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1、分子印迹渍与分子杂交技术第一页，讲稿共五十九页哦固相支持物应具备的特点：固相支持物应具备的特点：1)具有较强的结合核酸分子的能力（具有较强的结合核酸分子的能力（10 g/cmcm2 2）2)与核酸结合后，不影响其与探针分子的杂交反应。与核酸结合后，不影响其与探针分子的杂交反应。3)与核酸稳定牢固结合，能经受杂交、洗膜等操作与核酸稳定牢固结合，能经受杂交、洗膜等操作 过程。过程。4)非特异性吸附少，洗膜条件下能将非特异性吸附非特异性吸附少，洗膜条件下能将非特异性吸附 在其表面的探针分子洗脱掉。在其表面的探针分子洗脱掉。5)具有良好的机械性能，如柔软性，柔韧性。具有良好的机械性能，如柔软性，柔韧性
2、。第二页，讲稿共五十九页哦几种常用固相支持物几种常用固相支持物1)硝酸纤维素虑膜（硝酸纤维素虑膜（nitrocellulose filter membrane）具有较强吸附单链具有较强吸附单链DNA和和RNA的能力（高盐下达的能力（高盐下达 80 g/cmcm2 2 100 g/cmcm2 2）。）。真空烘干后，依靠疏水性相互作用。真空烘干后，依靠疏水性相互作用。杂交本底较低。杂交本底较低。不易反复杂交和洗膜（结合力）不易反复杂交和洗膜（结合力）质地较脆，烘烤后更甚，小心操作质地较脆，烘烤后更甚，小心操作与核酸结合依赖高盐，低盐结合不佳，与核酸结合依赖高盐，低盐结合不佳，不易核酸电转不易核酸电
3、转第三页，讲稿共五十九页哦2)尼龙膜（尼龙膜（nylon membrane）结合单链结合单链DNA和和RNA的能力比的能力比NC膜强（达膜强（达 350 g/cmcm2 2 500 g/cmcm2 2）。）。真空烘干后或紫外线照射可强化结合（短波真空烘干后或紫外线照射可强化结合（短波UV照射后照射后,部分嘧啶碱基与其氨基交联，更加牢固）。部分嘧啶碱基与其氨基交联，更加牢固）。微波处理和碱处理也可促结合，从而使细菌裂解、微波处理和碱处理也可促结合，从而使细菌裂解、DNA 变性与固定一步完成（菌落原位杂交）。变性与固定一步完成（菌落原位杂交）。韧性较强，操作方便。韧性较强，操作方便。能结合小分子核
4、酸。能结合小分子核酸。低盐也能很好结合（可用于核酸电转移）。低盐也能很好结合（可用于核酸电转移）。可反复杂交和洗膜。可反复杂交和洗膜。杂交本底较高杂交本底较高第四页，讲稿共五十九页哦3)化学活化膜（化学活化膜（chemical activated membrane）将虑膜用一定的化学物质处理后即形成化学活化膜（如将虑膜用一定的化学物质处理后即形成化学活化膜（如ABM和和APT纤维素膜），这种化学活化膜经特殊处理而活化，产纤维素膜），这种化学活化膜经特殊处理而活化，产生活化基团（重氮盐）与生活化基团（重氮盐）与DNA或或RNA分子共价结合。分子共价结合。DNA与膜共价结合，反复多次使用不会损耗太
5、多。与膜共价结合，反复多次使用不会损耗太多。对不同大小的核酸片段都具有同等的结合能力（对不同大小的核酸片段都具有同等的结合能力（NC、NL不不具备具备)结合能力较结合能力较NC膜低膜低活化过程较复杂活化过程较复杂4)滤纸滤纸 结合能力较弱，但经济（结合能力较弱，但经济（基因文库粗筛的菌落原位杂交）基因文库粗筛的菌落原位杂交）第五页，讲稿共五十九页哦 是指将核酸是指将核酸,蛋白质等生物大分子蛋白质等生物大分子固定在纤维膜上的过程。将核酸或蛋白固定在纤维膜上的过程。将核酸或蛋白质从电泳后的凝胶中转移到膜上或直接质从电泳后的凝胶中转移到膜上或直接将核酸点到膜上。将核酸点到膜上。转膜转膜（1 1）物理
6、吸印方法）物理吸印方法（毛细虹吸（毛细虹吸 真空抽吸）真空抽吸）（2 2）电转印方法）电转印方法第六页，讲稿共五十九页哦第七页，讲稿共五十九页哦印迹（渍）技术Southern BlotDNA（由Edwin Mellor Southern 等人首次应用）（1975年，年，Southren创造了将创造了将DNA区带原位转移到硝酸基纤维素膜（区带原位转移到硝酸基纤维素膜（NC膜）上膜）上，再进行杂交的方法，被称为，再进行杂交的方法，被称为Southren印迹法。）印迹法。）Northern BlotRNA （Alwine等将类似方法用于等将类似方法用于RNA印迹，被戏称为印迹，被戏称为 Northe
