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1、发酵液的预处理与固液分离现在学习的是第1页，共44页第二章第二章 发酵液的预处理与固液分离发酵液的预处理与固液分离n目目 的的 分离菌体和其他悬浮颗粒分离菌体和其他悬浮颗粒(细胞碎片、细胞碎片、核酸和蛋白质的沉淀物核酸和蛋白质的沉淀物)；n除去部分可溶性杂质和改变滤液性质，以利于提取除去部分可溶性杂质和改变滤液性质，以利于提取和精制的顺利进行。和精制的顺利进行。n意意 义义 从微生物发酵液或细胞培养液中提取从微生物发酵液或细胞培养液中提取生化物质的第一个必要步骤就是预处理和固液分生化物质的第一个必要步骤就是预处理和固液分离，他关系着下道工序的工艺设计。离，他关系着下道工序的工艺设计。现在学习的
2、是第2页，共44页第一节 发酵液的预处理和固液分离n 掌握悬浮液的一般特征和预处理的方法，了解悬浮液的分离过程和分类及常用的过滤法。（一）、悬浮液的基本特征（二）、悬浮液的预处理（三）、悬浮液分离过程和分类（四）、过滤法现在学习的是第3页，共44页一、发酵液的基本特征n细菌及某些放线菌菌体细小，发酵液粘度大，不能直接过滤。n由于菌体自溶，核酸、蛋白质及其它有机粘性物质的存在会造成滤液浑浊，滤速极慢。n发酵液中杂质很多，其中对提炼影响最大的是高价无机离子（高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe3+）和杂蛋白质杂蛋白质等。现在学习的是第4页，共44页二、发酵液的预处理n采用理化方法设法增大悬浮液中
3、固体粒子的大小、或降低粘度，以利于过滤。n去除会影响后续提取的高价无机离子高价无机离子和杂蛋白质杂蛋白质等。现在学习的是第5页，共44页 预处理的方法n1，高价无机离子的去除方法n2，杂蛋白质的去除n3，发酵液的凝聚和絮凝现在学习的是第6页，共44页1 高价无机离子的去除方法n钙离子，可用草酸，反应生成的草酸钙能促使蛋白质可用草酸，反应生成的草酸钙能促使蛋白质凝固，提高滤液（也称为原液）质量凝固，提高滤液（也称为原液）质量.n镁离子镁离子，可用三聚磷酸钠它和镁离子形成可溶性，可用三聚磷酸钠它和镁离子形成可溶性络合物，用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和络合物，用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁
4、离子的浓度。镁离子的浓度。Na5P3O10+Mg2+=MgNa3P3O10+2Nan黄血盐与铁离子黄血盐与铁离子形成普鲁土盐沉淀形成普鲁土盐沉淀 3K4Fe(CN)6+4Fe3+=Fe4Fe(CN)63+12K+现在学习的是第7页，共44页2 杂蛋白质的去除方法n热变性n沉淀n大幅度改变pHn加有机溶剂 现在学习的是第8页，共44页 杂蛋白质的去除方法n热变性n变性蛋白质溶解度较小溶解度较小。最常用的使蛋白质变性的方法是加热加热。加热还能使液体粘度降低粘度降低，加快过滤速度。该法只适用于对热较稳定的生化物质对热较稳定的生化物质。现在学习的是第9页，共44页 杂蛋白质的去除方法n沉淀沉淀n蛋白质
5、在某一蛋白质在某一pHpH下，净电荷为零，溶解度最小，称为等电点。下，净电荷为零，溶解度最小，称为等电点。由于羧基的电离度比氨基大，故蛋白质的酸性性质通常强于碱由于羧基的电离度比氨基大，故蛋白质的酸性性质通常强于碱性，因而很多蛋白质的等电点都在酸性范围内（性，因而很多蛋白质的等电点都在酸性范围内（pH 4.0pH 4.05.55.5）。n在酸性溶液中在酸性溶液中,蛋白质能与一些阴离子如三氯乙酸盐、水杨蛋白质能与一些阴离子如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀。n在碱性溶液中，能与一些阳离子，如在碱性溶液中，能与一些
