《食品毒理学》实验指导.docx

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1、食品毒理学实验指导实验一半衰期的测定比色法测定水杨酸钠的血浆半衰期实验二血液红细胞、白细胞计数实验三四氯化碳对肝脏谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）的影响实验*所需实验仪器：电子天平、pH计（试纸）、显微镜、分光光度计、灌胃针头、（小）/ （大）离心机、注射器。实验一半衰期的测定比色法测定水杨酸钠的血浆半衰期一、原理、目的药物血浆半衰期ti/2即血浆药物浓度下降一半所需的时间。绝大多数药物是按一级动力学规律消除(恒 比消除)，因此每种药物都有固定的不因血浆浓度高低而改变。本实验用分光光度法测定水杨酸钠的 血浆浓度并计算水杨酸钠为抗炎药，经肝代谢，在酸性环境中与三氯化铁生成一种紫色的络合

2、物， 在520nm波长下比色，其光密度与水杨酸浓度成正比。通过测定水杨酸钠的血浆半衰期，使学生了解水杨酸钠在体内的消除速度，并掌握其血浆半衰期的 测定方法。半衰期是判断毒物蓄积程度的重要参数，对中毒和解毒有一定的实践意义。二、试剂、器材及动物离心管、试管、磅秤、玻璃棒、注射器、吸管、离心机、721型分光光度计；三氯醋酸、水杨酸钠、 三氯化铁；兔。三、方法步骤1、取离心管和试管各5支，分别标为15号，备用。5支离心管各加入10%三氯醋酸7ml。2、取兔1只，称体重，从耳静脉取血2ml置入1号离心管，用玻璃棒搅拌。然而自耳静脉注入10% 水杨酸钠侪U量为150mg/kg),并立即和60min后两次

3、自另一耳静脉取血2mL分别注入2、3号离心管中, 搅拌。4、5号离心管分别加入蒸储水和0.02%水杨酸钠2ml。3、取上述5支离心管进行离心(2000r/min, 5min),准确吸取上清液6ml放入编号相对应的试管中, 分别滴入10%三氯化铁12滴(0.6ml)摇匀5min后比色。4、用721型分光光度计520nm波长比色，以4号管调“0”，读得5号管光密度为x,再以1号管调 “0”，读得2号管为xi，3号管为X2,将上述操作归纳为下表：水杨酸钠血浆半衰期的测定试管名编号三氯醋酸兔血002%水杨酸钠蒸储水离心上清液三氯化铁(ml)(ml)(ml)(ml)(ml)(gtt)对照172612立即

4、27261260min372612空白472612标准5726125、计算半衰期求k值：k=y/x; y=0.02求水杨酸钠血浓度：给药后立即血浓度yi二kxi；给药后60min血浓度y2=kx2。根据以下公式求半衰期：0.301tl/2 =(igyi - igy?) /1四、结果结果测定5号管光密度(x)2号管光密度(xi)3号管光密度(x2)tl/2实验二血液红细胞、白细胞计数A【红细胞计数】红细胞计数（red blood cell count, RBC）是指计算每升血液内所含红细胞的数目。红细胞计数 的方法有显微镜计数法、血沉管计数法、光电比色法、血细胞电子计数器计数法等。目前在临床上

5、使用最广泛的是显微镜计数法（计数板法）。一、原理血液经稀释后，充入血细胞计数板，用显微镜观察，计数一定容积内的红细胞数并换算成每m内的数目。行）正面体小）蚁切囱阳放大后的方格网计败室（d）放大后的计收军血球什数板的构造1、改良式血细胞计数板：临床上最常用的是改良纽巴（Neubauer）氏计数板，它是由一块特制的玻璃板构成，玻璃板中间有横沟将其分为三个狭窄的平台，两边的平台较中间的平台高0.lmm。 中央平台又有一纵沟相隔，其上各刻有一个计数室。每个计数室划分为9个大方格，每一大方格面 积为LOmn?,深度为0.1mm；四角每一大方格划分为16个中方格，为计数白细胞用。中央一大方 格用双线划分为

