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1、哺乳动物组织基因组提取哺乳动物组织基因组提取2022-9-61第一页，讲稿共三十四页哦一、一、实验目的实验目的(Experimental Purpose)After the experiment is finished,students should be able to extract genomic DNA from mammal tissue,and to run an agarose gel.1.1.掌握动物基因组掌握动物基因组DNADNA提取的操作方法。提取的操作方法。2.2.掌握琼脂糖凝胶电泳的操作的方法。掌握琼脂糖凝胶电泳的操作的方法。2022-9-62第二页，讲稿共三十四页哦二
2、、二、实验原理实验原理(Experimental Principle)lThe detergents SDS(sodium dodecyl sulfate)is added to denature proteins and solubilize lipids in membranes leading to cell lysis.The cell lysate is often treated with enzymes that hydrolyze RNA and proteins.本实验利用去垢剂SDS(十二烷基磺酸钠)是为了使蛋白变性并溶解细胞膜中的脂质从而导致细胞裂解，而细胞裂解物又常用蛋
3、白酶K进行水解处理。2022-9-63第三页，讲稿共三十四页哦真核生物染真核生物染色体色体DNADNA组组装不同层次装不同层次的结构的结构2022-9-64第四页，讲稿共三十四页哦lThen they are treated with phenol and chloroform to remove the remaining proteins,which will either enter the organic phase or,if they had denatured,appear at the interphase.Alcohol help to concentrate the DNA
4、 while removing nucleotides,amino acids,oligonucleotides and peptides.随后用酚氯仿进行抽提，以去除残留的蛋白质，这时蛋白质将进入有机相，或者假如己变性的话将呈现在有机相与水相之间。乙醇沉淀处理则可以浓缩DNA，同时去除核苷酸、氨基酸以及低分子量的寡核苷酸和肽。2022-9-65第五页，讲稿共三十四页哦lWe can add the eathylene diamine tetraacetic acid(EDTA)to keep the integrity of DNA.EDTA can chelate M g2+a n d r
5、 e d u c e deoxyribonuclease(DNase)activity,because these enzymes require Mg2+to work.为了进一步保护为了进一步保护DNA样品样品的完整性，通常需要在缓冲液中的完整性，通常需要在缓冲液中添加乙二胺四乙酸添加乙二胺四乙酸(EDTA)以整以整合合Mg2+，这样将会减少脱氧核糖，这样将会减少脱氧核糖核酸酶核酸酶(DNase)的活性，因为该的活性，因为该酶必须在有酶必须在有Mg2+存在时才会起存在时才会起作用。作用。2022-9-66第六页，讲稿共三十四页哦 本实验方法分离得到的染色体本实验方法分离得到的染色体DNA长
6、度为长度为100-150kb，适用于构建基因组文库和，适用于构建基因组文库和Southern杂交分析。杂交分析。如果要求得到较大分子量的如果要求得到较大分子量的DNA，则必须省略其中的振，则必须省略其中的振荡步骤。荡步骤。2022-9-67第七页，讲稿共三十四页哦核酸的分离纯化、测定及研核酸的分离纯化、测定及研究方法究方法一、一、分离核酸的一般原则分离核酸的一般原则 因为遗传信息全部贮存在核因为遗传信息全部贮存在核酸的一级结构中，故完整的一级结酸的一级结构中，故完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基构是保证核酸结构与功能研究的基础。础。2022-9-68第八页，讲稿共三十四页哦（一）核酸的
7、分离和纯化时应遵循两个原则（一）核酸的分离和纯化时应遵循两个原则 保证核酸一级结构的完整性；保证核酸一级结构的完整性；排除其它分子的污染。排除其它分子的污染。（二）核酸的纯度要求（二）核酸的纯度要求 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；属离子；其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；排除其它核酸分子的污染，如提取排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时，应去除分子时，应去除RNA，反，反之亦然之亦然。2022-9-69第九页，