7、rn印迹。）印迹。）Western BlotProtein（immunoblotting)（1979年年Towbin等设计了将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜的装置，将蛋等设计了将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜的装置，将蛋白质转移到膜上，再与相应的抗体等配体反应，被戏称为白质转移到膜上，再与相应的抗体等配体反应，被戏称为Western印迹，这种印迹，这种装置将膜和凝胶、滤纸等制成夹心饼干状，用低电压完成转移。）装置将膜和凝胶、滤纸等制成夹心饼干状，用低电压完成转移。）第八页，讲稿共五十九页哦 Eastern Blot（1982年年Reinhart等用电转移法将等电聚焦等用电转移法将等电聚焦 后的
8、蛋后的蛋白质区带从凝胶转移到特定膜上，称白质区带从凝胶转移到特定膜上，称Eastern印迹。印迹。）Dot Blot In situ hybridization 第九页，讲稿共五十九页哦固相核酸印迹杂交类型 Southern印迹杂交印迹杂交（southern blot）Northern印迹杂交（Northern blot）斑点杂交（Dot blot）菌落原位杂交（Colony in situ hybridization）组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置 第十页，讲稿共五十九页哦第十一页，讲稿共五十九页哦第十二页，讲稿
9、共五十九页哦第十三页，讲稿共五十九页哦第十四页，讲稿共五十九页哦斑点杂交（斑点杂交（Dot blot）斑点杂交法是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量斑点杂交法是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。为使点样准确方便，市售有多种多管吸分析，一张膜上可同时检测多个样品。为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪（印仪（manifolds），如），如Minifold I和和II、Bio-Dot(Bio Rad)和和Hybri Dot,它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下
10、就会流到膜上呈斑点状或狭缝状，反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以状，反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。进行杂交。第十五页，讲稿共五十九页哦第十六页，讲稿共五十九页哦（1）DNA斑点杂交斑点杂交先将膜在水中浸湿，再放到先将膜在水中浸湿，再放到15SSC中。中。将将DNA样品溶于水或样品溶于水或TE，煮沸，煮沸5min，冰中速冷。，冰中速冷。用铅笔在滤膜上标好位置，将用铅笔在滤膜上标好位置，将DNA点样于膜上。每个样品点样于膜上。每个样品一般点一般点50l（210g DNA）。）。将膜烘干，密封保存备用。将膜烘干，密封保存备用。
11、第十七页，讲稿共五十九页哦RNA斑点杂交：斑点杂交：1）与上法类似，每个样品至多加）与上法类似，每个样品至多加10g总总RNA（经酚（经酚/氯仿或异硫氰酸胍提取纯化）。氯仿或异硫氰酸胍提取纯化）。2）将）将RNA溶于溶于5l DEPC水，加水，加15l甲醛甲醛/SSC缓冲缓冲液（液（10SSC中含中含0.15mol/l 甲醛）使甲醛）使RNA变性。变性。3）然后取）然后取58l点样于处理好的滤膜上，烘干。点样于处理好的滤膜上，烘干。第十八页，讲稿共五十九页哦一种简化的提取和纯化一种简化的提取和纯化RNA的方法的方法用含用含0.5%Nonidet P40（诺乃洗涤剂）的低渗缓冲液对动（诺乃洗涤剂