6、阳离子，如AgAg，Ca2+、Mg2+、Fe3+和和PbPb等形成沉淀。等形成沉淀。现在学习的是第10页，共44页 杂蛋白质的去除方法n大幅度改变pHn在抗生素生产中，常将发酵液pH 调至偏酸性范围（pH 23）或较碱性范围（pH 8一一9）使蛋白质凝固使蛋白质凝固现在学习的是第11页，共44页 杂蛋白质的去除方法n加有机溶剂加有机溶剂n加有机溶剂使蛋白质变性的方法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。加酒精、丙酮等有机加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂溶剂或表面活性剂等等。此外，还可以利用吸附作用除去蛋白质。n例如，四环类抗生素生产中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾K2Zn3
7、Fe（CN）5 2的胶状沉淀来吸附蛋白质。现在学习的是第12页，共44页3 发酵液的凝聚和絮凝n凝聚和絮凝技术凝聚和絮凝技术能有效地改变细胞、菌体和蛋白质细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子胶体粒子的分散状态，使聚集起来，增大体积，以便于过滤，常用于菌体细小而且粘度大的发酵液的预处理中。n絮凝技术预处理发酵液的优点不仅在于过滤速度的提高，还在于能有效地去除杂蛋白质和固体杂质，如菌体、细胞和细胞碎片等，提高了滤液质量现在学习的是第13页，共44页3 发酵液的凝聚和絮凝n凝聚凝聚 是在中性盐作用下，由于双电层排是在中性盐作用下，由于双电层排斥电位的降低，而使胶体体系不稳定的斥电位的降低，而使胶体体系不稳定
8、的现象。现象。n絮凝絮凝 是指在某些高分子絮凝剂存在下，是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物理的集合为主的团的过程，是一种以物理的集合为主的过程。过程。现在学习的是第14页，共44页发酵液的凝聚原理n通常发酵液中细胞或菌体带有负电荷，由于静电引力的作用使溶液中带相反电荷的粒子（即正离子）被吸附在其周围，在界面上形成了双电层。n但是这些正离子还受到使它们均匀分布开去的热运动的影响，具有离开胶粒表面的趋势，在这两种相反作用的影响下，双电层就分裂成两部分，现在学习的是第15页，共44页发酵液的凝聚原理n在相距胶核表面约
9、一个离子半径的平面在相距胶核表面约一个离子半径的平面以内，正离子被紧密束缚在胶核表面，以内，正离子被紧密束缚在胶核表面，称为称为吸附层或紧密层吸附层或紧密层 n在平面以外，剩余的正离子则在溶液中在平面以外，剩余的正离子则在溶液中扩散开去，距离越远，浓度越小，最后扩散开去，距离越远，浓度越小，最后达到主体溶液的平均浓度，称为达到主体溶液的平均浓度，称为扩散层扩散层。这样就形成了扩散双电层的结构模型。这样就形成了扩散双电层的结构模型，如图所示。，如图所示。现在学习的是第16页，共44页现在学习的是第17页，共44页当胶粒在溶液中作相对运动时，总有一薄层液体，随着它一起当胶粒在溶液中作相对运动时，总
10、有一薄层液体，随着它一起滑移，这一薄层，厚度比吸附层稍大，滑移滑移，这一薄层，厚度比吸附层稍大，滑移（剪切面）在图中（剪切面）在图中用波纹线表示。用波纹线表示。现在学习的是第18页，共44页n这三种电位中只有这三种电位中只有电位能实际测得，所电位能实际测得，所以可以认为它是控制胶粒间电排斥作用以可以认为它是控制胶粒间电排斥作用的电位，用来表征双电层的特征，并作的电位，用来表征双电层的特征，并作为研究凝聚机理的重要参数。为研究凝聚机理的重要参数。n胶粒能保持分散状态的原因主要是带有胶粒能保持分散状态的原因主要是带有相同电荷和扩散双电层的结构，一旦由相同电荷和扩散双电层的结构，一旦由于布朗（于布朗