8、讲稿共三十四页哦（三）核酸分离纯化的注意事项（三）核酸分离纯化的注意事项l为保证分离核酸的完整性和纯度，在实验中应注意：为保证分离核酸的完整性和纯度，在实验中应注意：l 尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；l 减少化学物质对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操减少化学物质对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在作多在pH4pH41010条件下进行；条件下进行；l 防止核酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶水解核酸链中的磷酸二酯键，直防止核酸的生物降解。细
9、胞内或外来的各种核酸酶水解核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。其中接破坏核酸的一级结构。其中DNADNA酶需要金属二价阳离子酶需要金属二价阳离子MgMg2+2+，CaCa2+2+的激活，因此使用的激活，因此使用金属离子螯合剂，如金属离子螯合剂，如EDTAEDTA或柠檬酸盐等基本上可以抑制或柠檬酸盐等基本上可以抑制DNADNA酶的活性。而酶的活性。而RNARNA酶不但酶不但分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，所以生物降解是分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，所以生物降解是RNARNA提提取过程中的主要危害因素；取过程中的主要危害因素；l 减少物理因素
10、对核酸的降解，物理降解因素主要是减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。机械剪切力，其次是高温。2022-9-610第十页，讲稿共三十四页哦高温：高温：如长时间煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温如长时间煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的某些化合键也有破坏作用。核酸提取本身对核酸分子中的某些化合键也有破坏作用。核酸提取过程中常规操作温度为过程中常规操作温度为0 044以降低核酸酶的活性从而减少以降低核酸酶的活性从而减少对核酸的生物降解。对核酸的生物降解。机械剪切力：机械剪切力：包括强力高速的溶液振荡、搅拌，细包括强力高速的溶液振荡、搅拌，细胞突然置于
11、低渗液中；细胞爆炸式地破裂及胞突然置于低渗液中；细胞爆炸式地破裂及DNADNA样品的反样品的反复冻融等。这些操作细节在实验操作中应加倍注意。机械剪切复冻融等。这些操作细节在实验操作中应加倍注意。机械剪切作用的主要危害对象是大分子量的线性作用的主要危害对象是大分子量的线性DNADNA分子，如真核细胞分子，如真核细胞的染色体的染色体DNADNA等等。2022-9-611第十一页，讲稿共三十四页哦二、核酸分离纯化的一般步骤二、核酸分离纯化的一般步骤l破碎细胞破碎细胞去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子沉淀沉淀核酸核酸去除盐类、有机溶剂等杂质去除盐类、有机溶剂等杂质纯化
12、干燥纯化干燥溶解。溶解。l核酸提取方案，应根据具体生物材料和待提取核酸分子核酸提取方案，应根据具体生物材料和待提取核酸分子的特点而定。对于某特定细胞器中富集的核酸分子，采的特点而定。对于某特定细胞器中富集的核酸分子，采用先提取细胞器后再提取目的核酸分子的方案，可获得用先提取细胞器后再提取目的核酸分子的方案，可获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。2022-9-612第十二页，讲稿共三十四页哦三、试剂与器材三、试剂与器材(Reagents and apparatus).Instruments High speed refrigerated centrif
13、uge（高速冷冻离心机）、Glass homogenizer（玻璃匀浆器）、Electrophoresis System（电泳系统）、Ultraviolet transilluminator（紫外透射仪）、Ultra cold storage freezer（超低温冰箱）、Autoclave（高压灭菌锅）、Pipettes（微量加样器）、Electronic balance（电子天平）、Acidometer（酸度计）2022-9-613第十三页，讲稿共三十四页哦.Material Liver of rabbite2022-9-614第十四页，讲稿共三十四页哦.ReagentsTris、SDS、