12、）的低渗缓冲液对动物细胞作简单处理，离心去掉细胞核和细胞碎片，就得物细胞作简单处理，离心去掉细胞核和细胞碎片，就得到基本不带到基本不带DNA而富含而富含RNA的细胞质提取物，这一粗的细胞质提取物，这一粗RNA在在高盐下用甲醛变性，不需加工直接点到硝酸纤维素膜上。本法可高盐下用甲醛变性，不需加工直接点到硝酸纤维素膜上。本法可以快速检测大量标本，而只需极少量的细胞（以快速检测大量标本，而只需极少量的细胞（5104）或组织。）或组织。整个整个RNA实验中，要防止激活内源性实验中，要防止激活内源性Rnase。第十九页，讲稿共五十九页哦第二十页，讲稿共五十九页哦菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤
13、菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNADNA。将。将DNADNA烘干固定于膜上与烘干固定于膜上与3232P P标记的探针杂标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。菌落对位。菌落原位杂交菌落原位杂交（Colony in situ hybridizationColony in situ hybridization）第二十一页，讲稿共五十九页哦实验步骤如下：实验步骤如下：将滤膜置于含抗生素的平皿琼脂培养基上，用无菌牙签挑取单菌落种于滤膜和将滤
14、膜置于含抗生素的平皿琼脂培养基上，用无菌牙签挑取单菌落种于滤膜和主琼脂平板上，排列成方格栅，膜和板上菌落位置相同。主琼脂平板上，排列成方格栅，膜和板上菌落位置相同。培养细菌至产生培养细菌至产生12mm大小的菌落。大小的菌落。在一块平皿中置在一块平皿中置4张滤纸，用张滤纸，用10%SDS浸透，倒掉多余液体。将带有菌落浸透，倒掉多余液体。将带有菌落的滤膜取下，轻轻置于滤纸上，菌落面上在，注意防止在滤膜底面存有气泡的滤膜取下，轻轻置于滤纸上，菌落面上在，注意防止在滤膜底面存有气泡。5min后，将滤膜转至用变性溶液（后，将滤膜转至用变性溶液（0.5mol/l NaCl,0.5mol/L TrisNaC
15、l）浸湿的滤纸上，放置浸湿的滤纸上，放置10min。将滤膜转至中和溶液（将滤膜转至中和溶液（1.5mol/l NaCl,0.5mol/L TrisHCl，pH8.0）浸湿）浸湿的滤纸上，放置的滤纸上，放置10min。重复中和。重复中和1次。次。将滤膜移至用将滤膜移至用2SSPE溶液浸过的滤纸上，放置溶液浸过的滤纸上，放置10min。SSPE配成配成20贮贮备液：备液：3.6mol/l NaCl,0.2mol/L NaH2PO4(PH7.4),20mmol/L EDTA(pH7.4)。将滤膜用滤纸吸干，将滤膜用滤纸吸干，80真空烘干真空烘干2h。第二十二页，讲稿共五十九页哦第二十三页，讲稿共五十
16、九页哦 组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。原位杂交是经适当处理后交，它与菌落的原位杂交不同。原位杂交是经适当处理后，使细胞，使细胞通透性增加通透性增加，让探针进入细胞内与，让探针进入细胞内与DNADNA或或RNARNA杂交杂交。因此。因此,原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。例如，对例如，对致密致密染色体染色体DNADNA的原位杂交可用于显示特定的序列的位置；对的原位杂交可用于显
17、示特定的序列的位置；对分分裂期间核裂期间核DNADNA的杂交可研究特定序列在染色质内的功能排的杂交可研究特定序列在染色质内的功能排布；与细胞布；与细胞RNARNA的杂交可精确分析任何一种的杂交可精确分析任何一种RNARNA在细胞中和在细胞中和组织中的分布。此外，原位杂交还是显示细胞亚群分布组织中的分布。此外，原位杂交还是显示细胞亚群分布和动向及病原微生物存在方式和部位的一种重要技术。和动向及病原微生物存在方式和部位的一种重要技术。组织原位杂交组织原位杂交 （Tissue in situ hybridizationTissue in situ hybridization）第二十四页，讲稿共五十九
