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1、关于基因组文库的构建第一页，讲稿共二十四页哦 对于高等真核生物而言，基因组对于高等真核生物而言，基因组DNADNA十分十分庞大庞大,基因可达数万个，且基因组成结构基因可达数万个，且基因组成结构复杂，除编码序列，还有非编码序列及复杂，除编码序列，还有非编码序列及调控序列，基因间还存在大量的间隔序调控序列，基因间还存在大量的间隔序列和重复序列，因此，单个目的基因在列和重复序列，因此，单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，除整个基因组中所占的比例极其微小，除少数例外，绝大多数基因难以直接分离少数例外，绝大多数基因难以直接分离得到。得到。第二页，讲稿共二十四页哦 为了解决这个难题，一种可行的方
2、法就为了解决这个难题，一种可行的方法就是将这个基因扩增，增加成功分离目的是将这个基因扩增，增加成功分离目的基因的可能性。但是由于要分离的目的基因的可能性。但是由于要分离的目的基因往往是未知基因，因此无法对它进基因往往是未知基因，因此无法对它进行特异性扩增，只能构建该生物材料的行特异性扩增，只能构建该生物材料的基因文库，然后再根据不同的方法将所基因文库，然后再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来，最后分离得到目的需的克隆筛选出来，最后分离得到目的基因。基因。第三页，讲稿共二十四页哦基因组文库基因组文库(Genomic library)：是指将某种生物体的全部基因组是指将某种生物体的全部基因组DNA
3、用限制性内用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落，这个群体就称为该生物胞获得的所有阳性菌落，这个群体就称为该生物基因组文库。其目基因组文库。其目 的是分离有用的目的基因的是分离有用的目的基因 和保和保存某种生物的全部基因。存某种生物的全部基因。第四页，讲稿共二十四页哦第一节 基因组基因组DNADNA文库的构建文库的构建一、基因组一、基因组DNA文库的类型文库的类型 根据所选用的载体可以分为：根据所选用的载体可以分为：质粒文库、噬菌体文
4、库、粘粒文库、质粒文库、噬菌体文库、粘粒文库、人工染色体文库（细菌人工染色体文库、人工染色体文库（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库）。酵母人工染色体文库）。第五页，讲稿共二十四页哦二、基因组二、基因组DNA文库的质量标准文库的质量标准一个理想的基因组一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域
5、，以利克隆排序克隆片段易于从载体分子上完整卸下克隆片段易于从载体分子上完整卸下重组克隆能稳定保存、扩增、筛选重组克隆能稳定保存、扩增、筛选第六页，讲稿共二十四页哦三、基因组三、基因组DNADNA文库构建的程序文库构建的程序 载体载体DNADNA的制备；的制备；高纯度大相对分子质量基因组高纯度大相对分子质量基因组DNADNA的提的提取和大片段的制备；取和大片段的制备；高纯度大相对分子质量基因组高纯度大相对分子质量基因组DNADNA的部的部分酶切与脉冲电泳分级分离；分酶切与脉冲电泳分级分离；载体与外源片段的连接与转化或侵染载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；宿主细胞；重组克隆的挑选和保存。重
6、组克隆的挑选和保存。第七页，讲稿共二十四页哦基因组DNA文库限制性内切酶限制性内切酶基因组DNA基因重组转化细菌体外包装第八页，讲稿共二十四页哦四、生物基因组DNA文库的构建（一）生物基因组（一）生物基因组DNA的提取的提取 染色体染色体DNA 第九页，讲稿共二十四页哦（二）基因组（二）基因组DNA的不完全酶切的不完全酶切1、根据实验需要选择合适的限制性内切酶、根据实验需要选择合适的限制性内切酶 a)四个识别位点的限制酶出现的几率四个识别位点的限制酶出现的几率:1/256 b)六个识别位点的限制酶出现的几率六个识别位点的限制酶出现的几率:1/10242、分离目的酶切片段大小的确定、分离目的酶切
