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1、通络救脑口服液对模型大鼠和的影响|豨红通络口服液 (1齐齐哈尔医学院医药科学探讨所，黑龙江齐齐哈尔161042；2北京中医药高校基础医学院，北京100029) 摘要：目的：探讨大鼠大脑海马立体定向注射淀粉样蛋白140对Bax和Bcl2mRNA表达的影响及通络救脑口服液对其干预作用。方法：140只SpragueDawley(SD)大鼠随机分为空白比照组、假手术组、阴性对 照纽、阳性比照组、试验组(12、24、48mgkg-1d-1)共7组。采纳大脑海马立体定向注射淀粉样蛋白140诱导Alzheimers病动物模型后，药物干预4周，第5周应用实时定量PCR法检测Bax和Bcl-2mRNA表达。结果
2、：与假手术组比较。模型组Bax2-Ct明显上升，而Bcl-22-Ct明显降低，差异具有统计学意义(P005)，表明模型组Bax mRNA表达上调，而Bd-2 mRNA表达下调。与模型组比较，盐酸多萘哌齐组、通络救脑口服液各剂量组Bax2-Ct显著降低。表明Bax mRNA表达下调；而盐酸多萘哌齐组、通络救脑口服液各剂量组Bcl-22-Ct显著上升，表明Bcl-2 mRNA表达上调。结论：大脑海马注射淀粉样蛋白140后大鼠海马组织Bax mRNA表达水平明显增高，Bcl2表达明显降低，而通络救脑口服液可以抑制海马组织Bax mRNA的表达和促进Bcl2 mRNA表达，从而发挥其抗老年性痴呆神经细
3、胞凋亡的作用。 关键词：细胞凋亡；阿尔茨海默氏病；通络救脑口服液；实时荧光定量PCR 中图分类号：R-33文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2007)050926-03 阿尔兹海默病(Alzheimers disease，AD)是老年人常见的一种神经系统疾病，AD的病理表现主要为神经元丢失、神经元纤维缠结和老年斑。细胞凋亡不仅为机体维持正常生理所必需，而且与很多疾病的发生亲密相关，它与老年性痴呆的关系越来越受到人们的重视。有探讨表明AD早期就出现突触和神经元的大量丢失，中期AD病人内嗅区皮质中神经元丢失已达50。这些探讨已证明在疾病早期阶段，神经元已出现普遍的损伤，而且好像在疾病全
4、程中都存在，表明脑中神经元丢失的机制可能是凋亡。淀粉样蛋白可诱导培育神经细胞凋亡，但使神经元易于发生凋亡的细胞学和分子原理还不清晰，为此，笔者采纳海马立体定向注射技术，视察AP对AD模型大鼠脑组织Bcl2和Bax mRNA表达的影响及通络救脑口服液(TLJN Oral Solution)的干预作用。 1材料 1.1试验药物通络救脑口服液，由北京中医药高校中药学院制备。盐酸多奈哌齐片由法国PFIZER PGM公司制造，产品批号5136903。A1-4为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。A1-4运用前用无菌生理盐水稀释成10gL-1，37孵育1周，使其变为聚集状态的A。 1.2试验动物健康雄性清洁
5、级SD大鼠140只购于北京维通利华试验动物技术有限公司，许可证编号SCXK(京)2002-0003，鼠龄812周，体重(280lO)g，经适应性饲养1周，完全随机分为7组：空白比照组、假手术比照组、阴性比照组、阳性比照组和3个剂量试验组，每组20只。 1.3试剂SYBRExScriptTMRT-PCR kit(Perfect RealTime)为TAKARA公司产品，RNAiso Reagent为TAKARA公司产品，DEPC为瑞兴化学产品。 1.4仪器ABl7300荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品，2700型PCR System扩增仪为Applied Biosystems公司产品。 2方