6、25个中方格，每个中方格又划分为16个小方格，共计400个小方格，此为红细胞 计数之用。2、血盖片：专用于计数板的盖 玻片呈长方形，厚度为0.4mm。3、沙利氏（shali）吸血管或红 细胞稀释管，5ml吸管、中试管。4、显微镜，计数器等。5、稀释液:0.85%氯化钠溶液。三、方法试管稀释法用5ml吸管吸取红细胞稀释液3.98ml （或4ml亦可）置于试管中。用沙利氏吸血管吸取全血样 品至20m刻度处（或吸血至刻度10处，红细胞稀释液用2ml）。擦去吸管外壁多余的血液，将此血 液吹入试管底部，再吸、吹数次，以洗出沙利氏管内粘附的血细胞，然后试管口加塞，颠倒混合数 次，再用毛细吸管（或玻棒）吸取

7、已稀释好的血液，放于计数室与盖玻片接触处，即可自然流入计 数室中。注意充液不可过多或过少，过多那么溢出而流入两侧槽内，过少那么计数池中形成气泡，致使 无法计数。计数时，先用低倍镜，光线要稍暗些，找到计数室的格后，把中央的大方格置于视野之中，然 后转用高倍镜。在此中央大方格内选择四角与最中的五个中方格（或用对角线的方法数五个中方格）, 每个中方格有16个小方格，所以共计数80个小方格。计数时注意压在左边双线上的红细胞计在内, 压在右边双线上的红细胞那么不计数在内；同样，压在上线的计入，压在下线的不计入，此所谓“数左 不数右，数上不数下”的计数法那么。四、计算R/80x400x200x 10=1

8、mm3血液中红细胞个数。R 5个中方格（即80个小方格）内的红细胞总数。400 一 一个大方格，即Imn?面积内共有400个小方格。200稀释倍数。10血盖片与计数板的实际高度是乘10后那么为10mm。上式简化后为Rx 10, 000=红细胞数/mn?推算后即：每升血液中的红细胞数M=RxIOio（2OO倍稀释）五、考前须知（1）红细胞计数是一项细致的工作，稍有粗心大意，就会引起计数不准。关键是防凝、防溶、 取样正确。取抗凝血时，抗凝剂的量要合适，不可过少使血液局部呈小块凝集；采血时应注意及时 将抗凝剂与血液混匀。防溶是指防止过分振摇而使红细胞溶解，或是器材用水洗后未用生理盐水冲 洗而发生溶血

9、，使计数结果偏低。取样正确是指吸血io或20m一定要准确，吸血管外的血液要擦 去，吸血管内的血液要全部洗入稀释液中，稀释液的用量要准；充液量不可过多或过少，过多可使 血盖片浮起，过少那么计数室中形成小的空气泡，使计数结果偏低甚至无法计数。此外，显微镜台未 保持水平，使计数室内的液体流向一侧，这些操作上的错误均可使计数结果不准确。（2）器材清洗方法：沙利氏吸血管或试管，每次用完后，先用清水吸吹数次，然后用蒸储水、 酒精、乙醛，按次序分别吸吹数次，干后备下次使用。血细胞计数板用蒸储水冲洗后，用绒布轻轻 擦干即可，切不可用粗布擦试，也不可用酒精、乙醛等溶液冲洗。六、参考值家兔:（5.870.32）x

10、l012/L；成人男性：（4.0-5.5）X1012/L；成人女性：（3.55.0）X1012%B【白细胞计数】白细胞计数(white blood cell count, WBC)是指计算每升血液内所含白细胞的数目。白细胞计 数的方法有显微镜计数法和血细胞电子计数器计数法等。一、原理 用稀释液将红细胞破坏后，计算出每微升血中白细胞数。二、器材1.01或0.51刻度吸管，其他与红细胞计数同。三、试剂 白细胞稀释液可用12%的冰醋酸液，内加1 %结晶紫液1滴，以便与红细胞稀释 液区别。四、方法试管稀释法用1ml吸管吸取白细胞稀释液0.38ml (也可吸0.4ml)置一小试管中。用沙利氏管吸取被检血