7、片段大小的确定 a)克隆单个基因：克隆单个基因：10 kb b)克隆基因族：克隆基因族：20kb3、DNA不完全酶切条件的确定不完全酶切条件的确定 a)确定限制酶用量，改变酶切时间确定限制酶用量，改变酶切时间 b)固定酶切时间，改变限制酶的用量固定酶切时间，改变限制酶的用量第十页，讲稿共二十四页哦DNA的不完全酶切的不完全酶切第十一页，讲稿共二十四页哦（三）酶切片段与克隆载体连接（三）酶切片段与克隆载体连接、酶切片段的分离与纯化、酶切片段的分离与纯化）低熔点琼脂糖回收目的片段）低熔点琼脂糖回收目的片段）试剂盒回收目的片段）试剂盒回收目的片段第十二页，讲稿共二十四页哦2、酶切片段与克隆载体连接克
8、隆载体的选择、酶切片段与克隆载体连接克隆载体的选择 a）质粒载体可承载）质粒载体可承载15kb DNA左右片段左右片段(有效的范围有效的范围为为10kb)b）载体可承载载体可承载25kb DNA左右片段左右片段(有效的范围为有效的范围为15 kb)c）Cosmid 载体可承载载体可承载45kb DNA左右片段左右片段(有效的有效的范围为范围为40 kb)第十三页，讲稿共二十四页哦（四）重组转化受体细胞（四）重组转化受体细胞、根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞、根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞常见的宿主细胞：DH5:用于铺制与培养质粒平板和粘粒平板的重组缺陷型的抑制型菌株，可与pUC编码的
9、半乳糖苷酶氨基端实现互补。HB101:用于大规模制备质粒的抑制型菌株，转化效率高JM101:可支持带有琥珀突变载体生长的宿主菌JM109:支持带有琥珀突变载体生长的重组缺陷的抑制型菌MZ-1:温度敏感的溶源性菌株，用于含有噬菌体启动子质粒载体的宿主菌第十四页，讲稿共二十四页哦、重组质粒转化受体细胞、重组质粒转化受体细胞1）转化法）转化法(transformation)(transformation)2 2）转导法）转导法(transduction)(transduction)3 3）转染法）转染法(transfection)(transfection)第十五页，讲稿共二十四页哦（五）基因组（五
10、）基因组DNA文库克隆子的保存与筛选文库克隆子的保存与筛选 1、基因组基因组DNA文库的保存文库的保存 1)影印膜滤保存法影印膜滤保存法第十六页，讲稿共二十四页哦2）文库在液体培养基中扩增保存）文库在液体培养基中扩增保存方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆 子转入含适当的抗生素培养基中，混子转入含适当的抗生素培养基中，混 合的细菌生长数代后，其培养物于合的细菌生长数代后，其培养物于-70 oC储存（加终浓度为储存（加终浓度为25%的甘油）。的甘油）。缺点：因文库菌落生长的不均匀性而导致缺点：因文库菌落生长的不均匀性而导致 文库中某些特定的序列过多或过少。文库
11、中某些特定的序列过多或过少。第十七页，讲稿共二十四页哦3)保存单个克隆子于含有甘油的培养基中保存单个克隆子于含有甘油的培养基中方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合 适的含抗生素的培养基中，菌体生适的含抗生素的培养基中，菌体生 长到一定浓度后，加入终浓度为长到一定浓度后，加入终浓度为25%的甘油，于的甘油，于-70 oC或或-25 oC下保存。下保存。缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大第十八页，讲稿共二十四页哦2、基因组文库的筛选、基因组文库的筛选 分子杂交法：利用分子探针对文库进行分子杂交法：利用分子探针对文库进行筛选筛
12、选 PCR筛选法：根据保守序列合成引物，筛选法：根据保守序列合成引物，扩增特异性片段扩增特异性片段第十九页，讲稿共二十四页哦 基因文库的筛选与鉴定第二十页，讲稿共二十四页哦PCRPCR筛选法筛选法 利用合适的引物，以从初选出来的阳性利用合适的引物，以从初选出来的阳性克隆中提出的质粒为模板进行克隆中提出的质粒为模板进行PCRPCR，通过对，通过对PCRPCR产物的电泳分析，确定目的基因是否产物的电泳分析，确定目的基因是否插入到载体中。插入到载体中。第二十一页，讲稿共二十四页哦第二十二页，讲稿共二十四页哦 菌落原位杂交法菌落原位杂交法 （colony in situ hybridizationcolony in situ hybridization）第二十三页，讲稿共二十四页哦感谢大家观看感谢大家观看第二十四页，讲稿共二十四页哦