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1、光学显微镜的历史及基础知识光学显微镜optical microscope 利用光学原理把人眼所不能分辨的微小物体放大成像，以供人们提取微细结构信息的光学仪器。简史 早在公元前1 世纪，人们就已发现通过球形透明物体去观察微小物体时可以使其放大成像。后来逐渐对球形玻璃表面能使物体放大成像的规律有了认识。1590 年，荷兰和意大利的眼镜制造者已经造出类似显微镜的放大仪器。1610 年前后，意大利的伽利略和德国的J.开普勒在研究望远镜的同时，改变物镜和目镜之间的距离，得出合理的显微镜光路结构，当时的光学工匠遂纷纷从事显微镜的制造、推广和改进。17世纪中叶， 英国的 R.胡克和荷兰的A.van 列文胡克
2、都对显微镜的发展作出了卓越的贡献。1665 年前后， 胡克在显微镜中加入粗动和微动调焦机构、照明系统和承载标本片的工作台。这些部件经过不断改进，成为现代显微镜的基本组成部分。16731677 年期间， 列文胡克制成单组元放大镜式的高倍显微镜,其中 9 台保存至今。胡克和列文胡克利用自制的显微镜在动、植物机体微观结构的研究方面取得了杰出的成就。19 世纪，高质量消色差浸液物镜的出现使显微镜观察微细结构的能力大为提高。1827 年 G.B.阿米奇第一个采用浸液物镜。 19 世纪 70 年代，德国人E.阿贝奠定了显微镜成像的古典理论基础。这些都促进了显微镜制造和显微观察技术的迅速发展，并为 19 世
3、纪后半叶包括R.科赫、L.巴斯德等在内的生物学家和医学家发现细菌和微生物提供了有力的工具。在显微镜本身结构发展的同时，显微观察技术也在不断创新：1850 年出现了偏光显微术，1893 年出现了干涉显微术， 1935 年荷兰物理学家F.泽尔尼克创造了相衬显微术，他为此在1953 年被授予诺贝尔物理学奖金。古典的光学显微镜只是光学元件和精密机械元件的组合，它以人眼作为接收器来观察放大的像。后来在显微镜中加入了摄影装置，以感光胶片作为可以记录和存储的接收器。现代又普遍采用光电元件、电视摄象管和电荷耦合器等作为显微镜的接收器，配以微型电子计算机后构成完整的图象信息采集和处理系统。工作原理表面为曲面的玻
4、璃或其他透明材料制成的光学透镜可以使物体放大成像。光学显微镜就是利用这一原理把微小物体放大到人眼足以观察的尺寸。近代的光学显微镜通常采用两级放大，分别由物镜和目镜完成。被观察物体AB 位于物镜的前方,被物镜作第一级放大后成一倒立的实象A1B1 。然后此实像再被目镜作第二级放大，成一虚象A2B2, 人眼看到的就是虚像A2B2。显微镜的总放大倍率为显微镜总放大倍率物镜放大倍率 目镜放大倍率放大倍率是指直线尺寸的放大比而不是面积比。在用人眼直接观察的显微镜中,可以在实像面A1B1 处放置一块薄型平板玻璃片，其上刻有某种图案的线条，例如十字线。当实像A1B1 和这些刻线叠合在一起时,利用这些刻线就能对
5、物体进行瞄准定位或尺寸测量。这种放置在实像面处的薄型平板玻璃片通称分划板。在新型的以光电元件作为接收器的光学显微镜中，电视摄象管的靶面或其他光电元件的接收面就设置在实像面上。组成 光学显微镜由载物台、聚光照明系统、物镜、目镜和调焦机构组成。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页，共 6 页载物台用于承放被观察的物体。利用调焦旋钮可以驱动调焦机构使载物台作粗调和微调的升降运动，使被观察物体调焦清晰成象。它的上层可以在水平面内沿、方向作精密移动和在水平面内转动，把被观察的部位调放到视场中心。聚光照明系统由灯源和聚光镜构成。当被观察物体本