18、页哦 原位杂交中，标本的原位杂交中，标本的固定固定条件是影响杂交效率的重要因素，标本组条件是影响杂交效率的重要因素，标本组织蛋白质的织蛋白质的消化消化程度对探针进入细胞极为重要。去除蛋白的方法是，用程度对探针进入细胞极为重要。去除蛋白的方法是，用0.2mol/l HCl处理载玻片，用处理载玻片，用蛋白酶蛋白酶K消化，然后用不同浓度的消化，然后用不同浓度的乙醇乙醇脱脱水，原位杂交还是一种新技术，发展很快，在敏感性、特异性和稳水，原位杂交还是一种新技术，发展很快，在敏感性、特异性和稳定性上还需要进一步完善和提高定性上还需要进一步完善和提高 用于原位杂交的探针可以是单链或双链用于原位杂交的探针可以是
19、单链或双链DNA，也可以是，也可以是RNA探针。通常探针的长度以探针。通常探针的长度以100400nt为宜，过长则杂交效率减低。为宜，过长则杂交效率减低。最近研究结果表明，最近研究结果表明，寡核苷酸探针寡核苷酸探针（1630nt）能自由出入细菌和）能自由出入细菌和组织细胞壁，杂交效率明显高于长探针。因此，寡核苷酸探针和不对组织细胞壁，杂交效率明显高于长探针。因此，寡核苷酸探针和不对称称PCR标记的小标记的小DNA探针或体外转录标记的探针或体外转录标记的RNA探针是组织原位杂探针是组织原位杂交的优选探针。交的优选探针。第二十五页，讲稿共五十九页哦 (FISH)fluorescent in sit
20、u hybridization 第二十六页，讲稿共五十九页哦WESTERN BLOT第二十七页，讲稿共五十九页哦其基本过程为：其基本过程为：（1）首先做蛋白质的）首先做蛋白质的SDS-PAGE电泳电泳。（2）然后将凝胶中的蛋白质）然后将凝胶中的蛋白质电转印电转印到固相膜上。到固相膜上。（3）在膜上以相应的抗体进行）在膜上以相应的抗体进行抗原抗体反应抗原抗体反应。（4）显色。）显色。本方法结合了凝胶电泳分辨率高和免疫检测灵敏特异的特点本方法结合了凝胶电泳分辨率高和免疫检测灵敏特异的特点，能从混杂的蛋白质中检测出特定的抗原。，能从混杂的蛋白质中检测出特定的抗原。第二十八页，讲稿共五十九页哦第二十九
21、页，讲稿共五十九页哦转膜Protein HRPDABH2O21Ab2Ab洗膜、显色第三十页，讲稿共五十九页哦mRNA=messenger RNAECD=extracellular domainELISA=enzyme-linked immunosorbent assayIHC=immunohistochemistryCISH=chromogenic in situ hybridizationPCR=polymerase chain reactionFISH=fluorescence in situ hybridization第三十一页，讲稿共五十九页哦1.Extract DNA from ce
22、ll Extract RNA from cell Extract protein from cell Southern blot Northern blot Western blot2.Cut with restriction enzyme 3.Run on gel(usually agarose)Run on gel(usually agarose)Run on gel(usually poly-acrylamide calledPAGE)4.Denature with alkali Denature with formaldahyde Denature with SDS5.Transfer
23、 by capillary action by capillary action by electrophoresis6.Block with excess DNA Block with excess RNA Block with excess protein7.Hybridize with labeled Hybridize with labeled Hybridize with labeled DNA probe DNA probe Antibody probe8.Wash off unbound probe9.Autoradiograph Autoradiograph Autoradio