6、法 2.1动物模型的制作试验大鼠1戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉后，立体定位仪固定头部，备皮消毒，沿颅顶中线作2cm切口，分别骨膜使头骨暴露，于前囟向后3.0mm，中线左右各旁开2.2mm，用牙科钻打开颅骨，垂直进微量进样器针2.8mm，将1L溶液缓慢注入，注射时间为5mm，留针5min，阴性比照组、阳性比照组、各剂量试验组左右侧海马各注射1L A1-40(10g)溶液，假手术比照组注射1L生理盐水。 2.2给药方法造模后3天起先给药，依据人和动物按体表面积折算的等效剂量。阳性比照组按0.33mgkg-1d-1，每日1次灌胃，各试验组按分别12、24、48mgkg-1d-1给药，其余3组给等
7、体积生理盐水，共4周。行为学测试结束后处死取材。 2.3荧光实时定量PCR检测大鼠大脑海马组织Bax和Bd-2 mRNA表达抽提总RNA按RNAiso Reagent操作说明书提取大鼠右侧海马组织总RNA，紫外分析及电泳检测总RNA的纯度、浓度及完整性。 Bcl-2引物序列：forward，5-TGAACCGGCATCTG-CACAC-3；reverse，5-CGTCTTCAGAGACAGCCAGGAG-3。 Bax引物序列：forward，5-AGACACCTGAGCTGAC-CTTGGAG-3；reverse，5-GTTGAAGTTGCCATCAG-CAAACA-3。 GAPDH引物序列：
8、forward，5-GACAACTITG-GCATCGTGGA-3；reverse，5-ATGCAGGGATGATGT-TCTGG-3。 逆转录反应：逆转录反应在2700型PCR System扩增仪上按SYBRExScriptTMRT-PCR Kit反转录反应试剂盒操作方法操作，反应条件如下：反转录反应42 15min，反转录酶失活反应952min。 PCR反应PCR反应：采纳SYBR Premix Ex Taq(PerfectReal Time)kit试剂，在ABI 7300荧光定量PCR仪(美国ABI公司)上进行PCR反应，设置检测文件，反应条件如下：第一步是预变性，95，10s(1个循环
9、)。其次步是PCR反应，95，5s；60，31s(40个循环)。反应结束后，运用Sequence Detection software version 1.2.3软件(Applied Bio-systems公司)分析PCR过程个检测样本的CT(Thresholdcycle)值，CT值随模板浓度增大而削减。 2.4统计学方法全部计量资料用均数标准差(xs) 表示，统计分析采纳完全随机设计资料的方差分析，组间两两比较运用SNK检验。 3结果 3.1产物鉴定各产物的熔解曲线仅有1个峰，说明为单一片段扩增，熔解温度分别为GAPDH 86.9，Bax 86.5，Bcl-2为84.1。扩增产物经2琼脂糖电
10、泳，紫外线下扫描分析，GAPDH为120150bp，Bax为190210bp，Bcl-2为110130bp。符合设计的片断长度。 3.2扩增效率分析将一只大鼠大脑海马的RNA反转录成eDNA并以2倍梯度稀释，相对浓度为1、0.5、0.25、0.125，以其为实时PCR扩增模板，试验中各个标准均做2个复孔。另加3个无模板的阴性比照，全部计算采纳每个样本所得的平均循环数值，且样本复孔的Ct值之间差异小于1个循环。以GAPDH、Bax和Bcl-2的Ct值与对应的相对浓度对数值作图，GAPDH、Bax和Bcl-2对应的直线相关系数为0.9986、0.9962和0.9937，斜率为-33186、-3.3
11、551和-3.2455，扩增效率依据E=10(-1/alope)计算，EGAPDH为2.0014，EBax为1.9863，EBcl-2为2.0329。结果表明GAPDH、Bax和Bcl-2扩增效率一样，2-ct相对定量方法适合于本试验。 3.3大鼠海马注射AB1-40后Bax mRNA表达的改变及加通络救脑口服液的干预作用分别扩增GAPGH和Bax，每样本作2复孔，得到两组Ct平均值。通过2-ct计算Bax相对mRNA表达水平，CTintervention=CTinterventionBax-CTinterventionGAPDH，CTblank=CTbalankGAPDH，CT=CTinte