6、身不发光时，由外界光源给以照明。照明灯的光谱特性必须与显微镜的接收器的工作波段相适应。聚光镜的功能是使更多的光能集中到被观察的部位。物镜位于被观察物体附近实现第一级放大的镜头。在物镜转换器上同时装着几个不同放大倍率的物镜。转动转换器可让不同倍率的物镜进入工作光路。物镜放大倍率通常为5100 倍。物方视场直径 （即通过显微镜能看到的图像范围）约为11-20 毫米。物镜放大倍率越高则视场越小。物镜是显微镜中对成象质量优劣起决定性作用的光学元件。常用的有：能对两种颜色的光线校正色差的消色差物镜；质量更高的能对三种色光校正色差的复消色差物镜；能保证物镜的整个像面为平面以提高视场边缘成像质量的平像场物镜
7、。为了提高显微观察的分辨率，在高倍物镜中采用浸液物镜，即在物镜的下表面和标本片的上表面之间填充折射率为1.5 左右的液体。目镜位于人眼附近实现第二级放大的镜头。目镜放大倍率通常为520 倍，按能否放置分划板,可分成两类：不宜放置分划板的，如惠更斯型目镜。这是现代显微镜中常用的型式，优点是结构简单、价格低廉；缺点是由于成像质量的原因，不宜放置供瞄准定位或尺寸测量用的分划板。能放置分划板的，如凯尔纳型和对称型目镜，它们能克服上述目镜的缺点。按照能看到的视场大小，目镜又分为视场较小的普通目镜和视场较大的大视场目镜（或称广角目镜）两类。调焦机构载物台和物镜两者必须能沿物镜光轴方向作相对运动以实现调焦，
8、获得清晰的图像。 用高倍物镜工作时，容许的调焦范围往往小于微米，所以显微镜必须具备极为精密的微动调焦机构。显微镜放大倍率的极限显微镜放大倍率的极限即有效放大倍率。仪器的分辨率是指仪器提供被测对像微细结构信息的能力。分辨率越高则提供的信息越细致。显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距。根据衍射理论，显微物镜的分辨率为sigma=0.61lamda/N.sinU 1 式中 lamda 为所用光波的波长；N 为物体所在空间的折射率，物体在空气中时N=1；U 为孔径角，即从物点发出能进入物镜成像的光线锥的锥顶角的半角;NsinU 称为数值孔径。当波长一定时，分辨率取决于数值孔径的大小
9、。数值孔径越大则能分辨的结构越细，即分辨率越高。数值孔径是显微物镜的一个重要性能指标，通常与放大倍率一起标注在物镜镜筒外壳上，例如40 0.65 表示物镜的放大倍率为 40 倍，数值孔径为0.65。分辨率和放大倍率是两个不同的但又互有联系的概念。当选用的物镜数值孔径不够大，即分辨率不够高时，显微镜不能分清物体的微细结构，此时即使过度地增大放大倍率，得到的也只能是一个轮廓虽大但细节不清的图像。这种过度的放大倍率称为无效放大倍率。反之如果分辨率已满足要求而放大倍率不足，则显微镜虽已具备分辨的潜在能力，但因图像太小而仍然不能被人眼清晰视见。为了充分发挥显微镜的分辨能力，应使数值孔径与显微镜总放大倍率
10、合理匹配，以满足下列条件：500NsinU显微镜总放大倍率1000NsinU 2 在此范围内的放大倍率称为有效放大倍率。由于sinU 永远小于 1，物方空间折射率N 最高约为 1.5，NsinU不可能大于 1.5，故光学显微镜的分辨率受(1)式限制，具有一定的极限。有效放大倍率受上式限制,一般不超过 1500 倍。显微镜使用者应由所需分辨的最小尺寸按(1)式确定所需的数值孔径，选定物镜,然后按 (2)式选定总放大倍率和目镜放大倍率。提高分辨率的途径是：采用较短波长的光波或增大孔径角U 值，或是提高物体所在空间的折射率N，例如精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - -
11、 - - - - -第 2 页，共 6 页在物体所在空间填充折射率为1.5 的液体。以这种方式工作的物镜称为浸液物镜。而电子显微镜正是利用波长极短的特性，在提高分辨率方面取得重大突破的。聚光照明系统对显微观察的影响聚光照明系统是对显微镜成像性能有较大影响但又易于被使用者忽视的环节。它的功能是提供亮度足够且均匀的物面照明。聚光镜发来的光束应能保证充满物镜孔径角，否则就不能充分利用物镜所能达到的最高分辨率。为此目的，在聚光镜中设有类似照相物镜中的可以调节开孔大小的可变孔径光阑，用来调节照明光束孔径，以与物镜孔径角匹配。观察高反差物体时，宜使照明光束充满物镜的全孔径；对于低反差物体,宜使照明光束充满
12、物镜的2/3 孔径。在较完善的柯勒照明系统中，除可变孔径光阑外，还装有控制被照明视场大小的可变视场光阑，以保证被照明的物面范围与物镜所需的视场匹配。物面被照明的范围太小固然不行，过大则不仅多余，甚至有害，因为有效视场以外的多余的光线会在光学零件表面和镜筒内壁多次反射，最后作为杂散光到达像面，使图像的反差下降。改变照明方式，可以获得亮背景上的暗物点（称亮视场照明）和暗背景上的亮物点（称暗视场照明）等不同的观察方式，以便在不同情况下更好地发现和观察微细结构。分类 光学显微镜有多种分类方法：按使用目镜的数目可分为双目和单目显微镜；按图像是否有立体感可分为立体视觉和非立体视觉显微镜；按观察对像可分为生
13、物和金相显微镜等；按光学原理可分为偏光、相衬和微差干涉对比显微镜等；按光源类型可分为普通光、荧光、红外光和激光显微镜等；按接收器类型可分为目视、摄影和电视显微镜等。常用的显微镜有双目体视显微镜、金相显微镜、偏光显微镜、紫外荧光显微镜等。双目体视显微镜利用双通道光路为左右两眼提供一个具有立体感的图像。它实质上是两个单镜筒显微镜并列放置，两个镜筒的光轴构成相当于人们用双目观察一个物体时所形成的视角，以此形成三维空间的立体视觉图像。双目体视显微镜在生物、医学领域广泛用于切片操作和显微外科手术；在工业中用于微小零件和集成电路的观测、装配、检查等工作。金相显微镜专门用于观察金属和矿物等不透明物体的金相组
14、织的显微镜。这些不透明物体无法在普通的透射光显微镜中观察，故金相和普通显微镜的主要差别在于前者以反射光，而后者以透射光照明。在金相显微镜中照明光束从物镜方向射到被观察物体表面，被物面反射后再返回物镜成像。这种反射照明方式也广泛用于集成电路硅片的检测工作。偏光显微镜用偏振光对物体进行观测的显微镜。它的工作原理是在普通显微镜的照明光路中加入起偏器，使照到物面上的照明光束变成具有单一偏振方向的偏振光。在物镜和目镜之间的成像光路中加入检偏器，它的偏振方向与起偏器的偏振方向互成90 。如果被观物体不改变入射照明光束的偏振状态，则出射光便被检偏器完全阻挡，不能形成图像； 如果被观物体改变入射光的偏振状态,
15、则有一部分光通过检偏器,提供某些原来在非偏振光中发现不了的图像信息。偏光显微镜在地质、生物、材料工程等领域中用于观测晶体双折射、晶轴方向和偏振面旋转。紫外荧光显微镜用紫外光激发荧光来进行观察的显微镜。某些标本在可见光中觉察不到结构细节，但经过染色处理，以紫外光照射时可因荧光作用而发射可见光，形成可见的图像。这类显微镜常用于生物学和医学中。相衬显微镜和微差干涉对比显微镜利用相位差和干涉原理来提高观察效果的显微镜。在普通显微镜中，图像的对比度是由于物体各部位对光的吸收率不等而造成的。但在某些细胞组织和金属结构中，各部位的吸收率差别太小，以致不能形成可觉察的对比度。对于这类物体往往需要进行染色处理（