24、graph or develop with chromogenic substrate第三十二页，讲稿共五十九页哦分子杂交技术分子杂交技术Hybridization technique （在在DNA与与DNA，DNA与与RNA之间，存在着碱基互补的关系，在加热之间，存在着碱基互补的关系，在加热或加入变性剂等条件下，或加入变性剂等条件下，DNA双链之间的氢键被破坏，双链解开成为单双链之间的氢键被破坏，双链解开成为单链，此时加入有互补序列的链，此时加入有互补序列的DNA或或RNA，在一定离子强度和温度下保温，则加，在一定离子强度和温度下保温，则加入的入的DNA或或RNA可与模板链形成稳定的可与模板
25、链形成稳定的DNA-DNA或或DNA-RNA异源双链，此异源双链，此过程称为杂交。）过程称为杂交。）核酸分子杂交的基础不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链 第三十三页，讲稿共五十九页哦碱基碱基碱基碱基糖糖磷酸基磷酸基第三十四页，讲稿共五十九页哦碱基互补第三十五页，讲稿共五十九页哦核酸分子杂交的原理核酸分子杂交的原理第三十六页，讲稿共五十九页哦分子杂交技术的发展分子杂交技术的发展1961年，Hall等探针与靶序列在溶液中杂交1962年，Bolton等设计DNA-琼脂技术60年代中期Nygaard 等研究应用硝酸纤维素（NC）膜70年代到80年
26、代早期，随分子生物学技术进展，核酸杂交技术有了突破性进展应用：目前核酸杂交技术与其它技术相结合广泛应目前核酸杂交技术与其它技术相结合广泛应用于特定基因的表达、基因定位、遗传病的检测、组用于特定基因的表达、基因定位、遗传病的检测、组织病理学的研究、生物分类方面。织病理学的研究、生物分类方面。第三十七页，讲稿共五十九页哦lDNA探针探针 lcDNA探针探针lRNA探针探针 l寡核苷酸探针寡核苷酸探针探针的分类探针的分类根据核酸分子探针的来源及其性质可以分为根据核酸分子探针的来源及其性质可以分为第三十八页，讲稿共五十九页哦这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方这类探针多克隆在质粒
27、载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。法简便。DNA探针不易降解（相对探针不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制而言），一般能有效抑制DNA酶活性酶活性。DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法，物法，PCR标记法等，能用于同位素和非同位素标记。标记法等，能用于同位素和非同位素标记。lcDNAcDNA探针探针 用这种技术获得的用这种技术获得的DNADNA探针不含有内含子序列。因此尤其适用于基因探针不含有内含子序列。因此尤其适用于基因表达的检测。表达的检测。DNA探针探针（包括（包括cDNA探针
28、）探针）的主要优点有下面三点：的主要优点有下面三点：第三十九页，讲稿共五十九页哦RNARNA探针探针的主要优点有的主要优点有RNA/RNARNA/RNA和和RNA/DNARNA/DNA杂交体的稳定性较杂交体的稳定性较DNA/DNADNA/DNA杂交体的稳定性高，杂杂交体的稳定性高，杂交反应可以在更为严格的条件下进行（杂交温度可提高交反应可以在更为严格的条件下进行（杂交温度可提高1010 左右）左右），因而杂交的特异性更高。，因而杂交的特异性更高。单链单链RNARNA分子由于不存在互补双链的竞争性结合，其与待测核分子由于不存在互补双链的竞争性结合，其与待测核酸顺序杂交的效率较高。酸顺序杂交的效率