14、EDTA、HCl、NaOH、Sodium acetate(NaAc)、Acetic acid(HAc)、Phenol、Chloroform、Ethanol、Isoamylol、TE buffer、Protease K、RNase A、Agarose、DNA molecular weight markers、Boric acid、Sugar、Bromophenol blue、Fluorescent dye(Gelview)2022-9-615第十五页，讲稿共三十四页哦1.5 mol1.5 molL NaCl L NaCl 2.1 mol2.1 molL TrisL Tris HCl pH8.0H
15、Cl pH8.03.0.5 mol3.0.5 molL EDTA pH8.0 L EDTA pH8.0 4.dddH4.dddH2 2O O 5.3 mol5.3 molL NaAc pH5.2 L NaAc pH5.2 6.6.生理盐水（生理盐水（0.850.85 NaClNaCl）7 7.10.10SDS SDS 8.58.5TBE TBE 9.10mg9.10mgmLmL蛋白酶蛋白酶K-20K-20保存保存 10.10mg10.10mgmLmL无无DNADNA酶的酶的RNARNA酶酶 -20-20保存保存11.611.6凝胶加样缓冲液凝胶加样缓冲液（一）（一）储备液的制备储备液的制备四、
16、实验步骤(Experimental Procedures)2022-9-616第十六页，讲稿共三十四页哦四、实验步骤四、实验步骤(Experimental Procedures)冰浴处理生理盐水冰浴处理生理盐水 玻璃匀浆器玻璃匀浆器 冰冷的生理盐水清洗（冰冷的生理盐水清洗（3次）次）配制工作液配制工作液 称取称取0.2g肝脏肝脏 剪碎剪碎 组织匀浆液组织匀浆液 酶解液酶解液2ml2ml匀浆液匀浆液 组织细胞液组织细胞液 玻璃匀浆器匀浆玻璃匀浆器匀浆 移至移至1.5ml离心管离心管 5000r5000rmin30min3060s 60s 加加400ul 400ul 吹散吹散 加加400ul400
17、ul 离心离心 无菌水无菌水 酶解液酶解液 水浴处理（水浴处理（55、1218h）（二）破碎、酶解细胞（过夜）4弃上清 2022-9-617第十七页，讲稿共三十四页哦四、实验步骤四、实验步骤(Experimental Procedures)等量分装在两支离心管内等量分装在两支离心管内 加入加入20ul20ul的的RNase RNase 加入等体积提取液加入等体积提取液(翻转混匀翻转混匀)4 10min 4 10min酶解样品酶解样品 待抽提的样品待抽提的样品 抽提抽提 静置静置 离心离心 配制配制 TETE缓冲液缓冲液 加等体积加等体积提取液提取液500ul500ul10000r10000rm
18、inmin离心离心10min 10min 4 10min4 10min 移出水相移出水相 至离心管至离心管 抽提抽提 静置静置 10000r10000rminmin离心离心10min 10min 加加1/10 1/10 加加2 2倍倍 放入放入离心离心 移出水相移出水相 NaAcNaAc 无水乙醇无水乙醇 -20 1-2h 12000r-20 1-2h 12000rminmin离心离心15min 15min 加入加入超低温冰箱超低温冰箱 融化、离心融化、离心 弃上清液弃上清液 洗涤洗涤 12000r12000rminmin离心离心15min 15min 干燥干燥 混匀混匀75%75%冷乙醇冷乙
19、醇 离心离心 弃上清液弃上清液 加加TE50ulTE50ul （三）抽提DNA、乙醇沉淀纯化DNA37 水浴1h2022-9-618第十八页，讲稿共三十四页哦四、实验步骤四、实验步骤(Experimental Procedures)Agarose Gel Electrophoresis：Preparation of the gel 制备制备0.3琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 Loading DNA samples DNA samples 16l+Loading buffer4l Gel 电压电压120V Gel photography（四）、琼脂糖凝胶电泳检测DNA2022-9-619第十九页，讲稿共