16、对细胞组织）或酸腐蚀处理 (对金属 )以造成可见的对比差别。而这些处理过程可能引入人为的假像，从而歪曲原有特征的真实性。相衬法和微差干涉对比法就是为了避免这些缺点而发展起来的。当光波通过吸收率相等或相近的各精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页，共 6 页个部位时，吸收率可能没有差别，但通过各部位的光程差可能不等。相衬法和微差干涉对比法利用干涉效应把通常情况下人眼不可见的光程差转换成可见的亮暗差，形成可见的结构对比图像。这类显微镜广泛用于金属学、医学和集成电路制备工艺中。红外显微镜用红外光源照明和成像的显微镜。在显微镜的实像面处装入
17、红外变像管，把不可见的红外图像转换成可见图像。利用某些物体对红外光的透射或反射特性来观察在可见光中觉察不到的结构。这类显微镜用于赝品鉴别、硅晶片表面缺陷检测等。电视显微镜和电荷耦合器显微镜以电视摄像靶或电荷耦合器作为接收元件的显微镜。在显微镜的实像面处装入电视摄像靶或电荷耦合器取代人眼作为接收器，通过这些光电器件把光学图像转换成电信号的图像，然后对之进行尺寸检测、颗粒计数等工作。这类显微镜的主要优点是与计算机联用后便于实现检测和信息处理的自动化，应用于需要进行大量繁琐的检测工作的场合。扫描显微镜成像光束能相对于物面作扫描运动的显微镜显微镜使用者所关心的主要性能指标有两个:一是标志着提供信息的细
18、致程度的分辨率高低；二是标志着一次获取信息数量的被观视场大小。这两个指标一般是互相矛盾和制约的。在扫描显微镜中依靠缩小视场来保证物镜达到最高的分辨率，同时用光学或机械扫描的方法使成像光束相对于物面在较大视场范围内进行扫描，并用信息处理技术来获得合成的大面积图像信息。这类显微镜适用于需要高分辨率的大视场图像的观测传统的光学技术中，常常会受到光波的衍射限制（例如光学显微镜的分辨率）。可以证明，这种衍射限制本质上来源于量子力学中的测不准关系限制。对于给定频率的光子，当它在某个方向上的动量范围给定时，它的分辨率也就定了。事实上，当年量子力学的创始人之一的Heisenberg在给出测不准关系的物理解释时
19、，正式利用光波衍射现象造成的限制来进行举例说明的。然而，人类的心智总是不甘心停留的，人们终于想到了突破光波衍射极限以提高光学显微镜分别率的办法。从科学哲学上讲，这就是发挥虚数的实质性作用，在物理概念上从只使用实数推广到使用虚数；从物理上讲，属于从传统中那样使用实光子辐射场推广到使用非辐射的虚光子场（不在光子质壳上的光子都是虚光子），前者就是传统中的光学成像，后者则属于近场成像。产生电磁波的源都可以称为天线。天线产生辐射远场和非辐射近场，前者包括我们通常看到的一束光，它在真空中传播，幅度不会衰减；后者则随空间距离迅速衰减，主要局域于天线附近，属于局域性的电磁波，或者附在材料表面附近的“ 表面波
20、” 。事实上，任何材料表面附近（包括金属表面）都存在这种近场，远看是呈电中性，近看则存在电荷密度涨落。近场有材料内部自己产生的，也有通过外来光波照射材料产生的。比较常用的近场即是隐失场，它是随空间距离呈指数衰减的。例如截止波导内的电磁波，全内反射时沿材料表面传播的电磁波。后者作为近场是直接了当的，前者作为近场不少专业人士则是模糊的。其实可以利用镜像法证明，截止波导内的隐失场，等价于无穷长平行等间距排列的线天线阵产生的近场，天线间隔在截止波长以内，相邻天线相差为180 度。隐失场作为非辐射的近场，按照传统 QED 中似乎是不可量子化的，但实际上，它包含了电磁相互作用，可以量子化为有等效质量的虚光