29、较高。RNARNA中不存在高度重复序列，因此非特异性杂交也较少。中不存在高度重复序列，因此非特异性杂交也较少。杂交后可用杂交后可用RnaseRnase将未杂交的游离探针消化掉，从而使本底降低。将未杂交的游离探针消化掉，从而使本底降低。mRNAmRNA中存在的多聚腺苷酸尾，有时会影响杂交的特异性，此缺点可以通过在杂交液中加入中存在的多聚腺苷酸尾，有时会影响杂交的特异性，此缺点可以通过在杂交液中加入polypoly（A)A)将待测核酸序列中可能存在的将待测核酸序列中可能存在的polypoly（dT)dT)或或polypoly（U)U)封闭而加以克服。封闭而加以克服。第四十页，讲稿共五十九页哦由于链
30、短，其序列复杂度低，分子量小，所以和等量靶位点完全杂由于链短，其序列复杂度低，分子量小，所以和等量靶位点完全杂交的时间比克隆探针短。交的时间比克隆探针短。寡核苷酸探针可识别靶序列内寡核苷酸探针可识别靶序列内1 1个碱基的变化，因为短探针中碱基的个碱基的变化，因为短探针中碱基的错配能大幅度地降低杂交体的错配能大幅度地降低杂交体的TmTm值。值。一次可大量合成寡核苷酸探针（一次可大量合成寡核苷酸探针（110mg），使得这种探针），使得这种探针价格低廉，与克隆探针一样，寡核苷酸探针能够用酶学或化价格低廉，与克隆探针一样，寡核苷酸探针能够用酶学或化学方法修饰以进行非放射性标记物的标记。尽管克隆探针较学
31、方法修饰以进行非放射性标记物的标记。尽管克隆探针较特异，但通过细心筛选序列和特异，但通过细心筛选序列和/或选择相对长的序列（或选择相对长的序列（30nt）亦）亦可设计出非常特异的寡核苷酸探针。最常用的寡核苷酸探针有可设计出非常特异的寡核苷酸探针。最常用的寡核苷酸探针有1840个碱基，目前的合成仪可有效地合成至少个碱基，目前的合成仪可有效地合成至少50个碱基的探针。个碱基的探针。下面是筛选寡核苷酸针的一些原则：下面是筛选寡核苷酸针的一些原则：第四十一页，讲稿共五十九页哦理想的寡核苷酸探针应具备的条件长1850nt,较长探针杂交时间较长，合成量低；较短探针特异性会差些碱基成分：GC含量为4060，
32、超出此范围则会增加非特异性杂交探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探针杂交的“发夹”状结构避免单一碱基的重复出现（不能多于4个），如GGGGG一旦选下某一序列符合上述标准，最好将该序列与核酸库中序列比较，探针序列应与含靶序列的核酸杂交，而与非靶区域的同源性不能超过70或有连续8个或更多碱基的同源，否则，该探针不能用第四十二页，讲稿共五十九页哦未知序列的基因探针未知序列的基因探针（可以从蛋白质多肽序列推测寡核苷酸序列）（可以从蛋白质多肽序列推测寡核苷酸序列）其遵循的原则有：其遵循的原则有：1）要尽量选择那些只有一种编码的氨基酸（如色氨酸）要尽量选择那些只有一种编码的氨基酸（如色氨酸UGG和甲
33、硫氨酸和甲硫氨酸AUG）的多肽作为合成寡核苷酸探针）的多肽作为合成寡核苷酸探针的参照。的参照。2）尽管同一氨基酸可由多种密码子编码，但其使用频率）尽管同一氨基酸可由多种密码子编码，但其使用频率是不一样的，因此应优先考虑使用频率最高的密码子。是不一样的，因此应优先考虑使用频率最高的密码子。第四十三页，讲稿共五十九页哦3）前一个氨基酸的密码子也会影响下一个氨基酸密码子的使用，在真核）前一个氨基酸的密码子也会影响下一个氨基酸密码子的使用，在真核基因中，极少有基因中，极少有5-CG-3序列出现。在密码子内部凡是存在序列出现。在密码子内部凡是存在CG序列的序列的密码子其使用频率也较低。在两个密码子间的情
34、况也是同样。密码子其使用频率也较低。在两个密码子间的情况也是同样。因此在设计寡核苷酸探针时，当两个相邻的氨基酸的最高频率因此在设计寡核苷酸探针时，当两个相邻的氨基酸的最高频率密码子相邻会导致密码子相邻会导致CG序列出现时，应将其中一个氨基酸的序列出现时，应将其中一个氨基酸的 密码子换为密码子换为次高频率密码子。通常是将前一个密码子次高频率密码子。通常是将前一个密码子NNC换为换为NNT。（。（甘氨酸甘氨酸GGC(GGA)和苏氨酸和苏氨酸ACC(ACA)除外除外）。）。4）参考同一基因家族的基因序列，对于密码子的正确选择也是有所帮助）参考同一基因家族的基因序列，对于密码子的正确选择也是有所帮助的