11、 至20m处，擦去管外粘附的血液，吹入小试管中，反复吸吹数次，以洗净管内所粘附的白细胞，充 分振荡混合，再用毛细吸管或沙利氏吸血管吸取被稀释的血液，充入已盖好盖玻片的计数室内，静 置12min,低倍镜检查。将计数室四角四个大方格内的全部白细胞依次数完，注意压在左线和上线的计入，压在右线和 下线的不计入。五、计算：R/4x20xl0=白细胞数似R四角四个大方格内的白细胞总数。R/4一 一个大方格(面积为Imn?)内的白细胞数。20-稀释倍数10血盖片与计数板的实际高度是乘10后那么为1mm。上式简化后为Rx50=白细胞数仅1推算后即：每升血液中的白细胞数M=Rx5xl()7(20倍稀释)六、考前

12、须知 防止把尘埃异物与白细胞混淆，可用高倍镜观察：白细胞有细胞核的结构，而 尘埃异物的形状不规那么，无细胞结构。七、参考值家兔：(9.481.12)x109/L；成人(4-10)X109/L；实验三四氯化碳对肝脏谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)的影响实验一、目的要求通过本实验使学生掌握四氯化碳对肝脏谷丙转氨酶(GPT)/丙氨酸氨基转移酶(ALT)和谷草转 氨酶(GOT)/门冬氨酸氨基转移酶(AST)影响的测定方法。二、原理谷氨酸+丙酮酸 .GPT/AET 一一酮龙一酸.而氨酸以丙氨酸和Q-酮戊二酸为基质，在一定条件下反响产生一定量的丙酮酸，加入1摩尔浓度酸后 酶反响终止，2, 4-二

13、硝基苯肌与丙酮酸作用生成丙酮酸2, 4-二硝基苯腺，在碱性条件下呈红棕色, 根据色泽深浅推算出酶活力。虽然基质中剩余的Q-酮戊二酸也能与2, 4-二硝基苯肺生成苯腺，但 在500520nm波长下，丙酮酸2, 4-二硝基苯腺的显色强度约为Q -酮戊二酸2, 4-二硝基苯腺的3 倍，且。-酮戊二酸的用量较少，利用这一差异可以反映丙酮酸的生成量。谷氨酸+草酰乙酸. GOT7AST 一酮戊二酸+门冬氨酸以门冬氨酸和a-酮戊二酸为基质，在一定条件下反响产生一定量的草酰乙酸，草酰乙酸在反响 过程中又自行脱竣成为丙酮酸，余下与2, 4-二硝基苯肌的显色原理同ALT。三、试剂与器材及动物1 .四磷酸盐缓冲液(

14、O.lmol/L, pH7.4)：取甲液420ml和乙液80ml,混合均匀即得。甲液(0.lmol/L磷酸二氢钠)：mNaH2PO4- 12H2O35.82g,加蒸储水溶解后稀释至1000ml。乙液(O.lmol/L磷酸二氢钾)：取无水KH2Po4 13.61g,加蒸储水溶解后稀释至1000ml。丙酮酸钠标准液(2mmol/L)：在100ml磷酸盐缓冲液中溶解220mg丙酮酸钠。04moi/L氢氧化钠溶液:先配Imol/LNaOH(称取NaOH40g,用蒸偏水溶解后稀释至1000ml 即得)，以Imol/LNaOH稀释配成0.4mol/LNaOH。SGPT基质液：精确称取DL-丙氨酸L79g和