11、（Brown）运动使粒子间距离缩）运动使粒子间距离缩小到它们的扩散层部分重叠时，即产生小到它们的扩散层部分重叠时，即产生使两个粒子分开的排斥力，从而阻止了使两个粒子分开的排斥力，从而阻止了粒子的聚集。粒子的聚集。电位越大，电排斥作用就电位越大，电排斥作用就越强，胶粒的分散程度也越大，越强，胶粒的分散程度也越大，现在学习的是第19页，共44页发酵液的凝聚原理n此外，由于胶粒表面的水化作用水化作用，形成了包围于粒子周围的水化层水化层，也能阻碍胶粒间的直接聚集直接聚集。n但是，水化膜水化膜主要是伴随胶粒带电而引伴随胶粒带电而引起起的，一旦电位电位降低或消除，水化层水化层也会随之减弱或消失减弱或消失。
12、现在学习的是第20页，共44页发酵液的凝聚原理n根据静电学基本定理静电学基本定理，可导出电位电位的基本公式为：n4q/Dn其中 D水的介电常数；nq胶体的电动电荷密度电荷密度，即滑移面上的电荷密度；n扩散层的有效厚度有效厚度n可知，电位与扩散层厚度和电荷密度q成正比，而扩散层厚度又与溶液中离子强度有关，当双电层的排斥力不足以抗衡胶粒间的范德华引力时，由于热运动的结果导致胶粒的互相碰撞而聚集起来。现在学习的是第21页，共44页 方 法n由此可见，在发酵液中加入具有高价阳离子的电解质，能降低能降低电位和脱除胶粒电位和脱除胶粒表面的水化膜表面的水化膜，就能导致胶粒间的凝聚作用。n 常用的凝聚剂电解质
13、有nAl2（SO4）318H2O（明矾）；（明矾）；AlC136H2O；FeC13；ZnSO4；MgCO3等。等。现在学习的是第22页，共44页发酵液的絮凝原理n絮凝作用絮凝作用n 有机高分子聚合物絮凝剂，它们具有长链线状的结构，是一种水溶性的聚合物，分子量可高达数万至一千万以上，在长的链节上含有相当多的活性功能团，可以带有多价电荷（如阴离子或阳离子），也可以不带电性（如非离子型）。它们通过静电引力、范德华分子引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面，一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同颗粒的表面上，产生了架桥联接，生成粗大的絮团，这就是絮凝作用。现在学习的是第23页，共44页 方 法n目
14、前最常见的高分子聚合物絮凝剂是有目前最常见的高分子聚合物絮凝剂是有机合成的聚丙烯酰胺类衍生物。机合成的聚丙烯酰胺类衍生物。n 根据活性基团在水中解离情况不同，可根据活性基团在水中解离情况不同，可分为分为非离子型、阴离子型（含有羧基）非离子型、阴离子型（含有羧基）和阳离子型（含有胺基）三类。和阳离子型（含有胺基）三类。n 聚丙烯酰胺类絮凝剂具有用量少，絮凝聚丙烯酰胺类絮凝剂具有用量少，絮凝体粗大，分离效果好，絮凝速度快以及体粗大，分离效果好，絮凝速度快以及种类多等优点，所以适用范围广种类多等优点，所以适用范围广。现在学习的是第24页，共44页n它们的主要缺点是存在一定的毒性，特它们的主要缺点是存
15、在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，要考虑这些别是阳离子型聚丙烯酰胺，要考虑这些物质最终能否从产品中去除。物质最终能否从产品中去除。n 近年来还发展了聚丙烯酸类阴离子絮凝近年来还发展了聚丙烯酸类阴离子絮凝剂，它们无毒，可用于食品和医药工业剂，它们无毒，可用于食品和医药工业中。中。n还有聚苯乙烯类衍生物及无机高分子聚还有聚苯乙烯类衍生物及无机高分子聚合物絮凝剂，如聚合铝盐和聚合铝铁盐合物絮凝剂，如聚合铝盐和聚合铝铁盐等。除此以外，也可采用天然有机高分等。除此以外，也可采用天然有机高分子絮凝剂。如多聚糖类胶粘物，海藻酸子絮凝剂。如多聚糖类胶粘物，海藻酸钠，明胶、骨胶、壳多糖和脱乙酰壳多钠，明胶
16、、骨胶、壳多糖和脱乙酰壳多糖等。糖等。现在学习的是第25页，共44页 方 法 n对于带负电性菌体或蛋白质来说，对于带负电性菌体或蛋白质来说，阳离阳离子型高分子絮凝剂子型高分子絮凝剂同时具有降低粒子排同时具有降低粒子排斥电位和产生吸附架桥的双重机理，所斥电位和产生吸附架桥的双重机理，所以可以单独使用。以可以单独使用。现在学习的是第26页，共44页 方 法n对于对于非离子型和阴离子型非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，则主要通高分子絮凝剂，则主要通过分子间引力和氢键作用产生吸附架桥，它们常与过分子间引力和氢键作用产生吸附架桥，它们常与无机电解质凝聚剂搭配使用。无机电解质凝聚剂搭配使用。n首先加入无机电