35、。的。5)为尽可能减少假阴性结果，可合成各种可能的寡核苷酸探针分为尽可能减少假阴性结果，可合成各种可能的寡核苷酸探针分别或混合进行探测。混合杂交探测时，由于各探针的（别或混合进行探测。混合杂交探测时，由于各探针的（G+C）%含含量不同，因此需分别在不同的温度下进行探测。量不同，因此需分别在不同的温度下进行探测。第四十四页，讲稿共五十九页哦人肿瘤坏死因子中第人肿瘤坏死因子中第104116位氨基酸的顺序：位氨基酸的顺序：glu谷谷-thr苏苏-pro脯脯-glu谷谷-gly甘甘-ala丙丙-glu谷谷-ala丙丙-lys赖赖-pro脯脯-trp色色-tyr酪酪-glu谷谷1）选择最高频密码子，碱基
36、序列为：）选择最高频密码子，碱基序列为：2）修改）修改CG序列，碱基序列为：序列，碱基序列为：5-GAG ACC CCT GAG GGA GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG-3实际序列（实际序列（95%）：）：5-GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG-35-GAG ACC CCC GAG GGC GCC GAG GCC AAG CCC TGG TAC GAG-3第四十五页，讲稿共五十九页哦缺口平移法缺口平移法(nick translation)DNA快速末端标记随机引物法聚合酶链式反应法化学标记技术:
37、直接与核酸进行化学反应而连接在核酸上第四十六页，讲稿共五十九页哦缺口平移缺口平移该技术由该技术由Kelly等于等于1970年创立。其原理是首先用年创立。其原理是首先用DNA酶酶在双链在双链DNA探针分子的一条链上制造一些缺口（探针分子的一条链上制造一些缺口（nick）,缺缺口处会形成口处会形成3羟基末端，这时再在大肠杆菌羟基末端，这时再在大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I的催化下将核苷酸残基加在的催化下将核苷酸残基加在3羟基上，同时，根据大肠杆羟基上，同时，根据大肠杆菌酶菌酶DNA聚合酶聚合酶I的的53核酸外切酶活性，此酶将缺口核酸外切酶活性，此酶将缺口5侧核侧核苷酸依次切除。其结果是在缺口平移。根
38、据这个原理，如果用苷酸依次切除。其结果是在缺口平移。根据这个原理，如果用高强度的放射性核苷酸（通常为高强度的放射性核苷酸（通常为-32PdATP）置换先前存）置换先前存在的核苷酸。用缺口平移法标记的在的核苷酸。用缺口平移法标记的DNA探针能满足大多探针能满足大多数杂交要求。数杂交要求。第四十七页，讲稿共五十九页哦第四十八页，讲稿共五十九页哦第四十九页，讲稿共五十九页哦随机引物延伸随机引物延伸 这是以单链这是以单链DNADNA或或RNARNA模板合成高比活性模板合成高比活性32P32P标记探针所标记探针所选用的方法。原理是使长选用的方法。原理是使长6 68nt8nt的寡核苷酸片段与变性的的寡核苷
39、酸片段与变性的DNADNA或或RNARNA模板退火，在模板退火，在DNADNA聚合酶聚合酶I I或反转录酶的作用下，以每一或反转录酶的作用下，以每一个退火到模板上的寡核苷酸片段为引物引发个退火到模板上的寡核苷酸片段为引物引发DNADNA链的合成，在链的合成，在反应时将反应时将-32PdNTP-32PdNTP掺入合成链，即得到标记。变性掺入合成链，即得到标记。变性处理后，新合成链（探针片段）与模板解离，即得到无处理后，新合成链（探针片段）与模板解离，即得到无数各种大小的探针数各种大小的探针DNADNA。因为所用寡核苷酸片段很短，在低。因为所用寡核苷酸片段很短，在低温条件下可与模板温条件下可与模板
40、DNADNA随机发生退火反应，因此被称为随机随机发生退火反应，因此被称为随机引物（引物（random primerrandom primer）。这种随机引物可用小牛胸腺）。这种随机引物可用小牛胸腺DNADNA或或鱼精鱼精DNADNA制备。制备。第五十页，讲稿共五十九页哦第五十一页，讲稿共五十九页哦第五十二页，讲稿共五十九页哦聚合酶链反应聚合酶链反应 PCRPCR技术有许多重要用途，其中之一便是可用来标记高比活技术有许多重要用途，其中之一便是可用来标记高比活性性DNADNA探针。探针。PCRPCR技术具有很高的特异性，可在技术具有很高的特异性，可在1 12h2h之内之内大量合成探针大量合成探针D