15、a-酮戊二酸29.2mg,放于100ml烧杯内，加入 少量(约15ml)磷酸盐缓冲液及少量lmol/L的NaOH溶液使其溶解，并调pH至7.4,放入100ml容 量瓶内，用磷酸盐缓冲液定容，4C冰箱保存，止匕液每升含酮戊二酸2mm01、丙氨酸200mmol。(5)SG0T基质液：在100ml的烧杯中加入29.2mg a -酮戊二酸和2.66gDL-天门冬氨酸，再加入 足量的lmol/L氢氧化钠，配成溶液，用lmol/L氢氧化钠调节pH为74移入100mg容量瓶中，用 磷酸盐缓冲液定容，4温箱保存。此液每升含Q-酮戊二酸2mm01、天门冬氨酸200mmol。2,4-二硝基苯脱液(1001%)：称

16、取19.8mg 2,4-二硝基苯队 加lmol/L盐酸至100ml使之成 为溶液。盛于棕色瓶内备用。(7)50%四氯化碳植物油溶液。2 .分光光度计、注射器、试管、兔笼。3 .动物健康、未妊娠的家兔。四、方法步骤1 .损伤兔肝脏 取健康、未妊娠家兔以50%四氯化碳植物油溶液股内皮下注射(0.5ml/kg)损害其肝脏。2 .制备血清取损伤肝24h后的家兔全血入干净试管中，静置后取其血清。同法制取健康家 兔的血清(对照)，均置入冰箱保存待用。3 .标准曲线的绘制SGOT和SGPT不能用一个标准曲线，在作标准曲线时，应分别加入基质 液，按表1操作。表1 SGOT和SGPT标准曲线制作步骤单位：ml混

17、匀，37保温lOmin后取出，冷却至室温，于520nm处进行比色,以蒸储水调“0”读取各试剂空白12345O.lmol/L磷酸盐缓冲液0.100.100.100.100.100.10丙酮酸钠标准液(2mmol/L)00.050.100.150.200.25SGPT/SGOT基质液0.500.450.400.350.300.25相当于丙酮酸实际含量(mol)00.100.200.300.400.50相当于GPT活力(IU)0285797150200相当于GOT活力(IU)02461114190置37水浴中预热5min2,4-二硝基苯肌液0.500.500.500.500.500.50置37水浴中

18、保温20min0.4mol/L氢氧化钠5.05.05.05.05.05.0管光密度。将各管光密度减去“空白”管光密度，所得差值与其对应的酶活力单位数作图。标准曲 线应作24套，求其均值较为理想。4 .测定鼠肝脏谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性取干净试管3支，各标以“肝损”、“正常对照”、“水对照”，分别准确加入SGPT基质液或 SGOT基质液各10ml。将试管置于37恒温水浴中温热23min。然后在“肝损”管中加入0.2ml肝损兔血清；在 “正常对照”管中加入0.2ml正常兔血清；在“水对照”管中加入0.2ml蒸播水。(3)将上述3支试管均放入37c恒温水浴中温热60min,取出试管，立即分别加入1

19、.0ml 2,4- 硝基苯肌液，混匀后在室温下置20min。(4)分别加入10.0ml的0.4mol/L氢氧化钠溶液，盖好试管，混合均匀，在室温下静置5min。肝损正常对照水对照SGPT基质液或SGOT基质液ml1.01.01.037恒温水浴中温热23min血清ml0.20.2蒸储水ml0.237恒温水浴中温热60min2,4-二硝基苯脱液ml1.01.01.0混匀后在室温下置20min0.4mol/L氢氧化钠溶液10.010.010.0混合均匀，在室温下静置5min用蒸储水调“0”，在520nm波长处测定光密度。在标准曲线上查取各自的SGOT或SGPT含量(每毫升血清中的国际单位数，IU/ml)o五、结果（参考表2）表2试管名光密度SGPT/SGOT含量IU/m 1水对照正常对照肝损六、结论