17、解质，使悬浮粒子间的相互排斥能首先加入无机电解质，使悬浮粒子间的相互排斥能降低，脱稳而凝聚成微粒，然后，再加入絮凝剂。降低，脱稳而凝聚成微粒，然后，再加入絮凝剂。无机电解质的凝聚作用为高分子絮凝剂的架桥创造无机电解质的凝聚作用为高分子絮凝剂的架桥创造了良好的条件，从而，提高了絮凝效果。这种包括了良好的条件，从而，提高了絮凝效果。这种包括凝聚和絮凝机理的过程，常称为凝聚和絮凝机理的过程，常称为混凝混凝。现在学习的是第27页，共44页现在学习的是第28页，共44页 影响絮凝的因素n絮凝剂的添加量n发酵液的pHn絮凝剂的分子量n搅拌转速n搅拌时间现在学习的是第29页，共44页絮凝剂加量对絮凝效果(滤
18、速)的影响 料液中，絮凝剂浓度增加有助于架桥充分，但是过多的加量反而会引起吸附饱和，在每个胶粒上形成覆盖层而使胶粒产生再次稳定现象现在学习的是第30页，共44页发酵液pH对阴离子聚丙烯酰胺絮凝效果的影响 溶液pH的变化常会影响离子型絮凝剂中功能团的电离度，从而影响分子链的伸展形态。电离度增大，由于链节上相邻离子基团间的电排斥作用，而使分子链从卷曲状态变为伸展状态，所以架桥能力提高。现在学习的是第31页，共44页 二、发酵液的过滤n微生物发酵液中含有大量菌体、细胞或微生物发酵液中含有大量菌体、细胞或细胞碎片以及残余的固体培养基成分。细胞碎片以及残余的固体培养基成分。过滤就是将悬浮在发酵液中的固体
19、颗粒过滤就是将悬浮在发酵液中的固体颗粒与液体进行分离的过程。与液体进行分离的过程。n在过滤操作中，要求滤速快，滤液澄清在过滤操作中，要求滤速快，滤液澄清并且有高的收率。并且有高的收率。现在学习的是第32页，共44页1、影响过滤速度的因素过滤速度和以下因素有关过滤速度和以下因素有关n菌种。菌种。n发酵条件。发酵条件。n培养基的组成培养基的组成n未用完的培养基未用完的培养基n消沫油消沫油n发酵周期发酵周期现在学习的是第33页，共44页 菌种对过滤速度影响n真菌的菌丝比较粗大真菌的菌丝比较粗大，如青霉菌的菌丝直径可达，如青霉菌的菌丝直径可达10m10m，发酵液容易过滤，不需特殊处理。其滤，发酵液容易
20、过滤，不需特殊处理。其滤渣呈紧密饼状物，很容易从滤布上刮下来，故可渣呈紧密饼状物，很容易从滤布上刮下来，故可采用鼓式真空过滤机过滤。采用鼓式真空过滤机过滤。n放线菌发酵液菌丝细而分枝，交织成网络状放线菌发酵液菌丝细而分枝，交织成网络状。如链霉。如链霉素发酵液菌丝仅素发酵液菌丝仅0.51.0m0.51.0m左右，还含有很多多糖类左右，还含有很多多糖类物质，粘性强，过滤较困难，一般需经预处理，以凝物质，粘性强，过滤较困难，一般需经预处理，以凝固蛋白质等胶体。固蛋白质等胶体。n细菌发酵液的菌体更细小细菌发酵液的菌体更细小，因此，过滤十分因准，因此，过滤十分因准，如不用絮凝等方法预处理发酵液，往往难以
21、采用常规如不用絮凝等方法预处理发酵液，往往难以采用常规过滤的设备来完成过滤操作过滤的设备来完成过滤操作。现在学习的是第34页，共44页培养基的组成对过滤速度影响n用黄豆粉、花生粉作氮源、淀粉作碳源用黄豆粉、花生粉作氮源、淀粉作碳源会使过滤困难；会使过滤困难；n发酵后期加消泡油或剩余大量末用完的发酵后期加消泡油或剩余大量末用完的培养基也会使过滤困难。培养基也会使过滤困难。现在学习的是第35页，共44页发酵周期对过滤的影响n正确选择发酵终了时间对过滤影响很大正确选择发酵终了时间对过滤影响很大。在菌体丝自溶前必须放罐，因为细胞。在菌体丝自溶前必须放罐，因为细胞自治后的自治后的 分解产物一股很难过滤。