12、rvention-CTbalank，Bax mRNA表达差别倍数以2-CT表示。 结果显示：空白组、阴性比照组、假手术比照组、阳性比照组、各剂量试验组(12、24、48mgkg-1d-1)Ct值分别为28.300.08、25.840.10、27.470.14、26.530.06、26.510.14,26.970.18,27.400.12，；假手术比照组、阴性比照组、阳性比照组、各剂量试验组(12、24、48mgkg-1d-1)2-CT值为1.790.13,4.170.38、3.370.37、2.520.68、1.890.38、1.580.22。模型组Bax2-CT显著多于假手术组(P0.05)
13、，表明模型组Bax mRNA表达上调；与模型组比较，盐酸多萘哌齐组、通络救脑口服液各剂量组2-CT显著削减，表明Bax mRNA表达下调。各组大鼠海马组织Bax mRNA表达水平比较(n=5,xs) 3.4大鼠海马注射AB1-40后Bcl-2 mRNA表达的改变及加通络救脑口服液的干预作用2-CT计算方法同3.3。结果显示：空白组、阴性比照组、假手术比照组、阳性比照组、各剂量试验组(12、24、48mgkg-1d-1)Ct值分别为19.420.14、22.790.11、20.570.08、22.340.14、22.340.10、21.620.12、21.180.09；假手术比照组、阴性比照组、
14、阳性比照组、各剂量试验组(12、24、48mgkg-1d-1)2-CT值为0.520.097、0.120.019、0.140.033、0.160.028、0.290.038、0.310.046。模型组Bd-2 2-Ct显著多于假手术组(P0.05)，表明模型组Bcl-2 mRNA表达上调；与模型组比较，盐酸多萘哌齐组、通络救脑口服液各剂量组2-CT显著削减，表明Bcl-2mRNA表达下调。 4探讨 随着人类社会的老龄化进展，AD患病率有渐渐增高的趋势，严峻影响患者的日常生活质量。探讨资料表明，作为一种退行性中枢神经系统疾病，在AD发病过程中，细胞凋亡起主导作用。脑神经元对凋亡损伤极其敏感，A8
15、是凋亡过程的诱导因素之一。凋亡可能是AD脑中神经元死亡的机制之一。 细胞凋亡的详细机制涉及一系列基因的困难调控。在不同细胞的凋亡调整也存在差异。细胞内与凋亡有关的基因分两类，诱导凋亡基因和抑制凋亡基因。在神经细胞凋亡中Bcl-2家族是不行缺少的，Bcl-2是重要的抗凋亡基因，在细胞色素C的释放调控中起重要作用。Bcl-2与Bax是一对相互拮抗的蛋白质，它们形成二聚体，拮抗对方 功能，Bcl-2具有明显抑制凋亡作用，而Bax则促进凋亡。Bax和Bcl-2形成复合体而失去作用。由此可见，损伤刺激后，Bax和Bcl2表达的比率在很大程度影响凋亡的产生。本试验通过立体定向海马部位注射AB1-40的方法
16、，诱导AD大鼠模型，以通络救脑口服液进行药物干预，从凋亡相关基因Bax和Bcl-2 mRNA表达方面视察了其对-AP诱导的试验性AD模型大鼠的影响。结果，Ap1-40 海马注射诱导大鼠脑组织Bd-2 mRNA表达降低，而Bax mRNA表达上升，两者与空白比照组比较，差异具有统计学意义，推想可能是机体对抗损伤的一种爱护性代偿机制。通络救脑口服液组Bcl-2 mRNA表达较模型组增高，而Bax mRNA表达降低，并呈剂量依靠性，表明通络救脑口服液治疗后，大鼠的抗细胞凋亡基因表达上调。Bax/Bcl-2组成一个平衡体系，Bax过剩细胞凋亡加速。Bcl-2过多则细胞凋亡被抑制。因此，笔者推想通络救脑口服液抑制Ap神经毒性的机制可能为抑制Bax的表达，促进Bcl-2的表达，肯定程度上调整Bax/Bcl-2之间的平衡而可能抑制细胞的凋亡，削减了神经元的丢失，从而发挥抗老年性痴呆的作用。 注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。