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1、抗原抗体反应实验现在学习的是第1页，共25页抗原抗体反应抗原抗体反应antigen-antibody reactionantigen-antibody reactionn概念概念n基本原理基本原理n特点特点n影响因素影响因素n应用范围应用范围现在学习的是第2页，共25页一一.概概 念念n抗原和抗体的特异性结合反应抗原和抗体的特异性结合反应 体内体内 产生保护效应产生保护效应 造成病理损伤造成病理损伤 体外体外 多种表现形式多种表现形式:凝集凝集,沉淀沉淀,补体结合补体结合,中和等中和等.现在学习的是第3页，共25页二二.基本原理基本原理n抗原和抗体分子结构抗原和抗体分子结构及立体构型的互补及立
2、体构型的互补 n抗原抗原-抗体结合力抗体结合力 疏水作用疏水作用,氢键氢键,范德华引力范德华引力,静电静电吸引作用吸引作用现在学习的是第4页，共25页4 types of noncovalent forces现在学习的是第5页，共25页三三.特特 点点n特异性和交叉反应特异性和交叉反应n可逆性可逆性 一定条件下（低一定条件下（低pHpH、高浓度盐、冻融等高浓度盐、冻融等）抗原抗原-抗体可被解离抗体可被解离n最适比例最适比例 反应体系中抗原反应体系中抗原/抗体最适比例抗体最适比例 决定反应结果的关键因素决定反应结果的关键因素现在学习的是第6页，共25页四四.影响因素影响因素(一一)反应物自身因素
3、反应物自身因素 1.1.抗体抗体 *来源来源 *特异性与亲和力特异性与亲和力 *浓度浓度 2.2.抗原抗原 *理化性质、表位多寡和种类理化性质、表位多寡和种类现在学习的是第7页，共25页(二二)环境条件环境条件 1.1.电解质电解质 不可缺少不可缺少 2.2.酸碱度酸碱度 pH 6-8pH 6-8 3.3.温度温度 15-40 15-40 c c 4.4.时间时间 规定时间规定时间现在学习的是第8页，共25页五五.应用范围应用范围n用已知抗原检测未知抗体用已知抗原检测未知抗体n用已知抗体检测未知抗原用已知抗体检测未知抗原n大分子物质大分子物质n药物、激素和炎性介质等各种半药物、激素和炎性介质等
4、各种半抗原物质抗原物质现在学习的是第9页，共25页 抗原抗体反应的基本类型抗原抗体反应的基本类型 1.Precipitation-2.Agglutination-3.Radioimmunoassay 4.Enzyme-linked Immunosorbent Assay 5.Immunofluorescence 6.Western Blotting 7.Flow Cytometry and Fluorescence 8.Immunoelectron Microscopy现在学习的是第10页，共25页沉淀反应沉淀反应（Precipitation）可溶性抗原抗体可溶性抗原抗体 沉淀沉淀 凝集反应凝
5、集反应（Agglutination）颗粒性抗原抗体颗粒性抗原抗体 凝集凝集本次实验涉及的抗原抗体反应本次实验涉及的抗原抗体反应现在学习的是第11页，共25页沉淀反应分类沉淀反应分类:Precipitation in fluids（液相沉淀）液相沉淀）Precipitation in gels （琼脂扩散）琼脂扩散）-radial immunodiffusion （单相扩散）-double immunodiffusion （双相扩散）Gel Immunoelectrophoresis （凝胶免疫电泳）凝胶免疫电泳）-rocket immunoelectrophoresis （火箭电泳）现在学习的
6、是第12页，共25页免疫沉淀反应免疫沉淀反应(precipitation)precipitation)原理原理 可溶性抗原可溶性抗原+抗体抗体 白色沉淀白色沉淀内容内容 单向定量免疫电泳单向定量免疫电泳(火箭电泳火箭电泳)琼脂糖双向免疫扩散琼脂糖双向免疫扩散现在学习的是第13页，共25页单向定量免疫电泳单向定量免疫电泳(火箭电泳火箭电泳)实验原理：实验原理：n将抗体混入琼脂内将抗体混入琼脂内;n将待测样品（抗原）加入琼脂一端的加样孔中，进行电将待测样品（抗原）加入琼脂一端的加样孔中，进行电泳泳;n抗原在电泳时与抗体反应，比例合适时形成锥形沉淀峰（抗原在电泳时与抗体反应，比例合适时形成锥形沉淀峰