20、三十四页哦1.制备制备 0.3 琼脂糖凝胶。称取琼脂糖凝胶。称取 0.06 g 琼脂糖，放人锥形瓶中，加入琼脂糖，放人锥形瓶中，加入 20 mL的的 0.5TBE 缓冲液缓冲液，放入微波炉加热至完全溶化，则为，放入微波炉加热至完全溶化，则为 0.3 琼脂糖琼脂糖凝胶液。（凝胶液。（由于蒸发作用，溶解前在容量瓶上作一个记号，溶解后用三蒸水补由于蒸发作用，溶解前在容量瓶上作一个记号，溶解后用三蒸水补足足）2.制胶器的安装。制胶器的安装。3.GelviewGelview4.将冷到将冷到60左右，缓缓倒入制胶器左右，缓缓倒入制胶器(注意不要形成气泡注意不要形成气泡)。5.待胶凝固后（待胶凝固后（80m
21、in），轻轻拔掉梳子，将凝胶盘从制胶槽中取出，放入），轻轻拔掉梳子，将凝胶盘从制胶槽中取出，放入电泳槽内。电泳槽内。6.加入电泳缓冲液加入电泳缓冲液(0.5)至电泳槽中。至电泳槽中。2022-9-620第二十页，讲稿共三十四页哦5 5TBETBE（电泳缓冲液）（电泳缓冲液）100mL100mLl5.4gTris，l2.75g硼酸，硼酸，l2mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0)l加蒸馏水到加蒸馏水到100mllpH8.00.5TBE2022-9-621第二十一页，讲稿共三十四页哦6 6上样缓冲液上样缓冲液l0 02525溴酚蓝：取溴酚蓝：取60ml60ml三蒸水，将三蒸水，将250mg
22、250mg溴酚溴酚蓝溶解于其中蓝溶解于其中l4040(W(WV)V)蔗糖水溶液：在上述溶液中加蔗糖水溶液：在上述溶液中加入入40g40g蔗糖蔗糖2022-9-622第二十二页，讲稿共三十四页哦 Illuminate the gel with UV light and then take pictures.By comparing product bands with bands from the known molecular-weight markers,you should be able to identify any product fragments which are of the
23、 appropriate molecular weight.通过紫外透射仪检测凝胶，然后获取图片。并将产物条带与已知分子量的标淮条带进行比较，便可以对合适分子量大小的产物进行鉴定。2022-9-623第二十三页，讲稿共三十四页哦五、实验结果五、实验结果(experimental results)2022-9-624第二十四页，讲稿共三十四页哦l哺乳动物基因组哺乳动物基因组DNA的提取的提取 （综合性实验报告）（综合性实验报告）六、实验报告六、实验报告2022-9-625第二十五页，讲稿共三十四页哦溶液溶液的配制的配制摩尔质量的计算摩尔质量的计算:质量质量(g)分子量分子量 5 mol5 mol
24、L NaCl L NaCl 分子量分子量58.4458.44 x58.44(1)5mol/L氯化钠（氯化钠（NaClNaCl）：）：溶解溶解14.6g14.6g氯化钠于足量的水中，定容至氯化钠于足量的水中，定容至50ml50ml。0.05(L)5（mol/L）x 14.61（g）体积(L)摩尔体积（mol/L）2022-9-626第二十六页，讲稿共三十四页哦(2)0.5mol/L(2)0.5mol/L乙二胺四乙酸（乙二胺四乙酸（EDTAEDTA）:配制等摩尔的配制等摩尔的NaNa2 2EDTAEDTA和和NaOHNaOH溶液（溶液（0.5mol/L0.5mol/L），混合），混合后形成后形成E
25、DTAEDTA的三钠盐。或称取的三钠盐。或称取9.31g9.31g的的NaNa2 2EDTA2HEDTA2H2 2O O和和1g1g的的NaOHNaOH，pHpH调至调至8.08.0，并溶于约，并溶于约40ml40ml水中，定容至水中，定容至50ml 50ml。（3)3mol/L3)3mol/L乙酸钠（乙酸钠（NaAcNaAc）：）：溶解溶解20.4g20.4g的三水乙酸钠于约的三水乙酸钠于约40ml40ml水中，用冰乙酸调溶液水中，用冰乙酸调溶液的的pHpH至至5.25.2，再加水定容到，再加水定容到50ml 50ml。2022-9-627第二十七页，讲稿共三十四页哦(4)10(4)10十二
26、烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDS）：）：称取称取5gSDS5gSDS慢慢转移到约含慢慢转移到约含40ml40ml的水的烧杯中，用磁力搅拌器搅的水的烧杯中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。用水定容至拌直至完全溶解。用水定容至50ml 50ml。(5)40%(5)40%氢氧化钠（氢氧化钠（NaOHNaOH）：）：溶解溶解40g40g氢氧化钠颗粒于约氢氧化钠颗粒于约90ml90ml水的烧杯中（磁力搅拌器搅水的烧杯中（磁力搅拌器搅拌），氢氧化钠完全溶解后用水定容至拌），氢氧化钠完全溶解后用水定容至100ml 100ml。(6)1mol/L(6)1mol/L盐酸（盐酸（HClHCl）：）：加加8.