22、有时分解产物一股很难过滤。有时延长发酵周期虽能使发酵单位有所提高延长发酵周期虽能使发酵单位有所提高，但严重影响发酵液质量，使色素和胶，但严重影响发酵液质量，使色素和胶状杂质增多、过滤困难，最终造成成品状杂质增多、过滤困难，最终造成成品质量降低。质量降低。现在学习的是第36页，共44页2、改善过滤性能的方法n等电点等电点n蛋白质变性蛋白质变性n吸附吸附n凝聚和絮凝凝聚和絮凝n加入助滤剂加入助滤剂n直接在发酵液中形成填充直接在发酵液中形成填充-凝固剂凝固剂n酶解作用酶解作用现在学习的是第37页，共44页 过滤助剂n助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼
23、疏松，滤速增大。疏松，滤速增大。n过滤助剂可解决两个问题过滤助剂可解决两个问题n滤饼的可压缩性问题滤饼的可压缩性问题n小粒子如菌丝碎片和细菌细胞，会渗入到转鼓真空过滤小粒子如菌丝碎片和细菌细胞，会渗入到转鼓真空过滤预覆盖层内部。使得预覆盖层的部分孔被堵塞，影响了预覆盖层内部。使得预覆盖层的部分孔被堵塞，影响了渗透性。渗透性。加入助滤剂可以解决这一问题加入助滤剂可以解决这一问题n常用的过滤助剂常用的过滤助剂 硅藻土、珍珠岩、磨碎的木浆、淀粉硅藻土、珍珠岩、磨碎的木浆、淀粉现在学习的是第38页，共44页n助滤剂的加入有两种方法：助滤剂的加入有两种方法：n在滤布上预先铺一层助滤剂在滤布上预先铺一层助
24、滤剂(12mm)(12mm)，该方，该方法，会使滤速降低，但滤液透明度法，会使滤速降低，但滤液透明度n直接加入发酵液中（助滤剂的用量，有一条直接加入发酵液中（助滤剂的用量，有一条经验规则可供参考，即助滤剂用量若等于悬经验规则可供参考，即助滤剂用量若等于悬浮液中固体含量时，滤速最快。）浮液中固体含量时，滤速最快。）现在学习的是第39页，共44页 填充-凝固剂n改善过滤性能较好的方法是加入一些反应剂，它们能相互改善过滤性能较好的方法是加入一些反应剂，它们能相互作用，或和某些溶解性盐类发生反应生成不溶解的沉淀作用，或和某些溶解性盐类发生反应生成不溶解的沉淀(CaSO(CaSO4 4，AlPOAlPO
25、4 4等等)。生成的沉淀能使菌丝具有块状结构，沉淀本。生成的沉淀能使菌丝具有块状结构，沉淀本身即可作为助滤剂，还能使胶状物和悬浮物凝固，身即可作为助滤剂，还能使胶状物和悬浮物凝固，n如新生霉素发酵液中加入氯化钙和磷酸钠，生成的磷酸钙如新生霉素发酵液中加入氯化钙和磷酸钠，生成的磷酸钙可作为填充可作为填充-凝固剂。凝固剂。n一方面作为助滤剂，另一方面还可使某些蛋白质凝固。一方面作为助滤剂，另一方面还可使某些蛋白质凝固。n又如环丝氨酸发酵液用氧化钙和磷酸处理，生成的磷酸钙沉淀，能又如环丝氨酸发酵液用氧化钙和磷酸处理，生成的磷酸钙沉淀，能使悬浮物凝固。多余的磷酸根离子，还能除去钙、镁离子。并且在使悬浮
26、物凝固。多余的磷酸根离子，还能除去钙、镁离子。并且在发酵液中不会引入其它阳离子而影环环丝氨酸的离子交换吸附。正发酵液中不会引入其它阳离子而影环环丝氨酸的离子交换吸附。正确选择反应剂和反应条件，能使过滤速度提高确选择反应剂和反应条件，能使过滤速度提高310310倍。倍。现在学习的是第40页，共44页 酶解作用n如发酵液中有不溶解的多糖存在则最好如发酵液中有不溶解的多糖存在则最好用酶将它转化为单糖，以提高过滤速度用酶将它转化为单糖，以提高过滤速度。例如万古霉素用淀粉作培养基，加入。例如万古霉素用淀粉作培养基，加入淀粉酶后，能使过滤速度加快。淀粉酶后，能使过滤速度加快。现在学习的是第41页，共44页3、固液分离设备的选择n不同性状约发酵液应选择不同的固不同性状约发酵液应选择不同的固液液分离设备。常用于发酵液的分离设备有分离设备。常用于发酵液的分离设备有：n板框压滤机板框压滤机n鼓式真空过滤机鼓式真空过滤机n离心沉降分离机离心沉降分离机 现在学习的是第42页，共44页现在学习的是第43页，共44页n板框压滤机优点：n板框压滤机的过滤面积大；n过滤推动力(压力差)能较大幅度地进行调整，并能耐受较高的压力差；n结构简单，价格低，n动力消耗少等优点。缺点n不能连续操作，设备笨重，劳动强度大，n卫生条件差，n非生产的辅助时间长，阻碍了过滤效率的提高。现在学习的是第44页，共44页