21、子它属于一种元激发和准粒子。现在来说明一下隐失场如何可以突破衍射极限，实现光子的空间局域的: 对于给定频率 的光子，光子在某个方向的动量分量K 通常小于或等于这个频率，根据测不准原理，光子在这个方向上的位置不确定度不小于1/ （Planck常数置为 1） ，显然频率越高，位置不确定度越小，以这样的光子作为光学显微镜的工作光子时，分辨率将由这个位置不确定度所限制。这就是传统光学显微镜的分辨率极限。然而，如果把隐失近场作为光学显微镜的工作光子，隐失近场的光子某方向上的动量分量K 可以大于光子频率，使得光子在这个方向上的位置不确定度可以小于1/：1/K 1/ ，从而可以成百上千倍地提高分辨率。近场光
22、学显微镜比电子显微镜的好处在于，前者对被观察物理不产生损害，而且对被观察对象没有要求，而电子显微镜要求被观察物理物体具有导电性，还要求高真空等等。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页，共 6 页1/K 1/意味着光子的整个波数矢量（或动量矢量）的长度（等于）小于波数矢量某个分量K 的长度。这怎么可能？难道整体比部分还小吗？是的，因为我们还有虚数，只要其他动量分量为虚数，被考察的动量分量幅度，就可以比整个动量矢量的幅度还大。正因为其他动量分量从实数变为虚数，原来的波动因子变为衰减因子，使得隐失波随距离成指数衰减。从原则上讲，整个凝聚
23、态物理都包含在QED 之中。但是尽管如此，QED 代替不了凝聚态物理。凝聚态物理有自己独立的描述语言和理论体系，还有自己独立的科学新发现，如分数霍尔现象。整个生物学也逃不出QED，但是生物学里每年照样有激动人心的新科学发现。诺贝尔生物学奖不等于诺贝尔物理学奖。同样道理，应用科学尽管逃不出理论物理，但是应用科学也有自己的一片天地。超高分辨率荧光成像技术(super-resolution optical imaging) 普 通 的 光 学 显 微 镜 将 我 们 的 人 眼 分 辨 率 提 高 了 几 百 倍 ，看 见 了 我 们 未 曾 看 见的 尺 度 。 随 着 生 命 科 学 的 发 展
24、 ， 人 们 需 要 看 见 细 胞 内 部 超 微 尺 度 的 生 命 活 动 的 现 象 。普 通 的 光 学 显 微 技 术 因 为 光 学 衍 射 极 限 的 限 制 而 不 能 满 足 这 一 需 求 ，而 各 种 电 子 显 微技 术 对 样 品 制 备 的 要 求 也 限 制 了 其 应 用 范 围 。近 几 年 来 ，人 们 在 光 学 显 微 研 究 中 的 一系 列 努 力 取 得 了 新 的 突 破 ，陆 续 发 明 了 一 些 可 以 超 越 衍 射 极 限 的 方 法 ，如 近 场 光 学 显微 镜 (NSOM)、受 激 发 射 耗 损 技 术 (STED) 、光 活
25、 化 定 位 显 微 镜 (PALM) 等 等 ，在 这 里 ，着重 介 绍 一 下 20XX 年 刚 刚 发 展 起 来 的 随 机 光 学 重 建 技 术 (STORM) 。一 般 说 来 ， 远 场 光 学 显 微 镜 包 括 共 聚 焦 和 双 光 子 显 微 镜 受 光 学 衍 射 极 限 的理 论 限 制 ，它 的 分 辨 尺 度 受 波 长 束 缚 ，因 此 人 们 无 法 看 清 小 于 200nm 的 生 命 结 构 与 现象 ，对 于 了 解 生 命 科 学 的 本 质 十 分 不 利 ，这 无 疑 成 为 了 生 物 光 学 成 像 的 最 大 障 碍 。近场 光 学 显