27、6ml8.6ml的浓盐酸至的浓盐酸至91.4ml91.4ml的水中。的水中。2022-9-628第二十八页，讲稿共三十四页哦(7)20mg/ml(7)20mg/ml蛋白酶蛋白酶K K（proteinase Kproteinase K）：）：将将200mg200mg的蛋白酶的蛋白酶k k加入到加入到9.5ml9.5ml水中，轻轻摇动，直至蛋水中，轻轻摇动，直至蛋白酶白酶K K完全溶解。不要涡旋混合。加水定容到完全溶解。不要涡旋混合。加水定容到10ml10ml，然后分，然后分装成小份贮存于装成小份贮存于-20-20。(8)10mg/mlRnase(8)10mg/mlRnase（无（无DNaseDN
28、ase）（）（DNaseDNasefree RNasefree RNase）：）：溶解溶解10mg10mg的胰蛋白的胰蛋白RNARNA酶于酶于1ml1ml的的10mmol/L10mmol/L的乙酸钠水溶液的乙酸钠水溶液中（中（pH 5.0pH 5.0）。溶解后于水浴中煮沸）。溶解后于水浴中煮沸15min15min，使，使DNADNA酶失酶失活。用活。用1mol/L1mol/L的的TrisTrisHClHCl调调pHpH至至7.57.5，于，于-20-20贮存。（贮存。（配制过程中要戴手套）配制过程中要戴手套）2022-9-629第二十九页，讲稿共三十四页哦(9)(9)1 mol1 molL L
29、 TrisTris缓冲液（缓冲液（TrisTrisHCl bufferHCl buffer）将将121g121g的的TrisTris碱溶解于约碱溶解于约0.9L0.9L水中，再根据所要求的水中，再根据所要求的pHpH（2525下下）加一定量的浓盐酸（）加一定量的浓盐酸（11.6N11.6N），用水调整终体积至），用水调整终体积至1L1L。浓盐酸的体积（ml）pH148.62128.53846566671.376 9.08.88.68.48.28.07.87.67.47.2 2022-9-630第三十页，讲稿共三十四页哦(10)5(10)5TBETBE（电泳缓冲液）（电泳缓冲液）100mL100
30、mLl5.4gTris5.4gTris，l2.75g2.75g硼酸，硼酸，l2mL 0.5mol2mL 0.5molL EDTA(pH8.0)L EDTA(pH8.0)l加蒸馏水到加蒸馏水到100mL 100mL pH8.0pH8.0(11)6上样缓冲液 0.25溴酚蓝：取60ml双蒸水，将250mg溴酚蓝溶解于其中 40(WV)蔗糖水溶液：在上述溶液中加入40g蔗糖2022-9-631第三十一页，讲稿共三十四页哦（1212）组织匀浆液）组织匀浆液 （装入（装入10ml10ml离心管中）离心管中）10ml10ml l100mmol100mmolL NaClL NaCl：0.2ml0.2ml（5
31、M NaCl5M NaCl）l25 mmol25 mmolL EDTA(pH8.0)L EDTA(pH8.0)：0.5ml0.5ml（0.5M 0.5M EDTA pH8.0)EDTA pH8.0)ll0mmoll0mmolL TrisL Tris HCIpH 8.0)HCIpH 8.0)：0.1ml0.1ml（1M 1M TrisTris HCIpH 8.0)HCIpH 8.0)l加三蒸水加三蒸水:9.2ml:9.2ml计算方法：5 molL NaCl 100mmolL 5 molL x 0.1molL 10ml 0.2ml 2022-9-632第三十二页，讲稿共三十四页哦（1313）酶解液
32、（装入酶解液（装入1.5ml1.5ml离心管中）离心管中）1ml1mll200mmol200mmolL NaClL NaCl：0.04ml0.04ml （5M NaCl5M NaCl）l50mmol50mmolL EDTA(pH 8.0)L EDTA(pH 8.0)：0.1ml0.1ml （0.5M EDTA 0.5M EDTA pH8.0)pH8.0)l20mmol20mmolL TrisL TrisHCl(pH 8.0)HCl(pH 8.0)：0.02ml0.02ml（1M 1M TrisTris HCIpH 8.0)HCIpH 8.0)l1 1SDSSDS：0.5ml0.5ml（2 2
33、SDSSDS）l200g200gmLmL蛋白酶蛋白酶K K：0.02ml0.02ml（10mg10mgmLmL）l加三蒸水加三蒸水:0.32ml0.32ml2022-9-633第三十三页，讲稿共三十四页哦 （1414）提取液）提取液1 1 ：平衡酚：平衡酚(pH8.0)(pH8.0)：氯仿：异戊醇：氯仿：异戊醇 （2525：2424：1 1）即配即用即配即用 每管加每管加500ul500ul 平衡酚平衡酚(pH8.0)(pH8.0)：250ul250ul 氯仿：氯仿：240ul240ul 异戊醇：异戊醇：10ul10ul（15）提取液2 ：氯仿：异戊醇（24：1）即配即用即配即用 每支试管加每支试管加 500 ul500 ul 氯仿：氯仿：480ul480ul 异戊醇：异戊醇：20ul20ul2022-9-634第三十四页，讲稿共三十四页哦