7、（形如火箭）形如火箭）,峰高与抗原含量成正比峰高与抗原含量成正比;n以标准抗原的浓度为横坐标，峰高为纵坐标，绘制标准以标准抗原的浓度为横坐标，峰高为纵坐标，绘制标准曲线，即可根据峰高从标准曲线中得出待测样品中的抗曲线，即可根据峰高从标准曲线中得出待测样品中的抗原含量。原含量。现在学习的是第14页，共25页 *实验流程实验流程 抗体抗体+琼脂琼脂琼脂板琼脂板 打孔数个打孔数个(孔与板缘距离孔与板缘距离1 1cm)cm)加入样品加入样品(由低浓度到高浓度由低浓度到高浓度)电泳电泳现在学习的是第15页，共25页实验内容：抗原抗体反应实验内容：抗原抗体反应 1.火箭电泳火箭电泳 2.琼脂糖双向扩散试验
8、琼脂糖双向扩散试验 3.凝集试验凝集试验(凝血试验凝血试验)现在学习的是第16页，共25页实验步骤实验步骤1.1.取熔化并冷却至取熔化并冷却至5050c c的的1%1%琼脂糖凝胶，加入琼脂糖凝胶，加入 anti-IgGanti-IgG抗抗体，混匀后浇至玻璃板上。体，混匀后浇至玻璃板上。2.2.凝固后，如下图打孔。凝固后，如下图打孔。3.3.第第1-1-5 5孔加入孔加入10 10 l l经倍比稀释的标准血清样品经倍比稀释的标准血清样品 1 1:32:32，1 1:16:16，1 1:8:8，1 1:4:4，1:21:2。第。第6 6孔加入待测血清。孔加入待测血清。4.4.将琼脂板放入电泳槽，用
9、滤纸与电泳槽搭桥连接，将琼脂板放入电泳槽，用滤纸与电泳槽搭桥连接，样品孔一端接负极。电泳样品孔一端接负极。电泳80v,2-3h.80v,2-3h.（-）（+）现在学习的是第17页，共25页1：4 1：81：161：3250ul 稀释液稀释液50ul 1:2 血清血清50ul50ul倍比稀释：倍比稀释：现在学习的是第18页，共25页实验步骤实验步骤5.5.取出琼脂板，在取出琼脂板，在0.5%0.5%考马斯亮蓝中染色，考马斯亮蓝中染色，6%6%醋醋酸脱色。酸脱色。6.6.从加样孔的圆心到峰尖量取各孔样品沉淀峰的高从加样孔的圆心到峰尖量取各孔样品沉淀峰的高度。以抗原浓度为横坐标度。以抗原浓度为横坐标
10、,峰高为纵坐标绘制标准峰高为纵坐标绘制标准曲线。根据标准曲线，计算待测样品中抗原的含量曲线。根据标准曲线，计算待测样品中抗原的含量。现在学习的是第19页，共25页Rocket eletrophoresis现在学习的是第20页，共25页现在学习的是第21页，共25页琼脂糖双向免疫扩散琼脂糖双向免疫扩散*实验原理：实验原理：在含有电解质的琼脂中打在含有电解质的琼脂中打孔，分别加入抗原及抗体，两者互相向孔，分别加入抗原及抗体，两者互相向对方孔扩散，当比例合适时即形成弧形对方孔扩散，当比例合适时即形成弧形沉淀线。沉淀线的数目、位置、形状等沉淀线。沉淀线的数目、位置、形状等，与抗原或抗体的纯度、浓度、扩
11、散速，与抗原或抗体的纯度、浓度、扩散速度等有关。度等有关。现在学习的是第22页，共25页*实验流程：实验流程：铺制琼脂糖凝胶板铺制琼脂糖凝胶板 打孔打孔(梅花型梅花型)中心孔内加抗中心孔内加抗IgGIgG血清血清,其余加倍比稀释待检血清其余加倍比稀释待检血清 湿盒内湿盒内3737 c c温育温育2424h h现在学习的是第23页，共25页Double Immunodifusion现在学习的是第24页，共25页实验步骤实验步骤1.1.将已溶化的将已溶化的1%1%生理盐水琼脂糖生理盐水琼脂糖3434mlml倾注在玻片上制成厚薄均匀的凝胶板倾注在玻片上制成厚薄均匀的凝胶板。待凝固后，打梅花孔（如下图
12、）。待凝固后，打梅花孔（如下图）。2.2.在中心孔内用加样器加入在中心孔内用加样器加入1010 l anti-IgGl anti-IgG血清（抗体）。血清（抗体）。3.3.在第在第1515孔内分别加入孔内分别加入10 10 l l 经系列倍比稀释经系列倍比稀释-1-1：3232，1 1：16 16，1 1：8,18,1：4 4，1 1：2 2的待测血清样品（抗原），的待测血清样品（抗原），在第在第6 6孔内加孔内加入生理盐水对照。入生理盐水对照。4.4.将凝胶板放湿盒中，将凝胶板放湿盒中，3737 c,24hc,24h后后观察结果，以出现沉淀线的最高稀释度为观察结果，以出现沉淀线的最高稀释度为该待测血清该待测血清IgGIgG的效价。的效价。现在学习的是第25页，共25页