26、 微 镜 可 以 克 服 衍 射 限 制 ，但 局 限 是 不 能 够 探 测 样 品 内 部 的 结 构 ，而 且 其 探 针易 于 对 样 品 造 成 损 伤 。由 于 CCD等 光 学 检 测 器 的 灵 敏 度 的 提 高 ，人 们 在 近 十 几 年 已 成 功 地 进 行 了 许多 单 分 子 荧 光 实 验 。单 个 发 光 分 子 的 像 实 际 上 是 一 个 高 斯 形 态 的 点 扩 散 函 数 ，只 要 探测 到 的 光 子 数 足 够 多 ，由 计 算 机 算 出 这 高 斯 函 数 的 中 心 位 置 作 为 该 分 子 的 成 像 位 置 就可 以 有 足 够 高
27、 的 精 度 。因 此 ，单 分 子 荧 光 成 像 技 术 的 使 得 突 破 衍 射 极 限 的 观 察 限 制 有了 理 论 上 的 可 行 性 。生 物 荧 光 成 像 通 常 涉 及 大 量 分 子 。若 同 时 激 发 这 些 分 子 的 荧 光 ，它 们 的 点 扩散 函 数 将 互 相 叠 加 ，因 而 成 像 的 分 辨 率 将 受 到 经 典 衍 射 极 限 的 限 制 。随 机 光 学 重 建 以及 光 活 化 定 位 显 微 的 基 本 思 想 是 利 用 一 种 可 控 开 关 的 荧 光 物 质 ，这 种 荧 光 物 质 在 受 到不 同 波 长 的 光 子 激 励
28、 下 可 以 进 入 可 吸 收 激 发 光 子 发 光 的 正 常 状 态 或 不 能 发 光 的 暗 状态 。这 样 ，在 所 有 荧 光 分 子 都 进 入 暗 状 态 之 后 ，可 以 用 很 弱 的 激 励 光 随 机 地 将 小 部 分分 子“ 打 开 ”并 进 行 正 常 荧 光 成 像 测 量 。只 要 这 些 分 子 足 够 稀 少 ，其 相 应 的 点 扩 散 函数 就 不 会 重 叠 ，也 就 可 以 分 析 出 这 些 点 扩 散 函 数 的 中 心 位 置 ，从 而 得 到 每 个 分 子 的 精确 位 置 。在 此 之 后 用 另 一 种 激 励 光 将 这 些“
29、打 开 ”的 分 子“ 关 闭 ”或 漂 白 ，就 可 以 重新 随 机 地“ 打 开 ”并 定 位 另 外 一 小 部 分 分 子 。如 此 循 环 操 作 ，利 用 单 分 子 荧 光 成 像 的方 法“ 逐 个 ”记 录 每 个 荧 光 点 的 位 置 ，最 后 可 以 重 建 整 个 样 品 的 超 高 分 辨 率 荧 光 图 像 。这 种 方 法 问 世 时 间 不 长 ，尽 管 由 于 速 度 限 制 ，目 前 还 只 能 用 于 固 定 组 织 样 品 ，但 是 已经 在 显 微 的 清 晰 能 力 发 面 初 显 威 力 ， 但 它 的 分 辨 能 力 已 经 达 到 了 20
30、nm。在 随 机 光 学 重 建 显 微 镜 中 ，可 以 利 用 不 同 的 荧 光 物 质 来 实 现 多 色 成 像 ，还 可以 利 用 散 光 效 应 ，通 过 记 录 在 CCD上 的 点 扩 散 函 数 分 布 的 椭 圆 率 来 确 定 荧 光 的 轴 向 位置 ，进 而 实 现 随 机 光 学 重 建 的 三 维 成 像 。利 用 这 种 方 法 所 拍 摄 的 生 物 图 像 的 横 向 分 辨精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页，共 6 页能 力 达 到 了 20-30nm ，轴 向 分 辨 能 力 达 到 了 50-60nm 。随 着 荧 光 材 料 与 检 测 器 的 发 展 ，其 分 辨 率 还 会 不 断 提 高 ， 应 用 范 围 也 会 进 一 步 扩 大 。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页，共 6 页