41、NADNA片段，如果在底物中加入片段，如果在底物中加入-32PdNTP-32PdNTP或或其它标记的其它标记的dNTPdNTP，则探针，则探针DNADNA合成过程中可得到很好的标合成过程中可得到很好的标记，标记物的掺入率可高达记，标记物的掺入率可高达70%70%80%80%。因此，。因此，PCRPCR标记技术标记技术特别适用于大规模检测和非放射性标记。该法的缺点是要合成一特别适用于大规模检测和非放射性标记。该法的缺点是要合成一对特异性对特异性PCRPCR引物。使用从探针引物。使用从探针DNADNA上制备的小片段作引物也上制备的小片段作引物也能取得较好的标记效果。能取得较好的标记效果。第五十三页
42、，讲稿共五十九页哦第五十四页，讲稿共五十九页哦探针标记物应具备的条件(探针（probe)是指能与特定的靶分子发生特异性结合特异性结合并能以特殊的方法被探知被探知的分子.)高度灵敏性标记物与探针的结合不影响碱基配对的特异性不影响探针分子的主要理化特性 esp.Tm值用酶促方法进行标记时酶的活性应不受影响检测应具有特异性 第五十五页，讲稿共五十九页哦标记物放射性同位素放射性同位素1）灵敏度极高，可以检测）灵敏度极高，可以检测10-1410-18 g 的物质。最适条件下，可的物质。最适条件下，可以测出样品中少于以测出样品中少于1000个分子的核酸含量。个分子的核酸含量。2）放射性核素与相应的元素具有
43、完全相同的化学性质，对酶放射性核素与相应的元素具有完全相同的化学性质，对酶促反应无任何影响，不会影响碱基配对的特异性、稳定性促反应无任何影响，不会影响碱基配对的特异性、稳定性和杂交性质。和杂交性质。3）特异性高，假阳性结果很少是由于放射性核素引起的。）特异性高，假阳性结果很少是由于放射性核素引起的。其缺点是：其缺点是：1）放射性污染。）放射性污染。2）过强的放射线可以造成核酸分子结构的破坏。）过强的放射线可以造成核酸分子结构的破坏。3）半衰期短，标记后立即使用（）半衰期短，标记后立即使用（32P/14.3d 35S/87.1d 3H/12.1y）。）。第五十六页，讲稿共五十九页哦常用的放射性同
44、位素有：常用的放射性同位素有：1）32P放射性强，穿透性较强，因此自显影所需时间短，灵敏度高。广泛放射性强，穿透性较强，因此自显影所需时间短，灵敏度高。广泛应用于各种滤膜杂交和液相杂交。应用于各种滤膜杂交和液相杂交。射线散射严重，分辨率不高射线散射严重，分辨率不高2）35S 可以取代磷酸分子上的一个氧原子，但分辨率高（可用于可以取代磷酸分子上的一个氧原子，但分辨率高（可用于核酸序列测定及细胞原位杂交）。半衰期较长。核酸序列测定及细胞原位杂交）。半衰期较长。灵敏度较灵敏度较P低低3）3H 散射极少，半衰期长散射极少，半衰期长 自显影时间较长自显影时间较长4）125I、131I 散射小，分辨率高，
45、显影时间比散射小，分辨率高，显影时间比H短很多。短很多。具有挥发性，吸入后蓄积具有挥发性，吸入后蓄积第五十七页，讲稿共五十九页哦 非放射性标记物有下述几类：金属如Hg，荧光物质如FITC；半抗原如地高辛；生物素；酶类如辣根过氧化物酶（HRP）。半乳糖苷酶或碱性磷酸酶（AP）等。不同的标记物，所标记探针的方法及检测方法也各异。非放射性同位素非放射性同位素 无放射性、稳定性好无放射性、稳定性好 灵敏度及特异性不高灵敏度及特异性不高第五十八页，讲稿共五十九页哦非放射性探针标记的显色体系APAP显色体系显色体系：APBCIP BCI-OH +NBT紫色BCIP：5溴-4氯-3吲哚磷酸，NBT：四氮唑蓝HRPHRP显色体系显色体系：HRPH2O2 DAB2NH2 棕色+2H+H2O ABCABC显色体系显色体系：DNA B+SA APDNA B SA-AP或DNA B+SA-BAPDNA B SA BAP 经上述两反应，把AP连接在DNA上以后，再进行AP酶显色。SA为Streptavidin（链霉亲合素），BAP为生物素化的磷酸酶，B为生物素（biotin），ABC为Avidin Biotin-Enzyme complex,即亲合素-生物素-酶复合物。B和SA还可以换成DIG和ANTIDIG 第五十九页，讲稿共五十九页哦