幅（亮度）、波长（颜色）及相位光波有振幅（亮度）、波长（颜色）及相位(指在某一时指在某一时间上光的波动所能达到的位置间上光的波动所能达到的位置)的不同。的不同。l当光通过物体时，如波长和振幅发生变化，人们的眼睛才当光通过物体时，如波长和振幅发生变化，人们的眼睛才能观察到，这就是普通显微镜下能够观察到染色标本的道能观察到，这就是普通显微镜下能够观察到染色标本的道理。而活细胞和未经染色的生物标本，因细胞各部微细结理。而活细胞和未经染色的生物标本，因细胞各部微细结构的折射率和厚度略有不同，光波通过时，波长和振幅并构的折射率
15、和厚度略有不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位有变化不发生变化，仅相位有变化(相应发生的差异即相位差相应发生的差异即相位差)，而这种微小的变化，人眼是无法加以鉴别的，故在普通显而这种微小的变化，人眼是无法加以鉴别的，故在普通显微镜下难以观察到。微镜下难以观察到。第三十一页，讲稿共三十七页哦l相差显微镜能够改变直射光或衍射光的相位，并且利用相差显微镜能够改变直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉现象，把相位差变成振幅差光的衍射和干涉现象，把相位差变成振幅差(明暗差明暗差)，同时它还吸收部分直射光线，以增大其明暗的反差。因同时它还吸收部分直射光线，以增大其明暗的反差。因此可用以观
16、察活细胞或未染色标本。此可用以观察活细胞或未染色标本。3.23.2结构特点结构特点 l相差显微镜与普通显微镜的主要不同之处是：用相差显微镜与普通显微镜的主要不同之处是：用环状光阑代替可变光阑，用带相位板的物镜环状光阑代替可变光阑，用带相位板的物镜(通常通常标有标有PHPH的标记的标记)代替普通物镜，并带有一个合轴调代替普通物镜，并带有一个合轴调节用的望远镜。节用的望远镜。l环状光阑是由大小不同的环状孔形成的光阑，它们环状光阑是由大小不同的环状孔形成的光阑，它们的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的。的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的。第三十二页，讲稿共三十七页哦l相位板安装在物镜的后焦面处，相板装
17、有吸收光相位板安装在物镜的后焦面处，相板装有吸收光线的吸收膜和推迟相位的相位膜。它除能推迟直线的吸收膜和推迟相位的相位膜。它除能推迟直射光线或衍射光的相位以外，还有吸收光使亮度射光线或衍射光的相位以外，还有吸收光使亮度发生变化的作用。发生变化的作用。l调轴望远镜是用来进行合轴调节的。相差显微镜在调轴望远镜是用来进行合轴调节的。相差显微镜在使用时，聚光镜下面环状光阑的中心与物镜光轴要使用时，聚光镜下面环状光阑的中心与物镜光轴要完全在一直线上，必需调节光阑的亮环和相板的环完全在一直线上，必需调节光阑的亮环和相板的环状圈重合（共轭重合），才能发挥相差显微镜的效状圈重合（共轭重合），才能发挥相差显微镜
18、的效能。否则直射光或衍射光的光路紊乱，应被吸收的能。否则直射光或衍射光的光路紊乱，应被吸收的光不能吸收，该推迟相位的光波不能推迟，就失去光不能吸收，该推迟相位的光波不能推迟，就失去了相差显微镜的作用。了相差显微镜的作用。第三十三页，讲稿共三十七页哦3.3使用方法使用方法（1 1）相差装置的调换安装）相差装置的调换安装 卸下普通显微镜使用的聚光器，将环状光阑装在聚光卸下普通显微镜使用的聚光器，将环状光阑装在聚光器支架上，把绿色滤光片放在上面，它可吸收红色和蓝器支架上，把绿色滤光片放在上面，它可吸收红色和蓝色光，使波长范围小的单色光线进行照明，并有吸热作色光，使波长范围小的单色光线进行照明，并有吸
19、热作用，能使相差观察获得良好的效果。再从转换器上旋下用，能使相差观察获得良好的效果。再从转换器上旋下普通物镜，换上相差物镜。普通物镜，换上相差物镜。（2 2）调焦）调焦 打开光源，旋转集光器转盘，将打开光源，旋转集光器转盘，将“0 0”对准标示孔，使对准标示孔，使普通聚光器部分进入光路。先使用低倍相差物镜，按普普通聚光器部分进入光路。先使用低倍相差物镜，按普通显微镜操作方法进行对光和调焦。通显微镜操作方法进行对光和调焦。旋转环状光阑，使旋转环状光阑，使光阑的直径和孔宽与所使用的相差物镜相适应，如相差光阑的直径和孔宽与所使用的相差物镜相适应，如相差物镜为物镜为4040X X时应用时应用40X40
20、X标示孔的光阑。标示孔的光阑。第三十四页，讲稿共三十七页哦（3 3）合铀调整）合铀调整 拔出目镜，插入合轴望远镜，一边从望远镜向拔出目镜，插入合轴望远镜，一边从望远镜向内观察，并用左手固定其外筒；一边用右手转动内观察，并用左手固定其外筒；一边用右手转动望远镜内筒使其上升，当对准焦点就能看到环状望远镜内筒使其上升，当对准焦点就能看到环状光阑的亮环和相板的暗环，此时可将望远镜固定光阑的亮环和相板的暗环，此时可将望远镜固定住。再升降集光器并调节其下的螺旋使亮环的大住。再升降集光器并调节其下的螺旋使亮环的大小与暗环一致，然后左右前后调节环状光阑聚光小与暗环一致，然后左右前后调节环状光阑聚光器上的调节钮
21、，使两环完全重合。器上的调节钮，使两环完全重合。（4 4）观察）观察 换回目镜，按常规要领进行观察。在更换不同换回目镜，按常规要领进行观察。在更换不同倍率的相差物镜时，每一次都要使用相匹配的环倍率的相差物镜时，每一次都要使用相匹配的环状光阑。状光阑。第三十五页，讲稿共三十七页哦3.43.4用途用途 用于观察组织培养中活细胞形态结构。用于观察组织培养中活细胞形态结构。活细胞无色透明，一般光镜下不易分辨活细胞无色透明，一般光镜下不易分辨细胞轮廓及其结构，组织培养研究常用细胞轮廓及其结构，组织培养研究常用的是倒置相差显微镜。的是倒置相差显微镜。第三十六页，讲稿共三十七页哦l为什么说倒置、相差显微镜是观察培养为什么说倒置、相差显微镜是观察培养活细胞的最有效显微镜活细胞的最有效显微镜?l荧光显微镜的两种滤光片各起什么作用荧光显微镜的两种滤光片各起什么作用?第三十七页，讲稿共三十七页哦